脫脂牛乳體系中乳蛋白葡萄糖美拉德反應程度及產物功能性質研究

牟全生,楊 敏,王裕成,包鵬杰,雷敬敬,陳 浩,王海霞,楊繼濤

(甘肅農業大學理學院,農業資源化學與應用研究所,甘肅蘭州 730070)

牛乳是人類膳食中完美的食品之一,其天然營養的特性被消費者所青睞。牛乳含有人體所需的全部氨基酸、豐富的礦物質和維生素等。蛋白質是牛乳的重要營養成分,乳蛋白主要包括兩大類,酪蛋白和乳清蛋白,其含量比例約為4∶1[1]。酪蛋白及其制品有著較高的營養價值和良好的功能特性,可用作乳化劑、增稠劑和營養強化劑等,在食品工業、化學工業和醫藥工業等行業廣泛應用[2-4]。乳清蛋白是緊密的球狀蛋白,其功能特性廣泛,膽固醇、脂肪和乳糖含量低,易消化吸收,生物利用價值極高,常用作營養強化劑[5]。

蛋白質結構決定其功能性質,可通過物理、化學、酶法修飾改變蛋白質的結構,從而改變其性質?；瘜W修飾常用于改善蛋白質的功能性質,其主要方法有?；?、酯化、糖基化、磷酸化和烷基化等[6-7]。其中,以美拉德反應(Maillard reaction)為途徑的蛋白質糖基化修飾,近年來被眾多的研究者用于改善蛋白質的功能性質。美拉德反應是還原糖的羰基和蛋白質的ε-氨基之間的復雜反應,其產物具有特殊的香氣、顏色,并具有抗過敏、抑菌、抗氧化的特性[8-9]。

近年來,關于乳蛋白的糖基化產物性質研究主要集中在生物活性方面。眾多研究指出,酪蛋白-糖的美拉德反應產物(Maillard reaction products,MRPs)具有降血脂、抗炎、抗腫瘤及降血壓作用[10-14]。另外,糖基化修飾顯著改善了酪蛋白的抗氧化性,具體表現為DPPH自由基清除活性提高,還原力增強[12,15-16]。然而,以脫脂牛乳為體系的糖基化產物功能性質研究鮮有報道。

本文以脫脂乳為研究對象,以葡萄糖為糖基化試劑,采用水熱法進行美拉德反應,系統研究了脫脂牛乳在不同葡萄糖添加量下的反應程度,分析了糖基化產物的主要功能性質,以期為脫脂乳的糖基化修飾和糖基化乳蛋白的應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牛乳 采自甘肅省蘭州市安寧區營門村牛奶廠;葡萄糖 煙臺市雙雙化工有限公司;鄰苯二甲醛(OPA) 阿拉丁試劑有限公司;十二烷基硫酸鈉(SDS) 煙臺市雙雙化工有限公司;大豆油 陜西省咸陽市;四硼酸鈉 天津市化學試劑三廠;β-巰基乙醇 天津市凱信化學工業有限公司。

3K-15高速冷凍離心機 德國Sigma公司;JJ224BC型電子天平 常熟市雙杰測試儀器廠;PHS-3CpH計 上海三信儀器廠;TU-1901-雙光束紫外可見分光光度儀 北京普析通用儀器有限責任公司;真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;AD500S-H均質機 上海昂尼儀器儀表有限公司;Bettersize 2000激光粒度儀 丹東百特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫脂乳制備 取新鮮牛乳經3層紗布過濾除雜后,在25 ℃、4000 r/min的條件下離心20 min,除去上層脂肪,得到下層脫脂乳;加入0.02%(w/v)疊氮化鈉,防止微生物生長,并在4 ℃下保存備用。

1.2.2 脫脂乳-葡萄糖美拉德反應物制備 移取100 mL脫脂乳于水熱反應釜中,用1 mol/L NaOH將溶液的pH調節至9.0,分別加入0、1、1.5、3、6、9 g葡萄糖,攪拌均勻后在100 ℃下加熱3 h。結束后,將樣品立即置于冷水浴中冷卻。反應后的脫脂乳-葡萄糖混合物即為美拉德反應產物。取適量反應產物,用于糖基化程度測定;將剩余反應產物在4 ℃下采用蒸餾水透析(分子截留量為1.0 kDa)48 h,并冷凍干燥,備用。

1.2.3 糖基化程度測定 根據文獻[12]方法,取400 μL反應后的樣品,用pH7.0磷酸鹽緩沖液稀釋18倍,取100 μL稀釋后的樣品與3 mL鄰苯二甲醛試劑混勻,室溫下暗室放置5 min,以3 mL鄰苯二甲醛試劑與100 μL蒸餾水的混合液為參比,采用紫外-可見分光光度計在340 nm測定吸光值,計算糖基化程度,公式如下:

糖基化程度(%)=(A0-A)×100/A0

式中,A0和A分別為反應前和反應后的樣品340 nm下的吸光值。

1.2.4 體系pH測定 采用pH計測定反應結束后體系的pH[17]。

1.2.5 中間產物和褐變程度測定 參考文獻[18]方法,準確移取20 μL反應后的溶液,用蒸餾水稀釋360倍,采用紫外-可見分光光度計在294 nm下測定吸光值,表示中間產物含量;準確移取200 μL反應后的溶液,用蒸餾水稀釋36倍,采用紫外-可見分光光度計在420 nm下測定吸光值,表示褐變程度。

1.2.6 酪蛋白粒徑測定 將反應后的樣品適度稀釋后采用激光粒度儀測定樣品中酪蛋白膠束粒徑(D43),泵速1800 r/min,顆粒折射率1.46,分散劑折射率1.33,吸收參數0. 001,測定3次,取平均值。

1.2.7 乳化性及乳化穩定性測定 參考文獻[19]方法,準確稱取凍干后的樣品0.2 g,用0.2 mol/L pH7.0磷酸緩沖液定容至100 mL(濃度為2 mg/mL);取24 mL稀釋液與8 mL大豆油混合,10000 r/min轉速下高速分散處理1 min形成均一的乳狀液;分別在0、10和30 min時從底部取50 μL液體,并與5 mL質量濃度為1 g/L的SDS溶液混勻,采用紫外-可見分光光度計在500 nm處測定吸光值,以SDS溶液作參比。乳化活力指數和乳化穩定性計算公式如下。

乳化活力指數EAI(m2/g)=(2×2.303×A0×D)/[C×(1-θ)×φ×103]

乳化穩定指數ESI(%)=A10/30×100/A0

式中:D為稀釋倍數(100);C為乳狀液形成前溶液中蛋白質的濃度(2 g/mL);θ為乳狀液中油相體積分數(0.25);φ為比色皿直徑(1 cm);A0為0 min吸光值;A10/30為乳液靜置10或30 min的吸光值。

1.2.8 發泡性及泡沫穩定性的測定 參考文獻[19]方法,準確稱取1 g 凍干后的樣品,用0.2 mol/L pH7.0磷酸緩沖液溶解定容至100 mL,取30 mL樣品溶液置于50 mL燒杯中,于10000 r/min均質1 min。分別于均質后0、5、10、30 min讀取泡沫體積。

發泡性(%)=(V0/Va)×100

泡沫穩定性(%)=(Vi/V0)×100

式中:V0為均質后0 min時泡沫體積;Vi為分別表示放置5、10、30 min時的泡沫體積;Va為均質前樣品溶液總體積。

1.2.9 吸油性的測定 參考文獻[19]方法,準確稱取0.5 g凍干后的樣品,加入5 mL大豆油于稱過質量的15 mL離心管中渦旋混合5 min,靜置2 h后于4000 r/min下離心30 min,將上清液輕輕倒出,稱量離心管和沉淀的質量。

吸油性(g油/g糖基化蛋白質)=離心后沉淀質量/MRPs初始質量

1.3 數據處理

各組數據均為3次實驗的平均值±標準偏差,采用SPSS 18.0(SPSS Inc.,USA)進行顯著性分析,采用Origin 8.5作圖。

2 結果與分析

2.1 脫脂乳-葡萄糖美拉德反應程度及體系pH分析

脫脂乳與葡萄糖的美拉德反應程度和體系pH變化如圖1所示。由圖1可知,隨著葡萄糖添加量的增加,脫脂乳中蛋白質的糖基化程度顯著增大(p<0.05);當葡萄糖添加量達到3 g/100 mL脫脂乳時,糖基化程度達到最大值,之后隨著葡萄糖添加量的增加而降低。在不添加葡萄糖的情況下,脫脂乳經加熱后糖基化程度為9.22%±1.28%,這是由于乳中含有的乳糖與乳蛋白發生了美拉德反應。乳蛋白糖基化程度較低與乳糖含量有關。當添加一定量的葡萄糖時,還原糖含量增大,從而有大量氨基被糖基化,糖基化程度隨糖添加量的增大而增大。另一方面,在加熱過程,脫脂乳中乳清蛋白變性并與酪蛋白共價結合,致使乳蛋白發生不可逆熱聚集[20],從而使游離氨基被包埋而大幅度減少。糖基化程度以游離氨基含量為依據,因此糖基化程度較高,且隨葡萄糖添加量的增大而顯著增加(p<0.05)。當葡萄糖含量大于3 g/100 mL脫脂乳時,大量的還原糖與乳蛋白相互作用,影響了酪蛋白膠束結構,抑制了膠束解離[21]或美拉德反應產物的熱聚集,使游離氨基含量增加,反應程度降低。有關乳蛋白糖基化反應的報道指出,蛋白質糖基化程度隨還原糖添加量的增加而增大,當糖添加量過高時,糖基化程度緩慢增加,甚至不再發生顯著變化[22],這與本文研究結論不一致,原因在于文獻所用原料是單一乳蛋白,而本研究采用脫脂乳。相比而言,脫脂乳體系復雜,添加葡萄糖且高溫長時間加熱時,體系中除了美拉德反應,還產生酪蛋白膠束的解離和聚集、乳清蛋白的自聚、乳清蛋白和酪蛋白的共價聚集、美拉德反應產物的相互聚集等,從而影響糖基化反應過程及反應程度。

就反應體系pH而言,與不添加葡萄糖體系相比,當乳體系中添加葡萄糖時,糖基化反應過程中生產小分子有機酸,使反應后體系pH迅速降低[16]。然而,隨著葡萄糖含量的增加,體系pH降低至6.9左右,不再發生顯著變化(圖1)。這是由于反應體系pH降低至接近中性時,美拉德反應受到抑制,因而生成的小分子酸含量變化不明顯。

圖1 葡萄糖添加量對脫脂乳糖基化程度和體系pH的影響Fig.1 Effects of glucose concentration on glycosylation degree and pH of skim milk-glucose system注:不同字母表示差異顯著(p<0.05);圖2～圖7同。

2.2 脫脂乳-葡萄糖美拉德反應中間產物和褐變程度分析

294 nm波長處吸光度主要用于反映蛋白質糖基化過程中產生的無色中間產物,如糖、醛和小分子酮等;吸光度越大,中間產物越多[14,18]。由圖2可以看出,隨著葡萄糖添加量的增加,中間產物含量先增加再降低,且變化幅度較小。當葡萄糖添加量增加到3 g/100 mL時,中間產物量達到最低值,之后顯著上升(p<0.05)。

圖2 葡萄糖添加量對脫脂乳-葡萄糖體系反應中間產物的影響Fig.2 Effect of glucose concentration on the amount of intermediate products of skim milk-glucose system

類黑素是美拉德反應終產物之一,其呈現褐色,在420 nm波長處具有較強的吸收,因此可用該波長下的吸光度表征褐變程度[14,23]。由圖3可知,不添加葡萄糖時,脫脂乳中的乳糖與酪蛋白發生了美拉德反應,產生少量類黑素。隨著葡萄糖添加量的增大,類黑素的產量降低,且變化不顯著(p<0.05)。當葡萄糖添加量增加到大于3 g/100 mL時,類黑素含量顯著上升(p<0.05)。

圖3 葡萄糖添加量對脫脂乳-葡萄糖美拉德反應褐變程度的影響Fig.3 Effect of glucose concentration on the browning intensity of skim milk-glucose system

類黑素是高級階段反應產物經聚合、異構等反應后形成的大分子含氮聚合體[16],其產量與中間產物的累積量有關。隨著葡萄糖添加量的增大,中間產物的量和類黑精產量變化趨勢基本一致。有研究指出,葡萄糖與氨基酸上的氨基反應生成的脫氧果糖基氨基酸復合物是美拉德反應的中間產物,該物質可進一步轉化為不同產物:一種途徑下轉化為1-脫氧葡萄糖醛酮和3-脫氧葡萄糖醛酮,然后進一步轉化為類黑素或小分子酸等;另一種途徑下轉化為丙酮醛等;上述兩種轉化途徑和轉化程度受到溫度、pH等多種因素的影響[24]。與脫脂乳相比,當添加葡萄糖1 g/100 mL時,體系美拉德反應程度增大,pH迅速降低(圖1),可見中間產物主要轉化為小分子酸,因此類黑素產量降低(圖3)。當葡萄糖添加量為1.5～3 g/100 mL時,體系糖基化程度繼續增大,pH低于7.0,說明中間產物主要轉化為小分子酸,還可能生成了丙酮醛等物質,因此中間產物累積量和類黑素產量變化不顯著。當葡萄糖添加量大于3 g/100 mL脫脂乳時,體系pH略低于6.9,說明隨著葡萄糖添加量的增大,中間產物首先轉化為小分子酸,降低了體系pH;當體系pH低于6.9時,弱酸性環境可能抑制了中間產物向小分子酸的轉化,使其主要轉化為類黑素,且出現累積,因此表現為中間產物和類黑素含量隨著糖添加量的增加而迅速增大。

有文獻指出,酪蛋白肽和葡萄糖美拉德反應中間產物含量隨葡萄糖添加量的增加而增大[22],與本文研究結論不一致,原因可能是參與反應的蛋白質不一致,乳體系成分多而復雜,體系成分間的相互作用,如礦物質與蛋白游離氨基的結合作用、大量葡萄糖與乳蛋白的相互作用等,都將影響美拉德反應途徑,具體影響機理和影響程度有待進步一研究。

2.3 脫脂乳-葡萄糖美拉德反應體系中酪蛋白粒徑分析

乳中酪蛋白以膠束態存在,其粒徑主要分布在100～200 nm之間[25]。脫脂乳-葡萄糖美拉德反應體系里酪蛋白膠束粒徑如圖4所示。脫脂乳經過水熱法加熱后,酪蛋白膠束平均粒徑為164 nm。加入葡萄糖后,酪蛋白膠束粒徑增大。當葡萄糖添加量小于3 g/100 mL脫脂乳時,酪蛋白膠束粒徑與未添加葡萄糖相比顯著增加(p<0.05)。結合糖基化程度可以看出,添加葡萄糖后脫脂乳的糖基化程度迅速增大,因此粒徑迅速增大;另外,高溫下乳蛋白糖基化產物可能發生熱聚集,致使粒徑增加。

圖4 脫脂乳-葡萄糖美拉德反應體系中酪蛋白膠束粒徑Fig.4 Particle sizes of casein micelles in skim milk-glucose Maillard reaction system

當葡萄糖添加量達到3 g/100 mL脫脂乳時,雖然糖基化程度達到最大值,但粒徑卻降低至未添加葡萄糖的水平。而且,在該添加量下,中間產物和類黑素的產量均為最低值。有文獻指出,當還原糖添加量較高時,可與酪蛋白膠束產生氫鍵等相互作用,其顯著抑制酪蛋白膠束的解離,而且阻止了膠束相互聚集[21]。由此推斷,該添加量下,糖基化后酪蛋白膠束的熱聚集被抑制,膠束形成較為致密的結構,游離氨基被包埋在膠束內部,所以糖基化程度較高,粒徑較小。之后,隨著葡萄糖添加量的進一步增加,類黑素產量迅速增大(圖3),所以體系中微粒的平均粒徑也隨之有所增大。

2.4 脫脂乳-葡萄糖美拉德反應產物的乳化性分析

蛋白質是雙親分子,能在油-水界面上形成吸附層,從而降低界面張力,因而具有乳化活性。脫脂乳-葡萄糖美拉德反應產物的乳化活性和乳化穩定性如圖5所示。由圖5A可以看出,與未添加葡萄糖的樣品相比,添加葡萄糖后,脫脂乳-葡萄糖美拉德反應產物的乳化活性顯著增大(p<0.05),但其隨糖添加量的增加而基本不變(p>0.05)。當糖添加量大于3 g/100 mL脫脂乳時,該體系的乳化活性接近未添加葡萄糖的水平(p>0.05)。

蛋白質的乳化穩定性是影響其應用范圍的另一個關鍵因素。乳化穩定性取決于其親水性和疏水性平衡,親水性過高或疏水性過高都將導致乳化穩定性較差[18]。由圖5B可知,隨著葡萄糖添加量的增加,產物10、30 min乳化穩定性在葡萄糖添加量為3 g/100 mL時顯著提高(p<0.05);除了葡萄糖添加量為3 g/100 mL脫脂乳以外,30 min乳化穩定性變化不顯著(p>0.05)。

圖5 葡萄糖添加量對酪蛋白-葡萄糖美拉德反應產物乳化活性和乳化穩定性的影響Fig.5 Effects of glucose concentration on the emulsifying activity and emulsion stability of skim milk-glucose Maillard reaction products注：A、B分別為脫脂乳-葡萄糖美拉德反應產物的乳化活性和乳化穩定性。

美拉德反應使蛋白質親水性增強,其在油相和水相界面可以更加有序緊密的排列,從而形成更為致密的蛋白膜,因此其乳化性得以提高[26]。但是,葡萄糖添加量過大時,生成大量中間產物和類黑精,這些物質本身不具備蛋白質的雙親性質,所以體系乳化活性降低。由此可見,適度糖基化修飾有利于改善乳蛋白的乳化活性和乳化穩定性,以葡萄糖添加量為3 g/100 mL脫脂乳時較為適宜。

2.5 脫脂乳-葡萄糖美拉德反應產物的發泡性分析

蛋白質在激烈攪拌的情況下可以迅速吸附到氣相和水相的界面,同時蛋白質分子能夠迅速適應環境而改變自身構象,重新在氣相與水相界面排列,形成有序的分子層或蛋白質膜[27]。如圖6A所示,隨著葡萄糖添加量的增加,脫脂乳體系美拉德反應產物的發泡性緩慢增大;當添加量達到3 g/100 mL時稍有降低,之后基本不再發生變化。就泡沫穩定性而言(圖6B),糖基化使脫脂乳體系10和30 min泡沫穩定顯著增加(p<0.05),但其并未隨葡萄糖添加量增加而顯著變化(p>0.05)。

圖6 葡萄糖添加量對酪蛋白-葡萄糖美拉德反應產物發泡性和泡沫穩定性的影響Fig.6 Effect of glucose concentration on the foaming capacity and foam stability of skim milk-glucose Maillard reaction products注：A、B分別為脫脂乳-葡萄糖美拉德反應產物的發泡性和泡沫穩定性。

泡沫穩定性與蛋白質流體力學半徑和分子量有關,還與帶電基團有關[28-29]。脫脂乳中蛋白質與葡萄糖的共價結合降低了氨基含量,引入了大量羥基,使蛋白質分子親水性增加,改變了蛋白質分子空間結構,從而改變了分子間的作用力,使得空氣-水界面的蛋白質膜厚度和硬度得到增加,進而提高了泡沫穩定性。由此可見,適度糖基化修飾可提高乳蛋白的發泡性能和泡沫穩定性。

2.6 脫脂乳-葡萄糖美拉德反應產物的吸油性分析

吸油性是蛋白質的另一重要功能性質,其主要依靠蛋白分子結構對油的物理攔截作用,蛋白質體積密度越小,吸油性越大;吸油性還與蛋白質疏水性、結構等有關[30]。如圖7所示,脫脂乳-葡萄糖美拉德反應產物吸油性隨糖濃度的增加呈減小趨勢。糖基化反應導致乳蛋白分子發生交聯和聚合,形成大分子聚合物,增加了蛋白質分子的體積密度,使其結構變得致密,因此對油分子的持有能力降低。所以,糖基化修飾不利于改善乳蛋白的吸油性。

圖7 葡萄糖添加量對酪蛋白-葡萄糖美拉德反應產物吸油性的影響Fig.7 Effect of glucose concentration on the oil absorption of skim milk-glucose Maillard reaction products

3 結論

以葡萄糖為還原糖,通過美拉德反應修飾脫脂乳中乳蛋白結構,發現在葡萄糖添加量為3 g/100 mL時,糖基化程度達到最大值,之后迅速降低;而中間產物和褐變程度均在該添加量下達到最低值,之后迅速上升。就反應體系pH而言,并未隨葡萄糖添加量的增加而顯著變化。糖基化反應后,酪蛋白膠束粒徑增加。

糖基化修飾可提高脫脂乳體系的乳化活性和乳化穩定性,當葡萄糖添加量為3 g/100 mL時,兩者均實現最大程度的改善。糖基化修飾雖然對脫脂乳中蛋白質的發泡性提高程度并不顯著,但其10和30 min泡沫穩定性顯著增加(p<0.05)。然而,糖基化修飾并不能改善乳蛋白的吸油性,反而使其降低。

綜上所述,可通過糖基化修飾改善乳體系的乳化性和發泡性,使其更利于工業化應用。