牛輪狀病毒研究進展

劉占悝 劉澤余 李智杰 郭利

摘要：牛輪狀病毒（Bovine Rotavirus，BRV）是引起幼齡牛腹瀉的主要病原體，可通過胎盤垂直傳播。多表現為精神萎靡，食欲不振、腹瀉、嘔吐、脫水等臨床癥狀，且多數為隱性感染。當環境條件適宜時，可引起該病的暴發與流行，對牛養殖業造成了巨大的經濟損失。該文綜述了輪狀病毒的流行情況、腹瀉機制、檢測方法、疫苗的研制和藥物研究等方面。

關鍵詞：牛輪狀病毒;流行情況;發病機制;檢測方法;免疫預防;藥物研發

中圖分類號：S823 文獻標識碼：B doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.20.001

0 引言

牛輪狀病毒（Bovine Rotavirus，BRV）是危害牛養殖業的重要的病原之一，常造成隱性感染?；疾∨：碗[性感染?？沙掷m向體外排毒成為主要的感染源。該病可通過糞-口途徑傳播[1]，不合格的飼養條件和不規范的管理制度也是導致該病流行的主要原因之一。BRV主要引起7日齡內的犢牛發病，發病率為50%～100%[2]，病死率則根據是否引起產腸毒素大腸桿菌的混合感染而變化較大。研究表明牛輪狀病毒主要感染空腸和回腸成熟的絨毛上皮細胞。

輪狀病毒除感染牛外，還會感染其他哺乳動物（如豬、羊、貓、狗等）、禽類（如雞、火雞等）及野生動物（如鹿等）。2016年Anbalagan S[3]等從幼鹿中分離出一株A型輪狀病毒14-02218-2，此株病毒與牛輪狀病毒有關。鹿輪狀病毒多引起2～5日齡仔鹿發病，病程2～3d呈急性經過。

1 病原

牛輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬的雙股RNA病毒。1969年Mebus最早在犢牛中發現輪狀病毒，之后澳大利亞科學家也發現了同類病毒[4]，Thomas Henr Flewett使用電子顯微鏡觀察該病毒后，根據其形態特征建議將其命名為輪狀病毒[5]。各種動物和人的輪狀病毒的形態相同，是一種無囊膜的病毒。電鏡觀察，BRV為形似車輪的粒子，完整的病毒粒子呈二十面體，直徑約65～75nm[6]，有短的且外緣光滑。

2 流行情況

隨著對牛輪狀病毒研究的不斷深入，人們逐漸認識到牛輪狀病毒是引起犢牛腹瀉的主要病原體之一[7]。為更清晰地了解該病毒，根據其中層蛋白VP6抗原特異性的差異，人為地將該病毒分為A-G7個抗原型[8]。7種抗原型中只有A-C型既能感染人又能感染動物，其中A型是引起犢牛腹瀉的最主要原因之一，引起了獸醫及科研工作者的廣泛關注。后來又根據細胞的糖蛋白VP7和蛋白酶敏感蛋白VP4的基因型G和P區別新分離病毒的基因型，目前已經有27個G型和35個P型[9]。據報道，全球的牛輪狀病毒流行優勢株為G10P11，G10P5和G10P[10]，而在國內則以G6為優勢流行毒株，G10只在部分地區流行[11]。

3 臨床癥狀

新生犢牛最易感BRV，多發生在晚秋、冬季和早春，天氣寒冷或是天氣變化較大的時間。7日齡內的犢牛最易感，此時病畜表現為精神萎靡、流涎、不愿站立。到8-14日齡時，表現為嚴重的水樣腹瀉，尾部沾染黃色的糞便。犢牛因嚴重的腹瀉導致脫水，眼部凹陷、四肢無力。通常因機體抵抗力的減退導致繼發性的細菌感染。若不及時治療，病?？赡茉诟篂a后72h內死亡。解剖病死犢牛，可觀察到腸壁變薄，腸內容物呈黃色或是紅色，并可能含有脫落的腸粘膜。顯微鏡觀察，表現為腸絨毛萎縮，上皮細胞脫落。

4 致病機理

輪狀病毒的發病機制可以大致分為4種：①輪狀病毒感染小腸上皮細胞后[12]，可以通過胃腸屏障進入血液循環，隨血液循環至全身的各個器官，對其他的內臟器官造成傷害。②輪狀病毒的融合素蛋白VP4在腸道胰酶的作用下水解為對病毒入侵宿主細胞早期起重要作用的VP8和VP5。③病毒侵染小腸上皮細胞后編碼的非結構蛋白糖基化，細胞膜對鈣離子的通透性增加，導致腸道電解質的平衡失調，進而導致腹瀉的發生。④病毒感染初期，通過抑制宿主細胞的凋亡而逃避細胞免疫的發生，對病毒感染早期的增值起到重要的作。

5 實驗室診斷

牛輪狀病毒的普遍存在和隱性感染，使對該病的快速準確的檢測顯得非常必要，對疾病的預防控制和臨床診治起到至關重要的作用。目前檢測該病的診斷方法有多種，每種診斷方法都有其優點和其不足之處。需要根據實際的情況進行選擇，最好的方法是根據實際需要，選擇適宜的多種檢測方法配合使用，以提高檢測的準確性和說服力，為診斷和治療疾病提供更好的治療方案。在生產實踐中如何提高檢測的靈敏性和特異性，降低檢測成本，建立適用于基層牛場的病原檢測方法是疫病檢測的主要目標?，F對幾種常用檢測方法進行簡單的介紹。

5.1 乳膠凝集反應（LAT）

乳膠凝集反應是以乳膠顆粒作為載體的一種間接凝集試驗。其原理是用載體吸附可溶性抗原于其表面，特異性抗體與之結合后，產生的凝集反應。檢測的優點是很容易在短時間內完成，不需要昂貴的設備或熟練的人員，并且試劑具有長保質期。這些因素使得LAT適合作為牛輪狀病毒的快速篩選試驗在臨床實驗室中高效使用，對臨床的大批量檢測起到重要的作用。靈敏度和特異性分別為87.85%和73.3%。與ELISA相比，乳膠凝集顯示出100%的敏感性和96.3%的特異性[13]。但是樣品的復雜性會影響檢測結果的準確性。

5.2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

酶聯免疫吸附試驗是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應板）表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。該方法同樣無需高昂的儀器設備，操作簡單，靈敏度較乳膠凝集反應特異性更高，更加快速靈敏?？梢灾苯訖z測樣品中病毒的大致含量，反應牛的感染情況及程度，利于該病毒的動態監測以及批量檢測。李云富[14]等建立了BRV抗原雙抗體夾心ELISA定量檢測方法，該方法線性好，特異性強，靈敏度高，準確性好，可用于BRV疫苗生產中間品及終產品的抗原定量檢測。

5.3 聚丙烯酞胺凝膠電泳（PAGE）

聚丙烯酞胺凝膠電泳是根據不同蛋白質分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產生的不同遷移率將蛋白質分離成若干條區帶的方法，該方法特異性強，還可以鑒別牛輪狀病毒的種群。該方法不需要特殊的設備及操作簡單，可同時用于大量樣品的檢測。其缺點是輪狀病毒RNA樣品易被降解，導致檢測的結果不準確。ChoudharyP[15]等進行的乳膠凝集試驗顯示25只新生羊羔和4只兒童糞便樣本呈輪狀病毒陽性。然而，RNA-PAGE顯示只有9只羊羔糞便樣本呈陽性。PAGE檢出率低于LAT可能原因是RNA大量降解造成的。

5.4 RT-LAMP

反轉錄一環介導等溫擴增技術操作簡單、結果不需要借助特殊的設備而清晰可見，檢測范圍廣泛。其特異性與靈敏度與PCR相當，成本遠低于熒光定量PCR。此方法有望成為新的臨床檢測的手段。Xie Z[16]等建立了逆轉錄環介導的等溫擴增（RT-LAMP）測定并優化BRV的快速檢測。以BRV的新生小牛腹瀉病毒（NCDV）毒株VP6基因的序列設計特異性引物組。RT-LAMP測定在63℃的水浴中進行60min，并且擴增產物直接或在紫外光下可見。該BRV的RT-LAMP測定方法可特異性地檢測到3.32 copies的A型BRV，與其他牛病原體沒有交叉反應。但是該方法易產生假陽性的結果，導致檢測準確性的降低。

5.5 PCR

用于BRV檢測的是RT-PCR技術，此外，還有實時熒光定量PCR技術、多重PCR技術。實時PCR作為診斷工具的應用已被廣泛接受，因為它提供了快速、定量和可靠的測量，檢測靈敏度可達2.5 copies/reaction[1]。多重PCR可用于多種病原的同時檢測，提高效率，節省檢測的時間。Fukuda M[17]等建立了檢測牛輪狀病毒A-C型、牛冠狀病毒（BCV）和牛逆轉錄病毒（BToV），其中B型檢測量為106 copies/mL。王梓[18]等用牛輪狀病毒NCDVVP6基因保守區設計引物，建立了SYBR Green熒光定量的檢測方法。該方法檢測的最低量為15.39 copies/L，且特異性強，靈敏度高，可實現牛輪狀病毒早期的快速檢測。李凡[19]等建立了基于恒溫隔絕PCR（insulated isothermal PCR，iiPCR）技術，該技術主要利用熱對流原理，通過加熱容器底部的液體，產生上下液體之間的溫差，形成液體的循環，并持續加熱和維持循環，形成穩定的溫度梯度。此時，通過容器的設計巧妙地控制對流時間和散熱速率，可以形成適合PCR的反應環境。反應只需要42min，結果直接顯示在屏幕上，檢測限度達96.6 copies/uL。與傳統PCR儀相比，該技術縮短了反應時間，儀器輕便易操作，實現了現場程序化病原體檢測，適合基層快速診斷。

6 牛輪狀病毒疫苗

疫苗的免疫接種是預防BRV的主要手段，常見的疫苗有滅活疫苗和減毒活疫苗。滅活疫苗穩定性好，易于保存運輸，生產過程簡單，可避免其他外原因子的污染。近年，隨著技術的不斷進步和發展，基因工程疫苗也得到快速的發展，如嵌合疫苗、轉基因疫苗和亞單位疫苗等。最初源于新德里一名治愈兒童的體內分離的一株減毒的RV[20]。是印度自主研制的RV疫苗，即單價人一牛重配疫苗[21]。第一代輪狀病毒疫苗是恒河猴人類重組輪狀病毒四價疫苗，但由于接種疫苗后很容易在短時間內發生腸套疊，因此禁止接種。出于這個原因，科學家已經開發出單價和重組減毒疫苗、轉基因植物口服疫苗和亞單位疫苗。

世界范圍內唯一的商品化BRV減毒疫苗（NCDV-lincoln株）已經獲得USDA的批文[22]。目前印度血一清研究所與國家過敏研究所合作開發了含有輪狀病毒人牛（UK）重組血清型G1、G2、G3、G4和G9的輪狀病毒五價疫苗（BRV-PV）。疫苗接受了動物研究以及成人，幼兒和嬰兒的Ⅰ期和Ⅱ期研究。研究證實該疫苗安全性好，且具有良好的免疫原性[23]。Anil K[24]等在成人中對該疫苗的安全性和耐受性進行了測試，結果顯示該疫苗在成人中安全并且耐受性良好。接下來在嬰幼兒人群中進一步測試疫苗以進一步評估。

此外疫苗的研究還面臨巨大的挑戰。首先，疫苗的安全性是最為關鍵的問題。不僅僅是對被免疫動物起到保護，不發生腸套疊等安全問題。而且還要防止被免疫動物對外排毒所造成的一系列問題。其次，疫苗的保護效果也是一項艱巨的任務。流行毒株的不同、季節的變化、區域的差異以及被免疫動物的年齡、體重、的不同，都會導致疫苗保護效果產生巨大的差異。

7 藥物研發

牛輪狀病毒在全球的廣泛流行及其居高不下的患病率，使治療牛輪狀病毒藥物的研發勢在必行。根據該病的發病原因和造成的癥狀來研制治療該病的藥物。例如在調節電解質平衡、抑制病毒的復制、調節微生物的平衡、提高感染動物免疫力、保護腸道黏膜以及中醫的調理等方面進行藥物的研發。一方面，通過阻斷該病發生過程中的各個階段來阻止該病的發生，另一個方面，通過提高動物自身抵抗病毒的能力達到對該病的預防。如病毒需要通過內吞途徑進入細胞，該途徑將病毒顆粒遞送至稱為早期內體（EEs）的囊泡細胞器。一些病毒從EEs到達細胞質，其他病毒進入細胞更深處。Diaz-Salinas MA等證明大多數BRV株必須流向LE，該機制顯示由甘露糖-6-磷酸受體介導的從高爾基復合體到LE的內溶酶體蛋白酶的運輸對于病毒退出囊泡隔室是必需的，并且可有效地啟動病毒復制，這種病毒的入侵機制與病毒蛋白VP4有關[25]。

8 結束語

隨著科學技術的不斷進步，人們對牛輪狀病毒的了解不斷加深，對該病的檢測技術愈加的準確快捷，疫苗的研發和治療藥物的研制逐漸深入，該病造成的經濟損失程度正在逐漸的降低。但是要徹底的治療直至清除該病毒，還需要各個方面科研人員目標一致，齊心協力地去完成這項艱巨的任務。

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基金項目：吉林省科技廳產業技術創新戰田部聯盟項目（20170309002NY）;國家重點研發計劃：畜禽重大疫病防控于高效安全養殖綜合技術研發（2016YFD0500907）

作者簡介：劉占悝（1996-），男，漢族，河南洛陽人，碩士研究生，研究方向：獸醫。

通信作者：郭利。