合歡皮標準湯劑的HPLC指紋圖譜研究

田方 孫福仁 張肖建 李雪利 耿彥梅 高晗 李軍山

摘要：為全面反映合歡皮標準湯劑多種組分的面貌，明確合歡皮標準湯劑的HPLC指紋圖譜，對15批合歡皮標準湯劑進行了HPLC指紋圖譜測定及相似度評價。采用HPLC方法，色譜柱為WatersSymmetryshieldRPC18柱（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈-0.04%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為210nm，流速為1mL/min，柱溫為25℃，對照指紋圖譜對合歡皮標準湯劑進行相似度評價及聚類分析。結果表明，15批合歡皮標準湯劑指紋圖譜中呈現10個共有峰，相似度為0.967～0.998，表明合歡皮標準湯劑具有良好的一致性;此外，在10個共有峰中指認出（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、異槲皮苷2個化學成分。因此，合歡皮標準湯劑指紋圖譜反映了合歡皮標準湯劑的多組分面貌，具有良好的可行性，可為合歡皮配方顆粒的多組分質量控制提供參考。

關鍵詞：中藥化學;合歡皮;標準湯劑;HPLC指紋圖譜;相似度;聚類分析

中圖分類號：R917文獻標志碼：A

文章編號：1008-1534（2019）02-0128-07

合歡皮，別名合昏皮（《備急千金要方》）、夜合皮（《獨行方》）、合歡木皮（《本草綱目》）[1]，為豆科植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥樹皮，經夏、秋兩季剝取后曬干而得，具有解郁安神、活血消腫的功效，臨床上用于心神不安、憂郁失眠、肺癰、瘡腫、跌撲傷痛等癥的治療[2]。中藥飲片標準湯劑是指在中醫藥理論指導下，選取道地藥材或主產區藥材，將其加工炮制成合格飲片后，經標準化工藝制備而成的中藥飲片水煎劑型[3-4]。中藥飲片標準湯劑研究為配方顆粒的質量研究奠定了基礎。

目前，關于合歡皮標準湯劑質量研究的報道很少，相關指紋圖譜的研究尚未見報道。合歡皮相關藥材的報道多集中于對其化學物質種類[5-9]、藥理作用[10-12]的研究，對于其指紋圖譜雖有研究，但部分色譜峰并未達到基線分離，分離效果也有待提高[13-14]。2015年版《中華人民共和國藥典》對于合歡皮詞條僅收錄了合歡皮藥材和飲片單一化學成分的含量測定方法。中藥材成分復雜，一種化學成分指標往往并不能代表藥材的整體質量情況。合歡皮含有三萜、黃酮、木脂素、生物堿、鞣質及多糖等多種化學成分，成分較為復雜，且水溶性木脂素類化合物的結構較為相似，這些都為指紋圖譜方法的制定帶來了一定的困難。本研究通過建立合歡皮標準湯劑的HPLC指紋圖譜，全面反映合歡皮標準湯劑多種組分的面貌，以期為合歡皮配方顆粒的質量控制提供參考。

1主要儀器與材料

日本島津公司高效液相色譜儀（LC-20AT型泵），真空冷凍干燥機（Tofflon）），CPA225D分析天平（Sartorius），AE240電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo有限公司提供），KH3200E型超聲波清洗器（江蘇昆山禾創超聲儀器有限公司提供）。

對照品（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，批號為111911-201603，中國食品藥品檢定研究院提供;對照品異槲皮苷，批號為111809-201403，中國食品藥品檢定研究院提供;色譜純乙腈，批號為20180713，天津科密歐化學試劑有限公司提供;分析純甲醇，批號為20180611，北京益利精細化學品有限公司提供;15批合歡皮飲片，經原河北省藥品檢驗研究院孫寶惠主任鑒定為豆科植物合歡AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥樹皮，水分、浸出物、（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷等指標均符合2015年版《中華人民共和國藥典》要求。飲片來源及標準湯劑編號見表1。

2方法與結果

2.1指紋圖譜方法建立

2.1.1色譜條件

色譜柱為WatersSymmetryshieldRPC18（4.6mm×250mm，5μm）;流動相為乙腈-0.04%（體積分數，下同）磷酸溶液，按照表2所示比例進行梯度洗脫。檢測波長為210nm，柱溫為25℃，流速為1mL/min，進樣量為10μL。

2.1.2對照品溶液的制備

?。?）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品，精密稱定，加甲醇制成每1mL含25μg的溶液。另取異槲皮苷對照品，精密稱定，加甲醇制成每1mL含異槲皮苷10μg的溶液。

2.1.3供試品溶液的制備

取凍干膏粉適量，研細，取0.2g，精密稱定，置入具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，稱定質量，超聲（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.1.4方法學考察

1）精密度試驗

取合歡皮標準湯劑（編號S10），按照“2.1.3”項所述方法制備供試品溶液。精密吸取10μL，連續進樣6次，各共有峰相對保留時間的RSD值<0.7%，相對峰面積的RSD值<1.7%，表明儀器精密度良好，詳見表3和表4。

2）重復性試驗

取合歡皮標準湯劑（編號S10），按“2.1.3”項所述方法分別制備6份供試品溶液，平行測定，各共有峰相對保留時間的RSD值<0.7%，相對峰面積的RSD值<3.2%，表明方法的重復性良好，詳見表5和表6。

3）穩定性試驗

取同一供試品（編號S10）溶液，分別在0，2，5，8，12，16，21h進樣測定，各共有峰相對保留時間的RSD值<0.8%，相對峰面積RSD值<2.3%，表明供試品溶液在0～21h穩定，詳見表7和表8。

2.2指紋圖譜的分析

2.2.115批合歡皮標準湯劑制備

取合歡皮飲片100g，第1次加10倍水，浸泡30min，煎煮30min，過濾;第2次加8倍水，煎煮20min，過濾。合并2次水煎液，經真空低溫濃縮、冷凍干燥后得到膏粉，即得合歡皮標準湯劑。

2.2.2對照圖譜的建立及色譜峰指認

精密吸取對照品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進行分析，得到對照品HPLC色譜圖。精密稱定

15批合歡皮標準湯劑樣品，按“2.1.3”項所述方法制備供試品溶液，按“2.1.1”色譜條件進行分析，得到合歡皮標準湯劑指紋圖譜，見圖1。

通過與（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、異槲皮苷對照品圖譜比對，確認合歡皮標準湯劑指紋圖譜中7號峰為（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，9號峰為異槲皮苷。

2.2.3樣品測定

照“2.1”項所述方法制備對照品溶液及供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與15批合歡皮標準湯劑供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖，見圖2。

從15批合歡皮標準湯劑HPLC指紋圖譜可以看出，合歡皮標準湯劑的出峰時段較長，呈現的峰數目較多，表明合歡皮標準湯劑化學成分較為復雜。比較15批合歡皮標準湯劑HPLC指紋圖譜測定結果可以發現，不同合歡皮標準湯劑樣品呈現的指紋圖譜無明顯差異，15批合歡皮標準湯劑中10個共有峰相對保留時間的RSD值為0.00%～1.09%，表明不同產地的合歡皮飲片制成的標準湯劑具有類似的化學成分，但S1—S10相對峰面積的RSD值為0.00%～60.78%，差異均較顯著，表明合歡皮標準湯劑化學成分含量存在顯著差異，初步分析可能和不同產地飲片間化學成分的含量差異和標準湯劑制備過程中化學成分的轉移有關。

2.2.4相似度分析

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件”（2012版），分別對15批合歡皮標準湯劑指紋圖譜進行相似度評價，結果見表9。

由表9可以看出，15批合歡皮標準湯劑指紋圖譜整體相似度為0.967～0.998，表明15批合歡皮標準湯劑具有良好的一致性。

2.2.5聚類分析

將15批合歡皮標準湯劑相對共有峰峰面積導入SPSS19.0，進行聚類分析，分類依據為平均歐氏距離。結果見圖3。

15批合歡皮標準湯劑被分為2大類，其中，湖北1、湖北2、湖北十堰、四川都江堰4個產地被分為第1大類，其余產地被分為第2大類。在第2大類中又分為4個小類，河南廬陽嵩縣、湖北宜昌被分為單獨2個小類，湖北3、陜西商洛、湖南永州、河南盧氏被分為一小類，其余產地為一類。從分類結果可知，湖北5個產地中，僅湖北1、湖北2、湖北十堰3個產地在分類上距離集中，其他2個產地在分類上距離較遠。河南2個產地同樣在分類上距離較遠。15批合歡皮飲片在產地上具有代表性，指紋圖譜能夠反映出不同產地間的樣品差異。

3結論

1）近來來，受國家政策的影響，中藥配方顆粒因其方便快捷等特點受到越來越多人的關注[15-16]。中藥飲片標準湯劑作為中藥配方顆粒制備工藝及質量標準的研究基準，在國家出臺的《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》（征求意見稿）中有明確的要求。而中藥指紋圖譜能最大限度獲取有用化學信息，有效控制中藥產品的質量[17]。

2）在《中華人民共和國藥典》合歡皮含量測定的基礎上，嘗試了用甲醇-0.04%磷酸、乙腈-0.04%磷酸、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-1%醋酸等不同流動相進行洗脫，并對洗脫梯度進行了優化，對不同柱溫（25，30，35℃）、供試品的提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、甲醇、水）、超聲時間（10，30，60min）和波長進行了篩選，通過優化最終得到了本研究的色譜條件。

3）采用高效液相色譜法，首次建立了合歡皮飲片標準湯劑指紋圖譜，總出峰時段較長，呈現的峰數目眾多，所得圖譜基線較為平直，分離度較好，解決了合歡皮化學成分復雜、分離效果不理想的難題，并從中指認出（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、異槲皮苷2個化學成分，方法具有良好的可行性，可為后續合歡皮配方顆粒多組分質量控制提供參考。由于出峰數目眾多，其他峰的化學物質指認尚需進一步研究。

4）測定了15批標準湯劑指紋圖譜，得出的相似度較高，說明合歡皮標準湯劑具有良好的一致性。通過對15批標準湯劑指紋圖譜進行聚類分析，發現受不同產地的影響，合歡皮標準湯劑指紋圖譜有所差異。這說明固定中藥材產地對合歡皮標準湯劑的質量控制意義重大，也為后續研究提供了方向。

參考文獻/References：

[1]宋立人.現代中藥學大辭典[M].北京：人民衛生出版社，2001：876.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：143.

[3]朱廣偉，李西文，李琦，等.基于傳統煎藥工藝的龍膽飲片標準湯劑制備及質量評價方法研究[J].中草藥，2017，48（20）：4253-4260.

ZHUGuangwei，LIXiwen，LIQi，etal.StudyonpreparationandqualityevaluationofstandarddecoctionofGentianaRadixbasedontraditionaldecoctingprocess[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs，2017，48（20）：4253-4260.

[4]代云桃，李琦，范自全，等.中藥飲片標準湯劑的質量評價案例——金銀花[J].中國中藥雜志，2017，42（5）：809-816.

DAIYuntao，LIQi，FANZiquan，etal.Qualityevaluationofdecoctionofsinglemedicinalherb：AcaseofLoniceraeJapinicaeflos[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica，2017，42（5）：809-816.

[5]ZOUKun，ZHAOYuying，TUGuangzhong，etal.Anewtriterpe-noidsaponinfromAlbizziajulibrissin[J].JChinPharmSci，2000，9（3）：125-128.

[6]JUNEIK，HIROYUKIH，KATSURAF，etal.LignoidsfronAlbizziaecortexⅡ：Abiodegradationpathwayofsyringaresinol[J].ChimPharmBull，1991，39（11）：2952-2955.

[7]MAKATOK，HIROSHIH，SEIICHIE，etal.Identificationofflavonesinsixteenleguminosaespecies[J].AgricBiolChem，1980，44（6）：1407-1409.

[8]李海濤.合歡皮三萜皂苷化學成分的研究[D].長春：長春中醫藥大學，2007.

[9]吳婉琴，俞雨，梁睿，等.不同采收期合歡皮中木脂素苷I含量的動態變化[J].中國藥師，2017，20（4）：736-737.

WUWanqin，YUYu，LIANGRui，etal.DynamicvariationofthecontentoflignanglycosideIinCortexAbizziaeatatdifferentharvestperiod[J].ChinaPharmacist，2017，20（4）：736-737.

[10]廖穎，王瓊，黎霞，等.合歡皮抗抑郁作用研究[J].安徽農業科學，2014，42（1）：57-58.

LIAOYing，WANGQiong，LIXia，etal.StudyonantidepressanteffectofAlbiziaeCortexinmice[J].JournalofAnhuiAgriSci，2014，42（1）：57-58.

[11]田微，葉小敏，楊德森，等.合歡皮水提物不同部位的急性毒性比較研究[J].湖北中醫藥大學學報，2015，17（2）：42-44.

TIANWei，YEXiaomin，YANGDesen，etal.ComparativeacutetoxicityresearchondifferentpartsfromwaterextratsofAlbizzajulibrissinBark.[J].JournalofHubeiUniversityofChineseMedicine，2015，17（2）：42-44.

[12]白羨欽，代光輝，陳佳，等.合歡皮提取物對黑曲霉抑菌活性的研究[J].食品工業科技，2014，35（12）：133-136.

BAIXianqin，DAIGuanghui，CHENJia，etal.StudyontheantimicrobialactivityofAlbiziajulibrissinDurazz.barkextractagainstAspergillusniger[J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry，2014，35（12）：133-136.

[13]方志興.合歡皮水溶性木脂素部位提取純化工藝及其質量分析[D].武漢：湖北中醫藥大學，2014.

FANGZhixing.StudyonExtractionPurificationTechnologyandQualityAnalysisoftheWater-SolubleLignanfromCortexAlbizziae[D].Wuhan：HubeiUniversityofChineseMedicine，2014.

[14]施建軍.合歡皮總皂苷提取工藝路線的優化和質量標準的初定[D].無錫：江南大學，2012.

SHIJianjun.OptimizationoftheExtractionProcessRoutefortheGlycosidesinAlbiziajulibrissinandEstablishmentofItsQualityStandard[D].Wuxi：JiangnanUniversity，2012.

[15]王爽，王智，侯立強.免煎中藥配方顆粒在臨床應用中的優勢與不足[J].中國現代藥物應用，2013，7（14）：142-143.

[16]何軍，朱旭江，楊平榮，等.中藥配方顆粒的現狀與發展新思路[J].中草藥，2018，49（20）：4717-4725.

HEJun，ZHUXujiang，YANGPingrong，etal.CurrentsituationandnewideasonfuturetrendsofChinesemateriamedicagranulesforprescriptions[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs，2018，49（20）：4717-4725.

[17]陶金華，狄留慶，文紅梅，等.中藥指紋圖譜譜效相關性研究思路探討[J].中國中藥雜志，2009，34（18）：2410-2413.

TAOJinhua，DILiuqing，WENHongmei，etal.InvestigationofresearchmethodoffingerprintpharmacodynamicsoftraditionalChinesemedicines[J].ChinaJournalofChineseMateriaMedica，2009，34（18）：2410-2413.