外周血中Th17/Treg與慢性乙型肝炎患者乙肝病毒DNA載量的相關性

張輝, 張賡

天津市寶坻區人民醫院感染科(天津 301800)

臨床上將乙型肝炎(乙肝)病毒檢測為陽性，且病程超過6個月或雖然發病日期不明確而臨床上有慢性肝炎表現的患者稱為慢性乙肝，主要由乙型肝炎病毒(HBV)感染引起，在我國屬于乙類傳染病，主要通過母嬰、血液制品、皮膚黏膜和性接觸傳播。不同宿主、環境因素均可導致乙肝病毒感染患者出現不同的結局和臨床類型，如不能及時控制，則會發展為慢性乙肝，在全球范圍內均較常見[1-3]，尤其是我國。長期的慢性乙肝可逐漸發展至肝硬化，甚至肝癌[4-6]。免疫機制在乙肝病毒感染患者病程遷延中發揮了重要作用，既往研究主要集中在Th1/Th2免疫平衡上，但逐漸有學者發現部分免疫現象不能使用Th1/Th2免疫平衡解釋，所以越來越多的學者開始重視Th17/Treg免疫平衡，研究顯示Th17/Treg在慢性乙肝患者中存在平衡失調，與慢性乙肝患者病情相關[7-9]。但Th17/Treg與慢性乙肝患者乙肝病毒DNA載量的相關性尚不清楚，為此我們設計了本研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年11月至2018年11月，前瞻性收集我院收治的慢性乙肝患者100例，納入標準：(1)慢性乙肝；(2)在我院接受診治，可以獲得檢測標本；(3)年齡18～65歲；(4)同意參與本研究。排除標準：(1)合并其他類型肝炎；(2)肝癌或肝臟其他重大病變；(3)其他類型感染；(4)惡性腫瘤；(6)心腦肺功能不全；(6)腎功能不全；(7)潰瘍性結腸炎等免疫系統疾??；(8)不能配合完成本研究。研究期間根據納入標準和排除標準，共納入慢性乙肝患者100例作為觀察組，同期收集100例至我院健康體檢的成人作為對照組；收集100例至我院診治的乙肝病毒攜帶者(乙肝表面抗原陽性，但未發病，無慢性肝炎癥狀)作為攜帶組；攜帶組和對照組均無上述相關疾病。3組年齡、性別、體質指數差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組一般資料比較

表1 3組一般資料比較

項目例數年齡(歲)男性[(例)%]體質指數(kg/m2)觀察組10046.01±10.1865(65.00)25.00±2.74攜帶組10046.65±9.9260(60.00)25.43±3.02對照組10047.45±9.8562(62.00)25.33±2.53F/2值0.8730.1941.016P值0.3840.6590.311

1.2 觀察指標 (1)外周血中Th17、Treg細胞；(2)外周血中白細胞介素(IL)-17、IL-10；(3)乙肝病毒DNA載量；(4)肝臟病變纖維化程度。

1.3 檢測方法 (1)入院后完善健康知識宣教和知情同意書簽署，于24 h內，取患者空腹血5 mL，利用美國Baekman公司提供的流式細胞儀測定樣本中Th17、Treg表達水平，淋巴細胞亞群熒光直標單顆?？贵w試劑購自美國Backman公司，該項目檢測由上海裕隆醫學檢驗所股份有限公司完成。(2)外周血中IL-17、IL-10：于入院24 h內，取患者空腹血5 mL，使用離心機(3 000 r/min)離心10 min后，取上層血清，使用ELISA法檢測血清中IL-17、IL-10表達水平，相關試劑盒由上海裕隆醫學檢驗所股份有限公司提供。(3)乙肝病毒DNA載量：使用熒光定量PCR法檢測慢性乙肝患者血清中(血清獲取方式同上)乙肝病毒DNA載量。(4)肝臟病變纖維化程度：行肝活組織檢查，對樣本進行HE染色、Masson染色，評估慢性乙肝患者肝臟纖維化程度分級(S分級，S0～S1為輕度纖維化，S2～S4為重度纖維化)。

2 結果

2.1 3組外周血中Th17、Treg細胞水平比較 與對照組或攜帶組比較，觀察組患者Th17、Treg細胞水平增高。見表2。

表2 3組外周血中Th17、Treg細胞水平比較

表2 3組外周血中Th17、Treg細胞水平比較

項目例數Th17Treg觀察組1003.07±1.319.80±2.58攜帶組1002.65±1.33?8.12±2.12?對照組1001.95±0.85?△7.70±2.75?△F值7.1965.577P值0.0000.000

*與觀察組比較P<0.05；△與攜帶組比較P<0.05

2.2 3組外周血IL-17、IL-10水平比較 與對照組或攜帶組比較，觀察組患者IL-17、IL-10水平增高。見表3。

2.3 慢性乙肝患者病毒學參數 100例慢性乙肝患者乙肝病毒DNA載量為(6.42±1.76)×104IU/mL。乙肝表面抗原陽性者100例，乙肝e抗原陽性者62例，乙肝表面抗體陽性71例，e抗體陽性者58例，核心抗體陽性者100例。慢性乙肝患者肝臟為輕度纖維化的56例，重度纖維化的44例。

表3 3組外周血IL-17、IL-10水平比較

表3 3組外周血IL-17、IL-10水平比較

項目例數IL-17IL-10觀察組10034.17±8.9229.76±7.05攜帶組10028.78±7.76?26.38±6.12?對照組10023.30±8.19?△23.65±5.48?△F值8.9716.845P值0.0000.000

*與觀察組比較P<0.05；△與攜帶組比較P<0.05

2.4 慢性乙肝患者肝纖維化程度與Th17、Treg、IL-17、IL-10的相關性 與肝臟輕度纖維化的患者相比，重度纖維化患者Th17、Treg、IL-17、IL-10均顯著升高(P<0.05)。見表4。

2.5 慢性乙肝患者Th17/Treg與乙肝病毒DNA載量的相關性 慢性乙肝患者乙肝病毒DNA載量與Th17、Treg、IL-17和IL-10均呈顯著正相關(P<0.05)。見表5和圖1。

表4 慢性乙肝患者肝纖維化程度與Th17、Treg、IL-17、IL-10的相關性

表4 慢性乙肝患者肝纖維化程度與Th17、Treg、IL-17、IL-10的相關性

項目例數Th17(%)Treg(%)IL-17(pg/mL)IL-10(pg/mL)輕度纖維化562.12±0.547.56±1.2526.25±2.0924.07±2.32重度纖維化443.32±0.588.83±1.1832.00±1.9229.32±2.71t值10.6775.16814.15010.430P值0.0000.0000.0000.000

3 討論

慢性乙肝如果不能得到及時控制，可逐漸發展至肝硬化和肝癌，是我國肝癌最主要的誘發因素。免疫功能在慢性乙肝患者中的作用逐漸被重視，本研究探討了Th17/Treg與慢性乙肝患者乙肝病毒DNA載量的相關性，結果顯示Th17/Treg及其細胞因子(IL-17和IL-10)在慢性乙肝患者中均升高，且與患者乙肝病毒DNA載量呈顯著正相關，可能參與了肝臟纖維化的發展過程。

表5 慢性乙肝患者Th17/Treg與乙肝病毒DNA載量的相關性

A:Th17;B:Treg;C:IL-17;D:IL-10

乙型病毒性肝炎是由于感染乙肝病毒引起，是一種雙鏈、環形、不完全閉合的DNA病毒，核蛋白(HBcAg)是其核心部分，外層則是病毒的外膜，因此乙型病毒性肝炎抵抗力較強，在外界可以存活，甚至可以耐受一般濃度的消毒劑，即使在60℃高溫中還可以耐受4 h，煮沸10 min、高壓蒸汽消毒2 min方可滅活，因此具有較強的傳染性，福建省的一項流行病學調查顯示乙肝病毒的發病率高達172.94/10萬[10]。乙肝病毒DNA載量是判斷乙肝病毒有無復制的“金指標”，可以用來評估人體內存在乙肝病毒的多少和活躍性，乙肝病毒DNA載量越高，說明傳染性越強，如果乙肝病毒DNA載量大于1 000或者1.0e+ 003拷貝/mL，說明乙肝病毒DNA呈陽性，提示HBV復制和有傳染性，是乙肝治療過程中監測療效的重要手段[11-14]。本研究顯示Th17/Treg及其細胞因子(IL-17和IL-10)在慢性乙肝患者中均升高，且與患者乙肝病毒DNA載量呈顯著正相關，提示慢性乙肝患者病毒活躍性越強，Th17/Treg及其細胞因子(IL-17和IL-10)越高，最終導致肝臟纖維化。Th17是一種促炎細胞，主要通過產生IL-17發揮其生理作用，是抗感染免疫中的效應性T細胞，當乙肝病毒活躍時，機體代償性地提高Th17、IL-17，以殺滅乙肝病毒[15-17]。Th17、IL-17增高，可以促進血管源性細胞因子的表達，促進腫瘤微血管生成，促進腫瘤生成、轉移和浸潤。但是慢性乙肝患者病毒活躍時，肝細胞炎性反應加重，導致肝功能損傷，為調控免疫應答對肝細胞的損傷，機體會代償性地增加免疫調控作用。IL-17的增加，還可以誘導IL-6的產生，激活STST3信號通路，促進肝臟纖維化的發展過程。Treg和IL-10是一種免疫抑制細胞和因子，其水平升高是慢性乙肝患者的一種自我保護作用，抑制肝組織中炎癥反應，從而達到減輕肝細胞損傷的作用[17-21]。Treg由Sakaguchi于1995年報道，目前已經成為腫瘤治療的重要靶點，在腫瘤患者中，具有免疫抑制和免疫無功能作用，可以幫助肝癌細胞發生免疫逃脫，加速肝癌細胞的生長和轉移[22-24]。異常增高的Treg細胞，還可以破壞CD8+T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，破壞其他免疫殺傷機制，導致肝癌細胞的快速生長和轉移。目前已有研究證實了Th17/Treg平衡失調與慢性乙肝患者肝功能損傷、肝纖維化有關[25-26]。支持本研究，本研究顯示與肝臟輕度纖維化的患者相比，重度纖維化的患者Th17/Treg平衡失調更嚴重，但本研究進一步探討了Th17/Treg平衡失調與乙肝病毒DNA載量的相關性，發現慢性乙肝患者乙肝病毒DNA載量與Th17、Treg、IL-17和IL-10均呈顯著正相關(P<0.05)。說明Th17/Treg平衡失調可能可以促進乙肝病毒在體內的復制，進而加重肝功能損傷。調節Th17/Treg平衡功能，可能有利于減輕慢性乙肝患者肝纖維化發展進程，但目前相關研究尚缺乏，需要進一步深入研究。

本研究的主要不足為未能對乙肝病毒在體內的復制與Th17/Treg平衡功能的相關性進行更深入的探討，且病例數僅為100例，相對不足。

綜上所述，外周血中Th17、Treg、IL-17和IL-10在慢性乙肝患者中均升高，與乙肝病毒DNA載量呈顯著正相關，可能參與了肝臟纖維化的發展過程。