‘黔核5號’核桃葉片多酚組分及含量差異分析

陸勝波 張文娥 史斌斌 潘學軍

摘要：核桃多酚是對人體有益的功能活性物質，常在醫療保健等方面發揮重要作用。以貴州省廣泛栽培的優良品種‘黔核5號’為材料，測定其葉片中多酚組分及含量狀況，為合理開發利用核桃多酚提供理論依據。采用紫外分光光度法測定總酚、總黃酮，測得總酚、總黃酮含量為179 mgGAE-1FW。采用高效液相色譜法（HPLC）測定多酚組分及含量，測定7種酚酸：沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、丁香酸、丁香醛，4種黃酮類：兒茶素、槲皮素、楊梅素、蘆丁，1種萘醌：胡桃醌。其中綠原酸和蘆丁含量分別為12604 mg-1FW之間。綠原酸和蘆丁是核桃葉片的主要多酚物質。

關鍵詞：葉片;HPLC;多酚;綠原酸;蘆丁

中圖分類號：S6641

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2019）06-0054-04國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2019.06.009

Analysis of Polyphenols Composition and Content Difference in Leaves of ‘Qianhe5’Juglans sigillata Dode

LU Sheng-bo，ZHANG Wen-e*，SHI bin-bin，PAN Xue-jun

（College of Agriculture/ Guizhou Engineering Research Center for Fruit Crops，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：Walnut polyphenols are useful functional substances for the human body and often play an important role in health and medicineThe leaves of 'Qianhe5'（Juglans sigillata Dode）were used as tested materials to determine the components and content of leaves in polyphenols，which provided a theoretical basis for rational development and utilization of walnut leavesThe total phenolics and total flavonoids detected by ultraviolet spectrophotometry were 179 mg GAE-1FW，respectivelyPolyphenol components and content were analyzed by high performance liquid chromatography （HPLC），including seven phenolic acids：gallic acid，chlorogenic acid，caffeic acid，p-coumaric acid，ferulic acid，syringic acid and syringaldehyde; four flavonoids：catechin，quercetin，myricetin，rutin; as well as one naphthoquinone：jugloneThe amounts of chlorogenic acid and rutin were 12604 mg-1FW，respectively，which were significantly higher than other polyphenols components，and the remaining components were about 022 ～ 2534 mglang=EN-US>gallic acid，chlorogenic acid，caffeic acid，p-coumaric acid，ferulic acid，syringic acid and syringaldehyde; four flavonoids：catechin，quercetin，myricetin，rutin; as well as one naphthoquinone：jugloneThe amounts of chlorogenic acid and rutin were 12604 mg

貴州是我國核桃主產區之一，境內核桃資源豐富，從300 ～ 2700 m的海拔范圍內都有核桃分布。根據調查，貴州核桃有4個屬11個種[1]，其中以鐵核桃類型為主，占核桃資源的80%以上，主要集中在黔西北地區。近10年來，貴州核桃產業發展迅速，全省的核桃種植面積近1000萬畝[2]，已經成為農民增收的重要產業。這主要得益于從貴州實生核桃群體中選育出了一批本地適生的優良核桃品種，如‘黔核5號’、‘黔核6號’、‘黔核7號’、‘黔核8號’系列優良品種;也發掘了一批獨具特色的核桃類型，如“小米核桃”、“串核桃”等具有鮮明特點的核桃類型。在大面積生產核桃過程中，其枝、葉、青皮等附加物產量巨大，因得不到合理利用而常被廢棄，不僅浪費資源還造成環境污染。

眾所周知，核桃營養價值極高，擁有“長壽果”、“益智果”等美譽。核桃不僅含多種必需氨基酸、蛋白質、不飽和脂肪酸等營養物質[3-4]，還含有豐富的多酚物質，多酚具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化等功能，在食品、醫藥、工業等[5-6]領域發揮重要作用。核桃葉片能入藥，一棵核桃大樹的產葉量可達上百斤，是提取多酚物質的良好來源。貴州省核桃資源豐富，栽培過程中產生大量葉片，如能利用葉片提取植物多酚，不僅能提高核桃附加產值，也增加農民種植和管理核桃的積極性。了解核桃葉片的多酚物質狀況是其開發利用的前提，因此我們以黔西北地區優良品種‘黔核5號’為材料，測定其葉片中多酚組分及含量，以期為核桃葉片合理開發利用提供參考。

1材料和方法

11材料

111試驗材料

試驗地為貴州大學教學農場核桃種質資源圃，試驗材料為高位嫁接6年后的鐵核桃（Juglans sigillata Dode）‘黔核5號’，果樹生育期正處于初果期狀態。

112試驗設計

選取大小、長勢一致的10棵核桃樹，于成熟期在樹冠中部外圍采集結果枝基部復葉第2片小葉，分為東南西北四個方位，每個方位采集5片，每棵樹20片，共200片葉，三次生物學重復。葉片用0℃冰盒帶回實驗室，蒸餾水洗凈后迅速用液氮冷凍研碎，分裝保存于-80℃超低溫冰箱備用。

12方法

121主要儀器設備和藥品

主要儀器：高效液相色譜儀（HPLC）（LC-15C型，日本島津公司）;紫外分光光度計（UV-2550型，日本島津公司）;高速冷凍離心機（SORVALL Stratos型，美國賽默飛公司）;超聲波清洗儀（KQ5200DE型，昆山超聲儀器廠）。主要試劑和藥品：福林-酚試劑，普通甲醇、碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純，購自貴州凱信生物科技有限公司;色譜甲醇、沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、丁香酸、丁香醛、兒茶素、楊梅素、槲皮素、蘆丁、胡桃醌均購自美國Sigma公司。

122多酚物質的提取

超聲波輔助提取法（參考王長雷等[7]）：分別稱取05 g的核桃葉片，于研缽中加入50%的甲醇水溶液10 mL;研磨至勻漿狀態后轉入10 mL離心管中，在50℃條件下40KHz超聲輔助提取40 min，重復提取兩次后合并提取液;再經4℃的高速冷凍離心機8000 r/min下離心10 min，減壓濃縮至膏狀;取上清液用50%的甲醇水溶液定容至10 mL，即為多酚提取液，用于總酚、總黃酮和單體酚含量的測定。

122多酚、總黃酮含量的測定

采用福林-酚法測定總酚（參考 Condehernández 等[8]）：首先吸取02 mL多酚提取液于10 mL容量瓶中，接著加入04 mL福林-酚試劑，再加入25 mL 15%碳酸鈉溶液，定容至10 mL;于25℃條件下水浴2 h，在765 nm的紫外分光光度計下測定吸光值。用不同濃度的沒食子酸標準溶液替代多酚提取液，在相同條件下測定吸光值，并繪制沒食子酸標準曲線。最后可求得總酚含量，計算結果以沒食子酸當量（mgGAE瘙簚g-1FW）表示。

采用鋁離子絡合法測定總黃酮（參考 聶繼云 等[9]）：首先吸取05 mL多酚提取液于10 mL容量瓶中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min后加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，再靜置6 min后加入3 mL 4%氫氧化鈉溶液;定容后于25℃條件下水浴15 min，在510 nm處測定吸光值。根據不同濃度蘆丁標準溶液替代多酚提取液，在相同條件下測得吸光值并繪制標準曲線。最后可求得總黃酮含量，計算結果用蘆丁當量mgRE

123多酚組分及含量的測定

采用高效液相色譜法（HPLC）測定多酚組分及含量：LC-15C型高效液相色譜儀，帶自動進樣器，色譜柱為Agilent C18（250 mm × 46 mm，5 μm）。流動相A和B分別為08%乙酸、色譜甲醇;多酚提取液用022? μm濾膜過濾，進樣量10 μL，柱溫25℃，流速09 r/min。兩種梯度洗脫法[10]，梯度 1：0 ～ 10 min，10% ～ 20% B;10 ～ 25 min，20% ～ 50% B;25 ～ 35 min，50% B;35 ～ 40 min，50% ～ 55% B;40 ～ 45 min，55% ～ 10% B，檢測波長為 280 nm，用于沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、丁香酸、丁香醛、兒茶素的測定。梯度 2：0 ～ 10 min，10% ～ 40% B;10 ～ 25 min，40% ～ 60% B;25 ～ 35 min，60% ～ 80% B;35 ～ 45 min，80% ～ 10% B，檢測波長為 251 nm，用于楊梅素、槲皮素、蘆丁、胡桃醌的測定。

124數據統計與分析

采用Excel 2010軟件進行數據統計，SPSS 170軟件作顯著性方差分析。

2結果與分析

21葉片總酚、總黃酮含量的測定

如圖1所示，葉片中測得總酚含量為179 mgGAEans sigillata Dode）were used as tested materials to determine the components and content of leaves in polyphenols，which provided a theoretical basis for rational development and utilization of walnut leavesThe total phenolics and total flavonoids detected by ultraviolet spectrophotometry were 179 mg GAE

22葉片中多酚組分狀況及含量測定

葉片中多酚組分及含量如表 1所示，鑒定出沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、丁香酸、丁香醛、兒茶素、槲皮素、楊梅素、蘆丁和胡桃醌共12種單體酚。蘆丁和綠原酸的含量最高，分別為30757 mg

23葉片中多酚含量分布

圖 2為12種多酚物質含量分布狀況，可見這12種多酚組分的含量差異較大，其中蘆丁含量最高為6159%，其次是綠原酸252%，接著是楊梅素（507%）和槲皮素（442%），其余多酚含量在004% ～ 147%之間。

3結論與討論

‘黔核5號’核桃葉片多酚組分豐富，能測到多種酚酸和黃酮類物質。綠原酸是酚酸中含量最高的物質，為12604 mg·100g-1FW。這與很多藥用植物的多酚組分相似，如銀杏[11]、番石榴[12]、檵木[13]、八仙花[14]、艾草[15]等多種藥用植物葉片，可檢測到綠原酸、沒食子酸、對香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香酸、楊梅素、槲皮素、蘆丁等多種酚酸和黃酮類物質，是葉片中發揮功效的主要成分。表明核桃葉往藥用方向發展潛力巨大，能作為提取酚酸、黃酮等藥物成分的良好植物源。

在測定的12種多酚物質中，黃酮類含量整體比酚酸類含量高。酚酸物質在次生代謝中處于中上游位置，連接著下游的黃酮、花青素、木質素等代謝過程，既是底物又是產物，如咖啡酸、對香豆酸可以由上游苯丙氨酸生成，又可以通過不同的酶促反應進入下游的黃酮、花青苷等途徑[16]。植物代謝時會產生多種中間酚酸產物，進一步反應后才生成穩定的黃酮，這可能是檢測到酚酸含量較少的原因。耿樹香[17-18]、劉基[19]、張春梅[20]等均在鐵核桃的青皮、葉片、內種皮等部位檢測到含量豐富的多酚和黃酮類物質，也從中鑒定到了沒食子酸、綠原酸、槲皮素、胡桃醌等多酚組分。本次試驗從核桃葉片中檢測到較高含量的蘆丁，顯著高于其它多酚組分，為30757 mg·100g-1FW;與其他研究者報道的結果相似，如Cosmulescu等[21]在‘Fernette’、‘Vina’、‘Valcor’、‘Hartley’等9個品種的核桃葉片中測得蘆丁平均含量為989 mg·100g-1FW，其中‘Valcor’最高為1867mg·100g-1FW，本次測得蘆丁分別是其平均含量的342倍、最高含量的165倍，這可能與不同品種核桃和地域因素有關。但均表明核桃葉片中蘆丁含量豐富，可為提取核桃葉片中的蘆丁提供參考和理論依據。

高液相色譜法（HPLC）是測定多酚物質比較成熟和常用的方法，如吳竹、張啟發等[22-23]用高液相色譜法檢測銀杏、煙草中的多酚物質，能有效地對銀杏內酯、山奈素等相關酚類物質進行鑒定。采用高效液相色譜法檢測到核桃葉片多酚物質含量豐富，具有很好的開發價值和利用潛力，除了本次試驗所測的12種多酚組分外，還有其它多酚組分需要進一步探索。隨著色譜與質譜技術的快速發展，今后可使用氣質譜聯用（GC/MS）、液質聯用（LC/MS）、核磁共振（NMR）等更加先進的技術挖掘核桃葉片中更多的酚類物質信息。

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