常壓低溫等離子處理提高花生分離蛋白水合性質的研究

季 慧 陳 野

(臨沂大學生命科學學院1，臨沂 276000)(天津科技大學食品工程與生物技術學院；教育部食品營養與安全實驗室2，天津 300457)

脫脂花生粉是花生提取花生油后的副產品,含有高質量的蛋白質(47～55%)和低劑量的抗營養因子。然而，脫脂花生粉由于其溶解度及其它功能性質較差，主要用作動物飼料，而未得到廣泛應用?；ㄉ蛛x蛋白(PPI)蛋白質含量較高(> 85%), 其功能性質中乳化性能、發泡和凝膠特性等，與如大豆蛋白等相比，仍然具有較大差距[1]。溶解度是蛋白質最重要的特性之一，它會影響蛋白質的其他功能特性。改善花生分離蛋白的溶解性能對提高其在食品工業中的應用至關重要。

為了提高花生蛋白的溶解特性，國內外專家對花生蛋白的功能特性進行了一系列的物理和化學改性研究，其中包括酶解、高壓、超聲波處理、微射流、微波和糖基化處理[2-5]。這些方法確實可以在不同程度地提高了花生蛋白的溶解性能，但容易引起反應產物復雜、熱變性和食品安全性問題未被廣泛應用。

常壓低溫等離子體(ACP)是一種全新的、無危害、無熱、高技術、前景廣闊的高新技術，目前在食品工業中備受關注。ACP被稱為非熱能電子，因為電能產生的高能電子直接作用于等離子體的電子元件，使得等離子體的處理組分保持在室溫[6]。低溫等離子改性蛋白的研究是近年來蛋白質改性研究的熱點之一。ACP處理使乳清蛋白、小麥粉、玉米醇溶蛋白等的功能特性(蛋白乳化活性、溶解度、泡沫穩定性)發生變化[7-9]。然而，通過ACP技術對花生蛋白粉進行改性，特別是水合性質的研究報道卻很少。Sinha[10]報道了等離子體修飾可以在高能離子轟擊下蝕刻高分子材料表面，并誘導一些極性自由基。因此，推測低溫等離子可以形成或暴露更多親水性的蛋白質基團，增加與水結合的位點，提高蛋白水合性質。本實驗在研究低溫等離子對花生分離蛋白粉末的水合性質的影響，以期探索提高蛋白溶解度的機理，為利用花生分離蛋白制備可控藥物緩釋載體蛋白水凝膠，新型高保水工業材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

低溫花生粕；血清白蛋白；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DBD-50低溫等離子體；PQ001核磁共振分析儀；F-4500熒光分光光度計；NicoletiS50傅立葉變換紅外光譜儀。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生分離蛋白的制備

參照Ji 等[11]的方法，提取花生分離蛋白，PPI的蛋白質質量分數為 83.0% (凱氏常數：5.46)。

1.3.2 低溫等離子處理樣品

將花生分離蛋白粉末過 80 目篩以保證顆粒大小的均勻性。稱取1.0 g左右的花生分離蛋白粉均勻平鋪于石英反應槽內，固定放電電壓到為 70 V，電流保持在(1.0±0.2)A，分別處理1、3、5、7、10 min，處理溫度為 25 ℃，得到不同處理時長的花生分離蛋白粉末樣品。

1.3.3 溶解度測定

根據Kong等[12]的方法，取1.00 g低溫等離子處理后的花生分離蛋白粉溶于100 mL 0.1 mol/LPBS (pH=7)溶液中充分溶解后，在3 000 r /min下離心15 min。取1 mL上清液加入4 ml雙縮脲試劑，旋渦充分混合。反應30 min后，在540 nm下測定溶液的吸光度，不添加花生分離蛋白的樣品為空白。

1.3.4 凝膠的制備

將低溫等離子處理后的花生分離蛋白用含有 0.06 mol/L CaCl2，0.1 mol/L 的 PBS 緩沖液(pH=7.0)充分溶解，將其濃度調至 150 mg/mL 后，分別稱取50 g的蛋白液于100 mL燒杯中，用保鮮膜密封，放入90 ℃水浴鍋中保溫60 min后，立即取出冷水浴后，于4 ℃冰箱中放置 24 h后，進行后續指標測定。

1.3.5 凝膠持水性測定

稱取蛋白凝膠樣5 g左右，于15 mL干燥并已稱重的離心管(記離心管的重量為W0)中，凝膠樣品和離心管的總重量為W1。8 000 r/min 離心 15 min，將析出的水倒掉，并使用濾紙吸取殘留的水分后，稱重并記錄此時凝膠樣品和離心管的總質量(W2)。凝膠持水能力(WHC)采用以下公式計算：

1.3.6 核磁共振分析

采用低場NMR 弛豫測定凝膠樣品的橫向弛豫時間 T2，測定條件：質子共振頻率為 22.6 MHz，測量溫度為 32 ℃。取2花生蛋白凝膠直接放入直徑25 mm核磁管中，隨后立即放入PQ-001 核磁共振儀中進行分析。采 用 Carr-Purcell- Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列進行自旋-自旋弛豫時間 T2、T2峰面積比的測定。參數設定：Tw=2 000 ms; NS=8; NECH=10 000。

1.3.7 表面疏水性(H0)的測定

采用 ANS(1-苯胺基-8-萘磺酸)熒光探針法[13]，用 0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液(pH7.0)配制不同濃度的樣品蛋白溶液(0.005%～0.2%)和 8 mmol/L的ANS溶液。取20 μL ANS 溶液加到4 mL蛋白溶液中，混合均勻，迅速測定混合液的熒光強度，激發波長和發射波長分別為 390 nm 和 470 nm，以熒光強度對蛋白質濃度作圖，直線斜率即為蛋白質樣品的表面疏水性指數(H0)。

1.3.8 傅里葉紅外光譜分析

準確稱量 0.001 g 花生蛋白樣品，加入一定量的KBr至0.15 g，用研缽研磨成均勻粉末，壓制成薄片，用傅里葉紅外光譜儀做全波段掃描 (4 000 cm-1～400 cm-1) ，掃描次數為32[14]。

1.3.9 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用還原型聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)方法鑒定低溫等離子處理前后花生分離蛋白中亞基的變化情況[15]。分離膠和濃縮膠的濃度分別為 12%和 4%，樣品中加入 1 mmol/L β-巰基乙醇。電泳后，蛋白膠用考馬斯亮藍 R250 染色。

2 結果與討論

2.1 水合特性

2.1.1 花生分離蛋白(PPI)溶解度的變化

圖1 低溫等離子處理對花生分離蛋白溶解度的影響

為了分析PPI的溶解度的變化，將未處理(對照)和ACP處理的PPI的溶解度和pH值繪制在圖1中。由圖1可以看出，隨著ACP處理時間的增加，蛋白的溶解度逐步提高，在處理7 min時，花生分離蛋白的溶解度與未處理時樣品相比增加9.74%，處理7 min后略有下降，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0) pH總體不變略有下降。ACP產生的高能粒子的蝕刻作用可以使蛋白比表面積增加，更多的活性位點被暴露，蛋白親水性增強，PPI的溶解度增加。7 min處理后PPI溶解度下降可能是隨著處理時間的持續延長，蛋白部分變性而聚集，蛋白溶解度降低。

2.1.2 PPI凝膠化性能

2.1.2.1 PPI凝膠持水能力(WHC)

WHC是評價蛋白質凝膠中持水能力的重要參數。WHC可以反映凝膠內部結構的粗糙度[16]。低溫等離子處理后的PPI凝膠體系的WHC如圖2所示。低溫等離子處理后，蛋白凝膠持水性隨著處理時間的延長而增加，處理3 min時，PPI凝膠的WHC達最高，從20.09%(0 min)增加到22.90%(3 min)，比未處理的樣品高出13.99%; 3 min后隨ACP處理時間的延長WHC下降。

圖2 低溫等離子處理對花生蛋白凝膠持水性的影響

2.1.2.2 核磁共振分析

注：從上到下代表處理時間分別為3、1、5、7、10.0 min圖3 低溫等離子處理對花生蛋白凝膠弛豫時間分布影響

從圖3、表1可以看出，花生蛋白凝膠的T2在0.1～2 000 ms的弛豫時間分布上均出現了3 種峰，分別用T2b、T21和T22表示，其水分分布與豆腐相似[17]。T22表示花生蛋白凝膠網絡以外可以自由移動的水，受蛋白凝膠網絡的影響最小，稱為自由水[18]。 T21(中間水分)代表分布在蛋白凝膠網絡表面的水分子，受蛋白凝膠的氫鍵、疏水相互作用和靜電相互作用的影響，T21峰面積比例與WHC呈正相關。 T2b表示與蛋白質等大分子表面的極性基團以氫鍵相結合的單層水，以及位于大分子固有結構的質子，與WHC相關性最小[19]。

表1 低溫等離子處理時間對不同峰面積比例的影響

注：同一列數據標注不同字母表示數據間有顯著性差異(P<0.05)。

隨著ACP處理時間的延長，T21的峰面積所占比例逐漸增大，在ACP處理3 min時，T21的峰面積比例達最大，從80.4%(0 min)上升到84.9%(3 min), 峰面積比例增加了5.6%。(圖3、表1)。結果顯示ACP處理可以明顯增加蛋白質凝膠網絡表面的水基團數量。3 min后，T21的峰面積略有下降，其趨勢與WHC 變化趨勢一致。

2.2 花生分離蛋白表面疏水性的影響(H0)

疏水力被認為是維持蛋白質高級結構的主要作用力，在三級結構的形成和穩定中起著重要作用[20]。低溫等離子處理可能引起花生分離蛋白表面疏水區域分布的變化。以ANS為熒光探針，對花生蛋白表面疏水性的變化進行表征。從圖4中可以看出, 在等離子處理前3 min內，花生分離蛋白表面疏水性指數(H0)顯著降低(P<0.05)，H0從 9 978 ±328.4(0 min)下降到4 397±288.4(3 min)，3 min后H0值明顯增加，但在處理7 min內，H0均低于未處理樣品。

圖4 低溫等離子處理對花生分離蛋白表面疏水性指數影響

等離子處理3 min內，H0逐漸下降，說明花生分離蛋白的親水性增強，疏水性相互作用減弱，大量的水被結合到蛋白表面，該結果與花生分離蛋白的凝膠持水性(WHC)變化趨勢一致。處理3 min后表面疏水性的增加可能是由于高能粒子轟擊后，蛋白分子結構展開，表面分子間疏水性增加。

2.3 花生分離蛋白的二級結構

選取紅外光譜中的酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm-1)進行詳細研究，用Omnic軟件用對蛋白質各二級結構進行定量分析。對應于二級結構的譜帶如下：1 650～1 670 cm-1對應于α-螺旋，1 610～1 640 cm-1對應于β-折疊，1 660～1 700 cm-1對應于β-轉角，1 640～1 650 cm-1對應于無規則卷曲。每個二級結構組分的百分比通過相應峰的面積來計算[21]。蛋白質各二級結構進行定量分析結果如表2。

表2 低溫等離子處理時間對花生蛋白二級結構的影響

從表2可以看出, 在等離子處理的前3 min內，α-螺旋和β-轉角所占比例呈上升趨勢，β-折疊呈明顯的下降趨勢,從32.34% (0 min)下降至24.00% (3 min)。二級結構的變化與Dong等[9]和Ji等[11]報道一致。結果表明,β-折疊變成α-螺旋和β-轉角, 蛋白分子間氫鍵增強，可能是由于低溫等離子處理產生的高能粒子(氧化劑)使花生分離蛋白的二級結構變緊密。Safonov等[22]的研究表明，花生分離蛋白較穩定的二級結構的形成可能與臭氧有關。處理3 min后, β-折疊和無規卷曲比例的增加,α-螺旋和β-轉角的下降，預示著花生分離蛋白的結構由緊密變松散。

圖5 等離子處理后花生分離蛋白的SDS-PAGE圖

2.4 SDS-PAGE結果

由圖5可知，花生蛋白亞基的電泳圖譜包含5個主要類別：伴花生球蛋白(>50 ku)、酸性花生球蛋白(38～49.9 ku)、中分子量蛋白質(23～37.9ku)、堿性花生球蛋白(18～22.9 ku)、低分子量的花生球蛋白(14～17.9 ku)。與未處理的花生分離蛋白相比，等離子處理并沒有引起蛋白質電泳圖譜的重大變化，表明低溫等離子處理花生分離蛋白粉末并沒有改變花生蛋白的一級結構。

3 結論

低溫等離子處理能顯著改善花生分離蛋白粉的水合性能。處理7 min時，花生分離蛋白溶解度最大，與未處理相比提高了9.74%; ，處理3 min時，花生分離蛋白的凝膠持水性達最高，比未處理的樣品高出13.99%。同時，花生分離蛋白表面疏水性降低，親水性增強。