溫度和白消安對星點東方鲀成魚生殖細胞枯竭的影響

任玉芹 趙雅賢 周勤 夏連軍 商木強 姜秀鳳

摘?要：為了解高溫和白消安注射對星點東方鲀（Takifugu niphobles）成魚生殖細胞發生的影響，設置32 ℃高溫組、32 ℃高溫-白消安組和空白對照組，比較3組的生長、存活率以及生殖細胞凋亡情況。結果顯示，高溫-白消安組的體重、肥滿度顯著低于其他組（P<0.05），而全長與其他各組差異不顯著（P>0.05），各組的存活率均在90.9%以上。高溫-白消安組對生殖細胞的凋亡作用比高溫組更加明顯，卵巢基本看不到正常的生殖細胞，且有大量的吞噬作用造成的黃褐色沉積，生殖細胞凋亡造成的空白面積比例要顯著地高于高溫組（P<0.05）;精巢中生殖細胞凋亡的精小囊占總的精小囊的比例高達100.0%±0.0%，也顯著高于高溫組空泡精小囊占總的精小囊的比例（P<0.05）。得出結論：高溫-白消安組較高溫組更易誘導星點東方鲀內源生殖細胞凋亡，從而可制備出生殖細胞移植的適宜受體。

關鍵詞：星點東方鲀（Takifugu niphobles）;高溫;白消安;生殖細胞;移植

我國養殖河鲀魚的總產量已經達到5萬t以上。隨著2016年農業部有條件開放紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）和暗紋東方鲀兩個養殖品種的加工經營，將更大地促進河鲀養殖產業的發展。相對于細膩鮮美的魚肉，被稱為“白子”（又稱之為西施乳）的雄魚精巢更是價格十倍于魚肉的奢侈品。帶有‘白子的雄魚售價是雌魚的1.5～2倍，并且在當前的養殖模式下，全雄苗種還具有一定的生長優勢[1]。所以全雄化技術開發是河鲀養殖業界的共識。傳統的全雄苗種培育技術路線是：通過雌激素誘導基因雄魚性轉化為偽雌魚（XY），偽雌魚與正常雄魚交配生產超雄（YY），YY 超雄魚與正常雌魚（XX）交配生產的后代全部為雄魚（XY）。如果沒有性別分子標記而需要后代驗證時，整個研究周期要經過5代時間，即使借助分子標記，這個過程也要經過3代以上時間，對于河鲀養殖品種來說整個過程的完成要七年以上，嚴重阻礙了全雄魚苗種培育研究工作的開展。近年來魚類生殖細胞移植（Germ cell transplantation GCT）這一新興的生物技術研究的進展為我們提供了全新的思路[2]，選擇適宜的受體可大大加快性別選擇育種的進程。作為生殖細胞移植受體的前題條件是其生殖腺能夠支持供體的生殖細胞發育、增殖，同時滿足易養殖和易人工繁育的要求。

星點東方鲀（Takifugu niphobles）與紅鰭東方鲀同屬東方鲀屬，它們的種間遺傳距離很近，種間雜交后代存活并可育[3]。星點東方鲀最大生物學個體在50 g左右，僅為紅鰭東方鲀的1/150，性成熟期為一年，是十分適宜的河鲀生殖細胞移植受體魚。以成熟個體作為受體的必要條件是不存在內源生殖細胞發生，但是具有正常功能的支持細胞（Brinster，2003）小生境（Niche）[4]。在哺乳動物GCT實驗中，通常采用化療藥物處理[5-6]、放射線照射[7]和高溫[8]。目前在羅非魚（Oreochromis niloticus）[9]、銀漢魚（Odontesthes sp.）[10]和斑馬魚（Danio rerio）[11]的研究中，利用高溫和白消安注射消除內源生殖細胞制備生殖細胞移植受體，成功進行了生殖細胞移植實驗，并獲得源自供體的功能配子或后代。在高溫條件下培育紅鰭東方鲀苗種，可引起生殖細胞的退化和凋亡[12]，但是尚無高溫配合白消安注射誘導星點東方鲀成魚生殖細胞凋亡的實驗報道。本研究中，初步觀察了高溫和白消安注射對星點東方鲀成魚生殖細胞發生的影響，以期為下一步生殖細胞移植實驗提供適宜的受體。

1?材料與方法

1.1?實驗材料

實驗魚為2016年5-6月由北戴河金山嘴海域捕獲的星點東方鲀自然繁殖親魚。親魚收購后，全部養殖在北戴河中心實驗站良種場。實驗用魚在8月28日收容到試驗水槽中，逐步升溫，使各試驗水槽達到試驗要求溫度。

1.2?實驗方法

實驗起始時間為2016年9月2日，設置1個空白對照組和2個實驗組：空白對照組（自然水溫，17.5～24.6 ℃），32 ℃高溫組和32 ℃高溫-白消安注射組（分別記錄為：C、HT 和HTB）。每組為一個300 L玻璃鋼水槽，各收容體重20 g以上成魚22尾，實驗組由電加熱棒控溫水溫，流水培育，日流水量為4倍左右，每日投喂配合飼料兩次，吸污處理1次。

實驗開始前，全部實驗魚逐尾測量體重、體長，數據同歸為起始樣本S組。白消安在實驗開始后的d 1，d 14，d 28按30 mg/kg的劑量進行3次腹腔注射。注射前，用MS-222 （劑量100 mg·L-1）麻醉。最后一次注射5 d后完成全部實驗，整個實驗周期為33 d。實驗結束時，再次測量各組實驗魚體重、體長。實驗開始前和結束后各隨機取樣10尾，解剖采集性腺中部為樣本。性腺樣本用波恩氏液固定24 h后保存于體積分數為70% 的酒精中。樣品采用石蠟切片，經常規H.E.染色，在光學顯微鏡（ Olympus E-300 ）下觀察并拍照。

1.3?性腺組織學觀察

在組織樣中（雌雄樣n=3-5）做100左右的連續切片。卵巢發育分為Ⅰ-Ⅵ期;卵子發生時相分成卵原細胞期、卵黃發生前期、卵黃發生期、卵黃成熟期4個時相[13-16]。精巢發育分為Ⅰ-Ⅴ期;生殖細胞在發生上的順序依次為A型精原細胞、B型精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子6個時相[17-18]。組織形態學觀察參考Genten（2009）[19]。每個樣本選取5個典型的切片各拍攝30個數字圖片。卵巢性腺退化和生殖細胞凋亡的校準參照Majhi（2009）[20]計算方法稍作變動，使用Motic Images Plus 3.2 軟件截取一定面積計算空白無細胞的面積的比例。精巢性腺退化和生殖細胞凋亡的校準參照Lacerda（2006）[9]計算方法，統計空泡精小囊與正常精小囊的比例進行對比分析（圖1）。

1.4?數據處理

按照肥滿度=W（體重）×L-3（全長）公式計算每組的平均肥滿度。 根據組織學切片結果，統計每組生殖細胞凋亡的平均比例;利用單因素方差分析比較每個組別之間體重、全長、肥滿度和細胞凋亡比例是否存在顯著性差異。

2?結果

2.1?生長、成活率

所有處理組在試驗結束時，通過單因素方差分析和LSD多重比較各組生長情況見表1。全長與實驗開始前的全長相比基本沒有變化。對照組C體重表型值、肥滿度均顯著高于開始前和其他實驗組（P<0.05），高溫HT組體重表型值、肥滿度與開始前體重表型值沒有顯著性差異（P>0.05），而高溫-白消安HTB組體重表型值、肥滿度均顯著低于開始前和其他兩組（P<0.05）。高溫白消安HTB組有8尾存在表皮潰瘍現象，實驗結束時沒有死亡，但是實驗結束后第4天死亡2尾，成活率為90.9%。而空白對照組C和高溫組HT均無死亡現象。

注：數值為平均值±標準差。同列中有不同上標小寫字母者表示不同實驗水槽間差異顯著（P<0.05）。

2.2?溫度和白消安對卵巢發育的影響

在實驗開始前，雌魚卵巢為Ⅱ期（見封三圖1A-B），卵巢中以卵原細胞和卵黃發生前期卵母細胞為主。實驗結束時，性腺發育良好，為Ⅲ期卵巢，以卵黃發生期卵母細胞為主，有部分為卵黃發生前期卵母細胞，卵巢中見不到卵原細胞（見封三圖1C）;在放大圖中，可清晰看到卵膜和由扁平濾泡細胞組成的濾泡上皮（見封三圖1D）。實驗開始前樣本和對照組卵巢一樣正常發育，卵巢腔由于受到擠壓而縮小。32 ℃高溫明顯抑制了卵巢的發育，卵巢腔由于卵母細胞的萎縮而增大，大部分卵母細胞出現異常。卵黃發生前期卵母細胞由正常的噬堿性就成深藍黑色，而卵黃發生期細胞部分細胞核消失，部分卵母細胞還存在卵膜，但是所有的卵泡上皮都已潰散（見封三圖1E-F）。32℃高溫和白消安注射對生殖細胞的凋亡作用更加明顯，基本看不到正常的生殖細胞，并且有大量的黃褐色染色物存在，說明巨噬作用大量發生[10]。以放大圖為樣本計算卵巢切片截面（1 200 μm×800 μm）的無細胞空白面積比例。統計結果顯示（見封三圖2）：起始樣本S和對照C組中，空白面積主要為卵巢腔，所占比例分別為：38%±1.0%和4.1%±1.0%，兩者之間沒有顯著性差異（P>0.05）。高溫HT組和高溫-白消安HTB組的空白面積包括細胞碎片和巨噬作用殘體等，空白面積所占比例分別高達58.6%±1241%和75.8%±1024%，均顯著高于起始樣本S和空白對照C組的空白面積比例（P<005），而HTB組卵巢的空白面積所占比例又顯著地高于HT組（P<005）。

2.3?溫度和白消安對精巢發育的影響

在實驗開始前，雄魚精巢為Ⅱ期，精巢中以精原細胞為主（見封三圖3A-B）。實驗結束時，空白對照組C的雄魚精巢發育良好，此時為Ⅲ期精巢，生殖細胞以精母細胞為主，與實驗開始前相比精原細胞大幅減少（見封三圖3C-D）。高溫HT組出現大量呈空泡狀的精小囊（見封三圖3E），同時依然存在充滿精母細胞的正常精小囊，精小囊邊緣零星分布著精原細胞（見封三圖3F）。高溫-白消安HTB組中，精原細胞全部消失，精小囊中的生殖細胞也全部凋亡。以放大圖為樣本計算切片截面（400 μm×600 μm）中無生殖細胞精小囊占總精小囊數的比例。起始樣本S不存在無生殖細胞精小囊，不作統計對比。統計結果顯示（見圖4）：空白對照組C生殖細胞凋亡精小囊占總的精小囊的比例為32%±06%，有些明顯為切片操作引起的組織缺失。高溫HT和高溫-白消安HTB組誘導的生殖細胞凋亡的精小囊占總的精小囊的比例分別高達872%±8.4%和100.0%±0.0%，均顯著高于空白對照C組的生殖細胞凋亡精小囊所占比例（P<005），而高溫-白消安HTB組誘導生殖細胞凋亡的精小囊所占比例又顯著地高于HT組（P<0.05）。

3?討論

在本研究中發現，32 ℃高溫條件下，對星點東方鲀生長和成活都沒有影響。但高溫和白消安組明顯引起實驗魚表現出食欲下降和消瘦，且有約8尾魚（36.4%）體表出現潰瘍，并且在實驗剛結束的37 d出現兩尾死亡。銀漢魚性腺枯竭實驗也存在類似的現象[20-21]，25 ℃水溫下8個星期內按照40 mg/kg劑量注射白消安2次，最終導致雌魚表皮出現潰瘍并且增加了死亡率。而該課題組進而通過降低每次雌魚的白消安注射劑量最終避免了出現病理現象[10]。在Lacerda（2006）[9]的羅非魚實驗中，白消安的最大注射劑量為18 mg/kg，總計注射2次，均低于本實驗注射劑量和注射頻率，沒有發現表皮潰瘍和死亡。因此，推測實驗過程中的生長和死亡率跟白消安劑量和注射頻率相關。而Suzuki（1995）[22]研究二甲基亞楓DMSO對虹鱒、銀漢魚、青鳉這三種魚的胚胎的毒理發現，高濃度的DMSO增加了這三個魚種的死亡率。所以也有觀點認為白消安處理組的死亡率是由白消安的溶劑DMSO濃度引起。意識到DMSO潛在的危害性，一些學者在相似研究中均采用相對低濃度的DMSO溶解白消安，最終受體魚的死亡率都不大高[9，13，21，23-26]。今后有必要進一步開展篩選適宜的白消安劑量和DMSO濃度，既能有效凋亡內源生殖細胞又能保證制備出的受體魚體質強壯。

GCT技術在種質資源保護和商品魚繁育方面是非常有效的方法。通過植入消除內源性細胞成魚體內GCT能夠短時間內獲得供體子代。此種方法可以較快地挽救瀕危物種和加快選擇育種進程。在哺乳動物和鳥類中，多次注射白消安、X - 射線或γ - 射線照射、高溫促使內源性生殖細胞凋亡[5-8]。而魚類由于性腺位于腹腔中，用射線照射比較困難，如果通過外科手術暴露出來不大切合實際。所以在魚類中多采用通過高溫培育、多次注射白消安的方法進行生殖細胞枯竭實驗[9，13，21，23-26]。

高溫能夠促進魚類生殖細胞凋亡。本研究結果與羅非魚[9]、銀漢魚[21]、斑馬魚[11]和高身麗脂鯉[23]的實驗結果相似，單因子高溫就可以引起星點東方鲀雌、雄魚的內源生殖細胞的凋亡。在雄魚精巢中觀察到精小囊內生殖細胞凋亡，形成空泡狀精小囊，Lacerda（2006）[5]將其描述為僅有支持細胞的精小囊（Sertoli cell-only cysts），本實驗高溫組空泡狀精小囊就可以達到87.21±842%。在雌魚卵巢中，我們可以觀察到大量的退化異常卵母細胞，細胞個體萎縮變小進而引起卵巢腔的增大。然而De Alvarenga 研究與其他已發表的數據恰恰相反，發現尼羅羅非魚在相對較低一點兒的溫度下也能獲得生精細胞較高凋亡[27]。虹鱒魚[28]、麗脂鯉[23]、銀漢魚[21]在生長適宜溫度下性腺指數（GSI）沒有多大變化，而一旦轉入高溫組，GSI顯著地降低。一方面間接說明高溫引起了性腺生殖細胞的凋亡，另一方面也證明了高溫對受體魚性腺存有潛在的危害性。所以，今后有必要進一步深入研究溫度對星點東方鲀性腺的影響。

以往的研究報道表明實驗高溫配合白消安注射能有效加強對生殖細胞的凋亡作用[9，13，21，23-26]。在本研究中，高溫-白消安HTB組的卵巢空白面積和精巢中空泡狀精小囊比例均顯著高于高溫HT組（P<0.05）。在高溫HT組中（圖1F），部分卵母細胞的扁平濾泡上皮已經潰散，卵母細胞由正常的噬酸粉紅色變為噬堿性的藍色，而在高溫-白消安組除去大部分生殖細胞已經凋亡外，還出現大量巨噬作用產生的黃褐色染色物，其他魚類也有相似的報道[20，29-30]。我們是否可以推斷，高溫對雌、雄生殖細胞的作用是相同的，只是由于卵母細胞個體巨大，其退化潰敗有賴于巨噬細胞作用，這是一個需要時間的過程。

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Abstract：In order to study the effects of high temperature and busulfan injection on germ cell depletion of grass puffer，the growth，survival and germ cells apoptosis of grass puffers in 32 ℃ high temperature group （HT group），32 ℃ high temperature - busulfan group （HTB group） and control group were compared. The results showed that：In HTB group， the fish weight and fattiness were significantly lower than that of other groups （P<0.05），but the total length has no significant difference with that of other groups （P>0.05）.The survival rates of all groups were above 90.9%.The effects of germ cell apoptosis in HTB group were more obvious than that of the HT group，of which the normal germ cells of ovaries basic can not be seen.Furthermore，there were a lot of depositions of yellowish-brown caused by phagocytosis and the blank area ratio caused by germ cell apoptosis was significantly higher than that of the HT group （P<0.05）.The proportion of Sertoli cell-only cysts/seminiferous tubules caused by testis germ cell apoptosis in HTB group reached up to 100.0%±0.0% and was significantly higher than that of HT group（P<0.05）.Conclusion： It was relatively more easy to get recipients with a large number of endogenous germ cell apoptosis for germ cell transplantation in HTB group.

Key words：Grass puffer（Takifugu niphobles）; high temperature; busulfan; germ cell; transplantation