玉米皮多酚提取工藝優化及抗氧化性研究

徐彩紅 金渭荃 姜忠麗 閔鐘熳

(沈陽師范大學糧食學院,遼寧 沈陽 110034)

玉米皮是玉米淀粉深度加工的主要副產品,約占玉米干重的14%[1-2],營養成分十分豐富,一般含有3%～9%粗脂肪、3%～6%粗蛋白質、25%～40%淀粉、20%～25%纖維素、35%～40%半纖維素,此外,還含有膳食纖維、甾醇酯和總多酚等多種活性成分。 這些營養物質含量因玉米品種、品質、淀粉加工技術及生產工藝的不同而有所差異[3-5]。 玉米皮中膳食纖維和多酚等活性成分在預防和治療一些疾病及在保健食品領域發揮著十分重要的作用[6-7]。 我國玉米皮年產量超過200 萬t,主要用于飼料行業或者直接廢棄掉,有效利用率偏低[1]。 因此,推進玉米皮的基礎研究和開發應用具有重要的科學意義和經濟價值。

食源多酚具有抗氧化、抗炎、抗癌[8-9]等重要作用,因而一直是國內外食源功能性成分研究的熱點。谷物食用部分的多酚含量較少,大部分多酚集中于谷物的麩皮中[10],其多酚類物質受谷物的種類、加工方式等因素的影響而不同[11-12]。 目前,關于谷物源多酚生物有效性和生物活性方面的研究較少。 近年來,國內外對玉米皮活性成分的研究集中在玉米皮膳食纖維和多糖方面[13-14],對玉米皮多酚類化合物(total phenolic of maize bran,MTP)的組成、含量、生物活性等方面研究報道較少[15]。 因此,研究MTP 對拓寬玉米皮的產業鏈和開發功能性新產品等具有重要意義。 目前,國內外對MTP 的研究主要集中于玉米皮中阿魏酸、黃酮和黃色素3 種活性成分的提取,常用的提取方法有堿解法[16-18]、溶劑法[19-20]、微波協同酶法[21]和混合酶解法[22],但堿解法和溶劑法存在提取時間長,溶劑污染嚴重等問題。 而微波協同酶法采用微波系統纖維素酶水系統提取玉米皮黃色素,溶劑用量較少,提取率較高,對玉米皮功能性成分的提取具有一定的參考價值[15]。

木聚糖酶(xylanases,EC 3.2.1.8)是一類能夠水解木聚糖的酶系,因其具有優良的酶學性質、較強的催化活性和較高的熱穩定性,不僅被廣泛應用于紡織、造紙和飼料工業,在改善面制品品質、促進低聚木糖和膳食纖維的生產及釀酒等食品工業中也有著巨大的應用潛力[23]。 近年來,木聚糖酶在多糖、皂苷和多酚等生物活性成分提取方面的應用也越來越多[15,24],但尚未檢索到采用木聚糖酶單酶水系統法提取MTP 的報道。因此,本試驗采用中心組合(Central Composite Design,CCD)響應面分析法優化酶提MTP 的工藝,并進一步研究其抗氧化性,旨在為推動玉米皮的科學應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米皮(市售,產自吉林乾安地區)；沒食子酸(HPLC≥98%)、木聚糖酶(酶活力≥60 000 U·g-1),上海金穗生物科技有限公司；福林酚試劑(Foin-Ciocalteu 試劑),上海多烯生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-dipheny 1-2-picryl-hydrazyl,DPPH),梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；2,2-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS),(上海)貿易有限公司；檸檬酸、無水碳酸鈉(分析純),天津博迪精細化工股份有限公司；石油醚(沸程60 ～90℃,分析純),天津市富宇精細化工有限公司。

1.2 主要儀器

HY-2 型多用調速振蕩器,金壇市醫療儀器廠；SB25-12DTDN 超聲波清洗機,寧波新芝生物科技股份有限公司；Avanti JE 型高效離心機,貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司；T6 型分光光度計,北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米皮脫脂處理 粉碎粗玉米皮,過80 目篩,取一定量該玉米皮,加入4 倍質量體積比的石油醚,室溫震蕩24 h 后抽濾,60℃低溫烘干濾渣,即得脫脂玉米皮。 密封,4℃保存備用。

1.3.2 玉米皮多酚提取工藝 40℃預熱pH 值4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液,臨用前加入一定量的木聚糖酶混勻。 準確稱量2.0 g 脫脂玉米皮與上述溶液混均,超聲(500 W),80℃水浴滅酶2 min,粗提液離心,收集上清液定容至100 mL,測定多酚含量。

1.3.3 總多酚含量的測定 采用Foin-Ciocalteu 比色法[25-27]。 取系列濃度的沒食子酸標準品溶液0.50 mL于10 mL 棕色容量瓶中,加入1 mL Foin-Ciocalteu 試劑混勻,再加3 mL 8% Na2CO3溶液,定容后避光放置60 min。 以A760nm對沒食子酸質量濃度進行線性回歸,得標準曲線方程為：y= 0.068 9x+ 0.007 7,R2=0.999 3,線性范圍為1.12 ～8.96 mg·L-1。將稀釋至適量濃度待測樣品的A760nm值代入沒食子酸標準曲線方程,計算樣品多酚的沒食子酸當量。 參考文獻[27]的方法計算總多酚的提取量。

1.3.4 單因素試驗 參考文獻[27-28],以木聚糖酶添加量2.0%、超聲時間6 min、液料比40 mL·g-1、酶解溫度55℃為固定水平,考察各因素水平對MTP 提取量的影響。 其中,木聚糖酶添加量分別設為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,液料比分別設為10、20、30、40、50、60 mL·g-1,酶解溫度分別設為45、50、55、60、65℃,超聲(500 W)時間分別設為2、4、6、8、10、12 min。 每組試驗均重復3 次。

1.3.5 玉米皮多酚最佳提取工藝的確定 在單因素試驗結果的基礎上,以酶添加量、超聲時間、酶解溫度和液料比為考察因素,采用Design-Exper 8.0.6 軟件進行四因素五水平的CCD 響應面試驗設計,篩選超聲輔助酶法提取MTP 的最佳工藝參數。 響應面試驗因素水平編碼見表1。

表1 響應面試驗設計因素水平編碼表Table1 Design and factors of response surface experiment

1.3.6 MTP 提取物體外抗氧化活性研究

1.3.6.1 DPPH·清除能力的測定 參照文獻[29-30]的測定方法并略作修改。 將待測液稀釋至0.05～3.00 mg·L-1濃度范圍內,吸取該待測液2.0 mL,加入2.0 mL 0.2 mmol·L-1DPPH·溶液,渦旋30 s,室溫避光反應60 min,以無水乙醇調零,測定517 nm 波長處的吸光度(As)；再以2.0 mL 樣品待測液與等體積無水乙醇混合后測定吸光度(Ab)；再測定2.0 mL DPPH·溶液與等體積無水乙醇混合后測定吸光度(A0),按照公式計算MTP 對DPPH·清除率：

1.3.6.2 ABTS+·清除能力的測定參照文獻[29,31]的方法。 取25 mL 7 mmol·L-1ABTS+·儲備溶液與440 μL 140 mmol·L-1過硫酸鉀溶液混勻,室溫避光反應12 h,得ABTS+·溶液Ⅰ。臨用時以pH 值7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋ABTS+·溶液Ⅰ,至其在734 nm的吸光度為0.700 ± 0.02,得ABTS+·溶液Ⅱ。取4.0 mL ABTS+·溶液Ⅱ,加入40 μL 樣品并混勻,室溫避光反應6 min 后于734 nm 波長處測定吸光度值(As),按照公式計算MTP 對ABTS+·清除率：

1.4 數據分析

響應面設計和統計分析采用Design Expert 8.0.6軟件進行處理；抗氧化性試驗數據結果采用SPSS Statistics 17.0 進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲時間的確定 由圖1可知,固定超聲功率500 W,超聲時間在2～6 min 范圍時,MTP 的提取量增大,且與超聲時間呈顯著正相關(P＜0.01),此后MTP的提取量呈下降趨勢。 綜合考慮效率、環境等因素,選取超聲時間為6 min 進行后續試驗。

圖1 超聲時間對MTP 提取量的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction of MTP

2.1.2 酶解溫度的確定 由圖2可知,在45.0 ～55.0℃范圍內,隨著酶解溫度的升高,MTP 的提取量呈增加趨勢,當酶解溫度超過55.0℃后,MTP 提取量顯著降低(P＜0.05),這可能是因為過高的酶解溫度導致了多酚類物質的分解,故選取55℃為后續試驗的最佳酶解溫度。

圖2 酶解溫度對MTP 提取量的影響Fig.2 Effect of enzymolysis temperature on extraction of MTP

2.1.3 木聚糖酶添加量的確定 由圖3可知,木聚糖酶添加量對MTP 提取量有明顯影響。 酶添加量在0.5%～2.0%范圍內,MTP 提取量增加并達到最大,且MTP 提取量與木聚糖酶添加量呈顯著正相關(P＜0.01)。 當酶添加量大于2.0%后,MTP 提取量隨著酶添加量的增加而有所降低,這是因為當底物處于酶飽和狀態時,增加酶添加量不會使MTP 提取量增加。 因此,選擇1.0%～3.0%酶添加量做進一步優化研究。

圖3 木聚糖酶添加量對MTP 提取量的影響Fig.3 Effect of xylanase content on extraction of MTP

2.1.4 液料比的確定 由圖4可知,MTP 提取量隨著液料比的增大而增加,且與液料比呈顯著正相關(P＜0.01)；當液料比大于40 mL·g-1時,MTP 提取量逐漸降低(P＜0.01)。 液料比過小,MTP 提取量較小,提取不充分,而液料比過大,可能會降低提取效果。 因此,選擇液料比20～60 mL·g-1做進一步優化。

圖4 液料比對MTP 提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on extraction of MTP

2.2 玉米皮多酚提取工藝條件優化試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果

基于單因素試驗結果,以多酚提取量為響應值,對選取的4 個因素,進行5 水平的CCD 試驗設計。 響應面試驗結果見表2。

對表2數據進行多元回歸處理,得到二項式擬合的代碼方程為：Y=7.09+0.22X1+0.027X2+0.31X3+0.21X4+0.03X1X2+0.13X1X3-0.17X1X4-0.016X2X4-0.11X3X4-0.61X12-0.46X22-0.42X32-0.63X42。

回歸模型方差分析的結果見表3(P＜0.000 1)。由模型的R2=0.980 4 和可知,模型具有很好的擬合度；模型也具有很好的預測性；失擬項不顯著表明回歸方程對實際情況模擬度較高。 由各因素P值可知,對多酚提取量的影響極為顯著(P＜0.000 1),X1X3、X1X4和X3X4對多酚提取量的影響顯著(P＜0.05),影響大小順序為：酶添加量(X3)＞超聲時間(X1)＞液料比(X4)＞酶解溫度(X2)。 因素間交互作用的影響為：X1X4＞X1X3＞X3X4,而X1X2、X2X3和X2X4對多酚提取量的影響不顯著。

響應面有最高點,說明在所選范圍內存在極值；響應值對因素條件的改變越敏感表現為響應曲面坡度越陡峭[32-33]。 各因素交互作用越顯著表現為響應面在底面的投影圖(等高線圖)的形狀越接近橢圓或鞍形；圖形越趨于圓形則說明因素間的交互作用越不顯著[34]。 由圖5可知,交互項X1X3(圖5-B)、X1X4(圖5-C)和X3X4(圖5-F)的等高線圖均趨于橢圓形,說明以上交互項的交互作用均顯著；其他交互項的等高線圖趨于圓形,其交互作用不顯著,這與表3方差分析中回歸模型系數顯著性檢驗結果一致。

表2 響應面試驗設計與結果Table2 Design and results of central composite design

2.2.2 驗證試驗結果 根據所建立的模型預測得到最佳提取工藝條件為超聲時間6.51 min、酶解溫度54.70℃、酶加入量2.13%、液料比41.40 mL·g-1,此條件下,MTP 提取量的預測值為7.17 mg·g-1。 為驗證模型的可靠性和實用性,依據經濟和實際操作的可行性,確定最終試驗條件為超聲時間6.50 min、酶解溫度55℃、酶加入量2.10%、液料比41 mL·g-1,按此工藝進行3 次平行試驗,測得多酚的提取量為7.26 ± 0.15 mg·g-1,與理論預測值較接近,說明該回歸方程預測性良好。

表3 回歸模型方差分析表Table3 Analysis of variance of the regression model

2.3 MTP 提取物體外抗氧化活性研究結果

2.3.1 MTP 提取物對DPPH·的清除能力 由圖6可知,在0.05 ～3.00 mg·L-1濃度范圍內,MTP 提取物對DPPH·清除能力與其濃度呈顯著正相關關系(P＜0.01),當MTP 提取物濃度大于1.25 mg·L-1后,其對DPPH·的清除能力提高緩慢。根據IC50值可以確定清除自由基能力的強弱[30],MTP 提取物清除DPPH·的IC50值為0.48 mg·L-1,表明MTP 提取物具有很強的DPPH·清除能力。

2.3.2 MTP 提取物對ABTS+·的清除能力 由圖7可知,在0.05 ～6.00 mg·L-1濃度范圍內,MTP 提取物對ABTS+·清除能力隨著MTP 提取物濃度的增加而增強,其濃度與自由基清除率具有顯著正相關關系(P＜0.01)；MTP 提取物清除ABTS+·的IC50值為2.20 mg·L-1,表明MTP 提取物具有較強的ABTS+·清除能力。

3 討論

3.1 各因素對玉米皮多酚提取量的影響

本試驗選用超聲輔助木聚糖酶水解法提取MTP,在預試驗基礎上,固定超聲功率500 W,考察超聲時間、提取溫度、木聚糖酶添加量和液料比對玉米皮多酚提取量的影響。 結果表明,超聲具有使多酚類物質從玉米皮細胞壁中溶出的能力,但是超聲時間過長,可能引起多酚類物質的分解或氧化,導致多酚的提取量降低,因此,單因素試驗中確定最佳超聲時間為6 min,酶解溫度范圍(45.0～65.0℃)選擇木聚糖酶酶活最適溫度(40.0～60.0℃)附近,此溫度范圍內木聚糖酶均具有較高活力且酶活力相當,酶解溫度不會對多酚提取量產生較大影響[7]。 但酶解溫度大于木聚糖最適溫度(60℃)以后MTP 提取量會降低；酶與底物濃度在最適比時,將獲得滿意的提取效果,加酶量過小,MTP提取量偏低,加酶量過大,由于底物的飽和效應,也不會顯著增加MTP 提取量,反而導致浪費,經優化得到木聚糖酶的最適添加量為2.10%；液料比增加,多酚的提取量有所降低,其原因可能是隨著料液比的增加,溶劑體積增加使木聚糖酶濃度降低,酶解效果減弱,導致多酚提取量降低。

圖5 因素交互作用對多酚提取量的影響Fig.5 Effect of the interaction between factors on extraction of polyphenols from maize bran

3.2 MTP 提取物抗氧化活性分析

圖6 MTP 提取物濃度對DPPH·清除率的影響Fig.6 Effect of MTP extract concentration on DPPH·scavenging rate

圖7 MTP 提取物濃度對ABTS+·清除率的影響Fig.7 Effect of MTP extract concentration on ABTS+·scavenging rate

多酚的特性和抗氧化機理不同,單一類型的檢測方法不能反映出系統中所有物質的抗氧化情況,因此,組合不同檢測方法可以獲得系統中多種化合物的抗氧化響應信息[35-36]。 DPPH·和ABTS+·清除能力是體外抗氧化能力評價中廣泛采用的指標。這2 個指標均可采用分光光度計定量分析,操作簡單快捷,結果較為準確可靠。 DPPH·清除能力測試原理是DPPH·結構中含有一個孤對電子,當加入自由基清除劑時,該孤對電子被配對,深紫色的DPPH·被還原成黃色非自由基形式,其褪色程度與所接受的電子數量呈定量關系[27]。ABTS+·清除能力測試原理是在一定濃度范圍內,根據抗氧化劑提供的電子或氫原子可滅活ABTS+·,從而使其溶液顏色發生變化[28,30]。

不同抗氧化劑與DPPH·或ABTS+·反應的速率不同,反應到達平衡的時間也不同。 為了避免抗氧化性評價產生偏差,不能將反應時間固定在某一數值。 抗氧化劑與DPPH·或ABTS+·的反應濃度應適宜,過高或過低都會直接影響反應結果的準確性和可靠性。 因此,本試驗充分考察了MTP 測試濃度、反應時間等關鍵影響因素,最終確定DPPH·或ABTS+·清除率測定時,一定濃度MTP 提取物與DPPH·或ABTS+·試劑的加樣體積比分別為1 ∶1 和1 ∶100,反應時間分別為60 min 和6 min。 在本試驗研究濃度范圍內,MTP 對DPPH·和ABTS+·均具有較強的清除能力,且MTP 提取物濃度與自由基清除率均具有顯著的正相關關系(P＜0.01)。

谷物多酚分為結合型和游離型,兩種類型的多酚對自由基清除率不同,多酚對自由基清除率的貢獻率因谷物不同而有所差異[35]。 玉米粉多酚(包括藍玉米粉、紫玉米粉、花玉米粉等)具有較強的抗氧化能力和保護細胞免受氧化損傷的自由基抑制作用,但因玉米品種而異,其主要成分(原花青素、阿魏酸等)的含量也有所差異,導致其抗氧化能力存在差別[36]。 目前,國內外對MTP 的抗氧化性鮮有報道。 Inglett 等[7]對玉米皮(粒徑＞30 μm)經50%乙醇二次浸提后得到的MTP 進行抗氧化能力研究,其DPPH·清除能力為15.66 μmol Trolox·g-1。 以Trolox 為對照,本試驗提取的MTP 為結合型和游離型的混合型多酚,對DPPH·清除能力為46.50 μmol Trolox·g-1。 因試驗條件不同,很難從不同的體外抗氧化試驗研究結果直接比較化合物的抗氧化能力[7,35],但也可推測出本試驗采用的木聚糖酶水解法提取的MTP 較乙醇浸提法具有更好的抗氧化能力。

4 結論

本試驗采用超聲輔助酶法提取玉米皮多酚,基于單因素試驗考察不同因素對MTP 提取量影響的基礎上,通過響應面設計得到優化的提取工藝條件為：酶添加量2.10%、酶解溫度55℃、液料比41 mL·g-1、超聲時間6.50 min,此條件下MTP 提取量為7.26 ± 0.15 mg·g-1,與理論預測值(7.17 mg·g-1)較接近。 MTP 提取物對DPPH·和ABTS+·均具有較強的清除能力,且抗氧化活性與其濃度在一定范圍內有很好的量效關系,MTP 提取物IC50值分別為0.48、2.20 mg·L-1。綜上表明MTP 可作為潛在天然抗氧化劑應用于食品行業。