不同劑量人參莖葉總皂苷對阿司匹林大鼠體內藥動學的影響*

莫雨佳，薛宇濤，譚 麗，喻剛艷，董姊怡，張 琦，陸 洋，杜守穎

（北京中醫藥大學中藥學院，北京 100029）

心腦血管疾病是中老年人發病率和病死率最高的疾病之一。近年來，隨著口老齡化以及心腦血管疾病年輕化的發展趨勢，社會越來越關注心腦血管疾病的防治。阿司匹林已被證明在心腦血管疾病的一級預防和二級預防中是有效的，長期服用低劑量的阿司匹林（75～150mg）可以有效的防治多種心腦血管疾病[1-2]。臨床建議年齡在40～69歲的中老年人應該長期服用阿司匹林以預防和治療心腦血管疾病[3-4]。中藥人參具有大補元氣，復脈固脫，補脾益肺，生津養血，安神益智的功效，被普遍應用在中老年人的日常養生保健中。人參莖葉總皂苷（TGSL）是人參干燥莖葉經加工制成的總皂苷，臨床上多用于心陰虧虛、氣虛血瘀所導致的失眠、神經衰弱、缺血性中風、冠心病等疾病的輔助治療，常見制劑有益心寧神片、血栓心脈寧、參芍膠囊、麝香通心滴丸。人參與阿司匹林均為中老年人日常生活中保健預防的常用藥，然而關于二者聯用藥物相互作用的研究較少，臨床上通過人參莖葉總皂苷制劑與阿司匹林聯用已達到改善阿司匹林抵抗或增強阿司匹林療效的目的[5-6]。本實驗室前期已證明三七總皂苷、紅參水煎液等會提高阿司匹林在體內的生物利用度[7-8]，證明兩種藥物聯用會起到一定的藥物相互作用，然而由于不同人參保健食品含量的差異以及人們用藥量、用藥次數的差異，導致二者聯用的影響并不清楚。

由于阿司匹林在體內會快速水解代謝為水楊酸，不易檢測，相關研究往往選擇其代謝產物水楊酸為指標成分進行分析，本實驗以人參莖葉總皂苷與阿司匹林的聯用為研究對象，通過對比單次服用不同劑量以及多次服用人參莖葉總皂苷對阿司匹林代謝產物水楊酸在大鼠體內的藥動學影響，研究人參與阿司匹林聯用的劑量相關性，為中老年人日常用藥提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 日本島津高效液相色譜儀（LC-20AD泵，SIL-20A自動進樣系統，SPD-M20A二極管陣列檢測器，DGU-20A在線脫氣系統，LC solution色譜工作站）；賽多利斯BSA 224S電子分析天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司）；G20型醫用離心機（北京白洋醫療器械有限公司）。

1.2 試劑 阿司匹林（批號：A201610786，購買于華陰市錦前程藥業有限公司）；人參莖葉總皂苷（批號：FY1531S0906，購買于南通飛宇生物科技有限公司）；水楊酸對照品（批號：100106-201605，含量以99.3%計，購買于中國食品藥品檢定研究院）；羧甲基纖維素鈉（批號：20131022，購買于國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈（色譜級）；磷酸（色譜級）；水（購買于杭州娃哈哈集團有限公司）。

1.3 實驗動物 SD大鼠30只，SPF級，雄性，體質量（200±20）g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 KromasilC18色譜柱（4.6mm×150mm，5μm），以乙腈-0.1%磷酸水（40∶60）為流動相，柱溫為30℃，流速為1.0mL/min，檢測波長為303 nm，進樣量10μL/20μL。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取水楊酸對照品4.93mg于10mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度線，配制成濃度為493.00μg/mL的水楊酸對照品溶液，分別用乙腈將其稀釋為濃度為4.93、9.86、19.72、49.30、98.60、197.20 μg/mL 的水楊酸對照品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察 分別取空白血漿、給藥后動物血漿100μL，加200μL乙腈渦旋混勻，6 000 r/min離心10min，取上清液進樣，并與水楊酸對照品溶液對比進行專屬性考察，實驗結果如圖1所示，大鼠血漿中水楊酸的保留時間為4.5min，且空白血漿中內源性物質及其他成分對其無干擾，色譜條件專屬性強。

圖1 大鼠血漿中水楊酸的色譜圖專屬性Fig.1 Chromatogram specificity of salicylic acid in rat plasma

2.3.2 線性關系考察 精密移取不同濃度的水楊酸對照品溶液10μL于0.5mL離心管中，加100μL空白血漿渦旋混勻，得到血藥濃度為0.49、0.99、1.97、4.93、9，86、19.72、49.30 μg/mL 的血漿標準溶液，加190μL乙腈渦旋混勻，6000 r/min離心10min，取上清液進樣；以水楊酸的峰面積（Y）為縱坐標，以水楊酸的血藥濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，結果表明，水楊酸血藥濃度在0.49～98.60μg/mL內線性關系良好，其方程為Y=10.68X+2.58，r2=0.999 9，其最低定量限和最低檢測限分別為0.49μg/mL和0.20μg/mL。

2.3.3 準確度考察 分別精密移取9.86（低）、49.30（中）、197.20（高）μg/mL 3種不同濃度的水楊酸對照品溶液各10μL于0.5mL離心管中，加100μL空白血漿渦旋混勻，加190μL乙腈渦旋混勻，6 000 r/min離心10min，取上清液進樣，每組平行6份；根據標準曲線分別計算低、中、高3組不同濃度的水楊酸血漿質控樣品的實測濃度，并與其理論濃度進行比較，計算出方法的準確度以及相對誤差（RE），具體結果如表1所示，其相對誤差均在±15%之內，表示方法的準確度良好。

2.3.4 精密度考察 按2.3.3項下方法制備低、中、高3種不同濃度的血漿質控樣品，連續實驗3 d，考察方法的日間精密度和日內精密度；根據標準曲線分別計算低、中、高3組不同濃度的水楊酸血漿質控樣品的實測濃度，并計算其相對標準偏差（RSD），具體結果如表1所示，其日間精密度和日內精密度均在±15%之內，表示方法的精密度良好。

表1 水楊酸HPLC方法的準確度和精密度考察結果Tab.1 Accuracy and precision of salicylic acid HPLC method

2.3.5 提取回收率考察 按2.3.3項下方法制備低、中、高3種不同濃度的血漿質控樣品，另外，分別精密移取低、中、高3種不同濃度的水楊酸對照品溶液各10μL于0.5mL離心管中，加入乙腈處理過后的血漿，制得相應濃度的對照樣品，每組6份；以水楊酸血漿質控樣品與對照樣品的峰面積之比計算提取回收率，結果如表2所示，3種濃度的平均提取回收率均＞70%，表示方法的提取回收率良好。

表2 水楊酸HPLC方法的提取回收率和穩定性考察結果Tab.2 Extraction recovery and stability of salicylic acid HPLCmethod

2.3.6 穩定性考擦 按2.3.3項下方法制備低、中、高3種不同濃度的血漿質控樣品，每組平行6份，進樣；將各組均分為2份，分別在4℃冰箱和樣品池放置24 h，考察樣品在不同溫度下放置的穩定性；通過對比放置前后血漿質控樣品的濃度變化，分別計算其RE與RSD值，結果如表2所示，樣品放置在不同溫度下的穩定性RE和RSD均在5%以內，表示樣品的穩定性良好。

2.4 藥代動力學研究方法 雄性SD大鼠隨機均分為阿司匹林單用組（Aspirin）、低劑量聯用組（LTGSL+Aspirin）、中劑量聯用組（MTGSL+Aspirin）、高劑量聯用組（HTGSL+Aspirin）以及長期用藥聯用組（Long-term Group），每組6只。實驗前禁食不禁水12 h，Aspirin組灌胃給予阿司匹林（12.5mg/kg），LTGSL+Aspirin組灌胃給予阿司匹林（12.5mg/kg）和人參莖葉總皂苷（20mg/kg），MTGSL+Aspirin組灌胃給予阿司匹林（12.5mg/kg）和人參莖葉總皂苷（40mg/kg），HTGSL+Aspirin組灌胃給予阿司匹林（12.5mg/kg）和人參莖葉總皂苷（80 mg/kg），Longterm Group組連續7 d灌胃給予人參莖葉總皂苷（40mg/kg）后，第8天灌胃給予阿司匹林（12.5mg/kg）和人參莖葉總皂苷（40mg/kg）。所有實驗組灌胃給藥后，分別于給藥后 0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10 h經眼眶取血0.5mL于0.5mL肝素鈉離心管中，6 000 r/min離心 10min，取血漿 100μL，加200μL乙腈渦旋混勻，6 000 r/min離心10 min，取上清液進樣。

圖2 不同劑量人參莖葉總皂苷與阿司匹林聯用的藥-時曲線圖（n=6）Fig.2 Drug-time curve of different dosesof ginseng stem and leaf totalsaponin combined w ith aspirin（n=6）

2.5 統計學處理 水楊酸的血藥濃度數據運用DAS 3.0（Drug And Statistics of Windows 3.0）統計軟件處理，采用非房室模型計算藥動學參數。運用SAS 8.0軟件對藥動學參數進行統計分析，實驗數據用均數±標準差表示，結果采用單因素方差分析，以P＜0.05視為有統計學意義。

2.6 藥代動力學結果 Aspirin、LTGSL+Aspirin、MTGSL+Aspirin、HTGSL+Aspirin四組的水楊酸藥-時曲線如圖 2 所示，Aspirin、MTGSL+Aspirin、Longterm Group 3組的水楊酸藥-時曲線如圖3所示；所有實驗組的藥動學參數如表3所示。從圖表可知，與 Aspirin組相比，低劑量（20 mg/kg）和中劑量（40mg/kg）的人參莖葉總皂苷對阿司匹林在大鼠體內藥動學無顯著影響，但高劑量（80 mg/kg）的人參莖葉總皂苷與阿司匹林聯用后，水楊酸在體內的 Cmax以及 AUC（0-t）顯著增加，V與 CL顯著降低（P＜0.05）；此外，雖然單次服用中劑量（40mg/kg）的人參莖葉總皂苷對阿司匹林的藥動學無顯著性影響，但通過長期給藥1周后，中劑量（40mg/kg）的人參莖葉總皂苷與阿司匹林聯用后，會使水楊酸在體內的 Cmax以及 AUC（0-t）顯著增加（P＜0.05）；其余組間參數并無顯著性影響。

3 討論

圖3 長期服用人參莖葉總皂苷后與阿司匹林聯用的藥-時曲線圖（n=6）Fig.3 Drug-time curve for long-term useofginseng stem and leaf totalsaponin combined w ith aspirin（n=6）

表3 不同實驗組的水楊酸藥動學參數Tab.3 Pharmacokinetic parametersof salicylic acid in differentexperimentalgroups

表3 不同實驗組的水楊酸藥動學參數Tab.3 Pharmacokinetic parametersof salicylic acid in differentexperimentalgroups

注：與 Aspirin 組相比，*P＜0.05；與 LTGSL+Aspirin 組相比，#P＜0.05；與 MTGSL+Aspirin 組相比，△P＜0.05。

參數 MRT（0-t）（h） t1/2（h） Tmax（h） V/F（L/kg） CL/F（L/h/kg） Cmax（μg/mL）Aspirin 4.14±0.41 3.88±0.90 1.17±0.62 0.29±0.06 0.06±0.03 29.16±5.84 LTGSL+Aspirin 4.13±0.35 3.68±0.81 1.46±1.26 0.25±0.05 0.05±0.01 32.33±6.16 MTGSL+Aspirin 4.28±0.23 4.58±0.84 1.75±0.43 0.29±0.05 0.05±0.02 31.54±6.61 HTGSL+Aspirin 4.25±0.24 5.15±0.96# 1.13±0.54 0.19±0.05*△ 0.03±0.01* 53.60±10.26*#△Long-term 4.35±0.20 5.02±0.60 1.38±0.65 0.22±0.02 0.03±0.00 40.23±5.60*AUC（0-t）（mg/L·h）199.11±49.61 217.05±49.76 225.24±64.14 368.17±84.52*289.66±18.38*動物數6 6 6 6 6

臨床上，阿司匹林已經被廣泛用于治療缺血性中風、心肌梗死等多種心腦血管疾病，阿司匹林屬于環氧化酶抑制劑類，其治療心腦血管疾病的機制主要是基于對環氧化酶的不可逆性抑制，使血小板內花生四烯酸無法轉化為環內過氧化物，最終抑制血小板的血栓素A2生成[9]，在臨床治療期間，為了起到更好的治療效果，阿司匹林也常與其他藥物聯合使用，如氯吡格雷等，近年來，研究人員也發現疏血通注射液、川芎嗪注射液[10]、三七總皂苷片[11]、復方丹參滴丸[12]等中成藥類亦可以加強阿司匹林抗血栓的功效。

雖然阿司匹林與中藥或者中成藥類制劑的合用越來越多，但其合用的機制機理研究卻相對較少，本實驗在前期研究的基礎上，進一步考察了不同劑量的人參總皂苷與阿司匹林在大鼠體內的相互作用。實驗參考市售人參莖葉總皂苷片的含量以及日服用量，設計了低（150 mg）、中（300 mg）、高（600mg）3個不同劑量，通過劑量折算給藥后，結果表明，相比于單用阿司匹林，低、中劑量的人參莖葉總皂苷對阿司匹林體內吸收、代謝等無顯著影響，但高劑量的人參莖葉總皂苷可以增加阿司匹林代謝物水楊酸在大鼠體內的血藥濃度，其AUC（0-t）、Cmax顯著增加，V顯著降低，CL顯著增加，其相對生物利用度是單用阿司匹林組的1.85倍，這表明人參莖葉總皂苷在一定的劑量下，可以增加阿司匹林在體內的血藥濃度，同時可以提高其在血漿中的分布，并降低機體對其的總消除速率，進而增加在其血藥濃度；同時，實驗結果也表明，雖然單次中劑量人參莖葉總皂苷對阿司匹林在大鼠體內的吸收代謝無顯著影響，但是長期服用人參莖葉總皂苷，亦可以促進阿司匹林在機體內的吸收，使其血藥濃度和相對生物利用度增加，這可能與人參莖葉總皂苷在體內的半衰期較長，長期服用人參莖葉總皂苷導致其在機體內血藥濃度維持在一定水平有關，也可能與人參莖葉總皂苷健脾益氣的功效有關。

實驗結果證實，人參莖葉總皂苷在一定的劑量下或在長期服用下，可以增加阿司匹林體內的生物利用度，其作用的機制可能表現為：1）在吸收方面Jacob等[13]提出皂苷類成分具有細胞膜滲透性，具體表現為通過溶解細胞膜表面的膽固醇進而影響細胞的轉運和滲透特性，實驗室前期也發現三七總皂苷可以促進阿司匹林和水楊酸的跨膜轉運，因此，在本實驗中，人參莖葉總皂苷可能是通過作為藥物的吸收增強劑，增加阿司匹林在體內的吸收。2）在代謝消除方面，有研究表明，細胞色素p450酶系（CYP2C9）應與阿司匹林的代謝有關[14]，而人參皂苷可以抑制CYP2C9的活性[15]，進而延緩水楊酸在機體內部代謝消除。此外，實驗室前期通過體外酶促實驗證明，三七總皂苷類成分可以抑制羧酸酯酶2的水解活性，而羧酸酯酶2是機體內參與阿司匹林水解代謝的I相藥物代謝酶[16]，本實驗中，人參莖葉總皂苷亦可能通過抑制羧酸酯酶2的活性，進一步延緩阿司匹林的水解及水楊酸的代謝消除。

本實驗通過考察不同劑量的人參莖葉總皂苷對阿司匹林在大鼠體內的藥動學影響，發現人參莖葉總皂苷可以促進阿司匹林在機體內的生物利用度，且存在一定的劑量相關性，臨床上阿司匹林的每日最佳服用劑量范圍為75～150mg，在預防治療心腦血管疾病的同時會帶來一定的不良反應[17]，研究表明，長期或者大劑量的服用阿司匹林會損傷人們的胃黏膜細胞，嚴重時可導致胃腸道出血等[18-20]，結合本實驗結果提示在中老年的日常生活用藥中，需要注意人參等皂苷類藥物與阿司匹林共同服用的相互作用，避免不必要的不良反應。