中國鱟幾丁質酶的酶學性質研究

林建城，王麗英，林娟娟

( 莆田學院 環境與生物工程學院，福建省新型污染物生態毒理效應與控制重點實驗室，福建 莆田 351100 )

Broadway等[1]根據幾丁質酶作用機理不同，認為其至少包含內切幾丁質酶(EC3.2.1.14)、外切幾丁質酶和具外切酶性質的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52，NAGase)等3種組分。微生物幾丁質酶已受到廣泛關注[2]，它能夠將真菌細胞壁、昆蟲體表和圍食膜的幾丁質成分水解為幾丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖，從而能有效抑制真菌的生長和加速害蟲的死亡進程[3]；而在甲殼動物的生長中必須經過一個周期性的動態生理過程——蛻皮[4]，近年研究發現甲殼動物幾丁質酶與其周期性蛻皮生理之間存在相關性[5]。Buchholz[6]研究表明，南極磷蝦(Euphausiasuperba)蛻皮與外殼幾丁質酶活力變化相關，在蛻皮前短時間內，內切幾丁質酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶大量合成，酶活力迅速提高，用于降解蝦幾丁質表皮；樸順金等[7]在研究不同養殖期凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)外殼膜N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的性質中也發現，在蝦幼體和生殖期時，由于蛻殼頻繁，蝦外殼膜N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶比活力會迅速升高。而Koga等[8]從家蠶(Bombyxmori)的表皮層中獲得N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶，發現蠶表皮N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶與其周期性的蛻皮生理、以及生活周期中蛹的形成密切相關。Arakane等[9]也發現昆蟲內切幾丁質酶可將其自身幾丁質表皮降解為殼寡糖，再由外切幾丁質酶繼續降解為N-乙酰氨基葡萄糖單體，并用以形成新的表皮。此后，王佩等[10]研究表明，日本沼蝦幾丁質酶基因-3的表達水平以蛻皮前期最為顯著，從而推測與幾丁質酶參與蝦舊殼的降解和新殼的形成有關，進一步證明了幾丁質酶在甲殼動物蛻皮生理中起重要作用。

中國鱟(Tachypleustridentatus)屬節肢動物門、肢口綱、劍尾目，由于海域環境破壞和人類捕殺等原因，已成為瀕危物種，是國家二級保護動物。隨著沿海地區工業化的不斷推進，鱟賴以生存的海域環境受到嚴重破壞，擾亂了鱟的正常生理活動與物質代謝。有研究表明，溫度和鹽度都會影響中國鱟胚胎發育的速度和孵化率，其胚胎發育最適溫度為28 ℃，最適鹽度為20[11]；而Zn、Pb、Cu和Cd 4種重金屬離子對中國鱟的胚胎發育產生的影響不同，當4種重金屬離子濃度超過漁業水域水質標準濃度8倍時，Cd2+和Cu2+對鱟的胚胎發育無明顯影響，但Zn2+和Pb2+會使鱟胚胎發育中卵徑變小，發育速度下降[12]，說明海洋環境因子的變化直接影響中國鱟的胚胎發育和幼體生長。此外，有研究表明，溫度、酸堿度、金屬離子和有機溶劑等環境因素對節肢動物幾丁質酶會產生重要影響，并推測會影響節肢動物的蛻皮生理[13-15]。而在中國鱟的胚胎發育到性成熟期間，至少需經19次蛻皮，鱟蛻皮生理的變化直接影響鱟的正常生長發育。然而，中國鱟幾丁質酶的生理特性及環境因子對鱟幾丁質酶的影響，目前尚未見相關研究。之前研究已自中國鱟內臟中分離純化出N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶[16]，現繼續自中國鱟內臟中分離提取內切型幾丁質酶，探討其酶學性質，并研究環境因子對中國鱟幾丁質酶的影響，這對進一步揭示鱟幾丁質酶與蛻皮生理之間的相關性具有重要的作用，并為能更好地保護鱟資源，合理開發利用鱟資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

中國鱟購自莆田市城南市場。酶催化的底物對硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷，由上海醫藥工業研究院生化室合成；3,5-二硝基水楊酸為Fluka產品，標準物N-乙酰-D-氨基葡萄糖為Sigma產品，幾丁質購自中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司，其余化學試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 中國鱟幾丁質酶制劑的制備

取新鮮中國鱟內臟，以1∶3(m/V)浸泡在預冷的0.01 mol/L Tris-HCl(pH 5.4)緩沖液中，在高速組織搗碎機中破碎1 min，4 ℃抽提4 h以上，勻漿液于4 ℃，12 000 r/min，離心30 min，取上清液。上清液依次采用35%、75%飽和度的(NH4)2SO4分級分離，沉淀物經雙蒸餾水透析后于4 ℃、14 000 r/min 離心30 min，上清液為粗酶制劑。

1.2.2 膠體幾丁質的制備

將條狀幾丁質(甲殼素)在植物粉碎機下磨成細粉，10 g細粉幾丁質加入100 mL濃鹽酸，4 ℃下間隔攪拌24 h，倒入500 mL預冷蒸餾水中，放置48 h，4000 r/min下離心，沉淀用蒸餾水洗至中性，用的50 mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 5.4)配成5.0 mg/mL的膠體幾丁質。

1.2.3 中國鱟幾丁質酶活力的測定方法

中國鱟幾丁質酶活力測定方法參照文獻[13]，在0.5 mL的酶活力測定體系中含有50 mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 5.4)和5.0 mg/mL膠體幾丁質，55 ℃下預熱10 min，后加入50 μL的酶液，在55 ℃下反應30 min；以0.5 mL 0.5 mol/L的NaOH終止反應，離心，去沉淀，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL 3,5-二硝基水楊酸，煮沸5 min，靜置至室溫后，測定其光吸收值(A520nm)，以未加入酶制劑的為對照。以產物N-乙酰-D-氨基葡萄糖為標準物，制定標準曲線。以吸光值(y)為縱坐標，N-乙酰-D-氨基葡萄糖含量(x)為橫坐標，繪制標準曲線，得直線回歸方程：y=0.619x-0.151。

1個酶活力單位(U)定義為：每小時水解膠體幾丁質產生1 μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量。

1.2.4 中國鱟幾丁質酶最適pH和酸堿穩定性的測定

在酶活力測定體系中，測定不同pH(3.6～9.0)下中國鱟幾丁質酶活力，其中pH為3.6～5.8時選擇HAC-NaAC緩沖液，pH為5.8～7.6時采用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH為7.6～9.0時使用Tris-HCl緩沖液，3種緩沖液濃度均為50 mmol/L，酶活力最大的試驗組其pH值確定為酶的最適pH，其酶活力以100%表示，其余各試驗組酶活力則以相對酶活力表示。

將酶液分別與各種不同pH(3.6～9.0)的緩沖液混合，4 ℃下各預處理1 h，然后取50 μL處理過的酶液，在酶活力測定體系中測定酶經處理后的剩余酶活力，剩余酶活力最大的試驗組其酶活力以100%表示，其余試驗組的酶活力以相對酶活力表示，以分析幾丁質酶的酸堿穩定性。

相對酶活力/%=(a/amax)×100%

式中，a為各試驗組(剩余)酶活力，amax為各試驗組中最大(剩余)酶活力。

1.2.5 中國鱟幾丁質酶最適溫度和溫度穩定性的測定

在酶活力測定體系中，檢測不同溫度(20～90 ℃)下中國鱟幾丁質酶活力，酶活力最大的試驗組其溫度確定為酶的最適溫度，其酶活力以100%表示，其余試驗組的酶活力以相對酶活力表示。

將幾丁質酶液置于不同溫度(20～90 ℃)下預處理1 h，然后取50 μL經熱處理過的酶，在酶活力測定體系中測定酶經熱處理后的剩余酶活力，剩余酶活力最大的試驗組其酶活力以100%表示，其余試驗組的剩余酶活力以相對酶活力表示，以分析幾丁質酶的溫度穩定性。

1.2.6 中國鱟幾丁質酶催化幾丁質酶解的動力學參數測定

在幾丁質酶活力的測定體系中，改變底物膠體幾丁質的質量濃度，測定不同底物質量濃度[S](2.0～8.0 mg/mL)下幾丁質酶活力，采用Lineweave-Burk雙倒數作圖法，以反應初速度倒數(1/v)對底物質量濃度倒數(1/[S])作圖，求出中國鱟幾丁質酶的米氏常數(Km)和最大反應速度(Vmax)。

1.2.7 金屬離子對中國鱟幾丁質酶活力影響的測定

在上述幾丁質酶活力的測定體系中，分別加入0～20.0 mmol/L的Li2SO4、Na2SO4、NaCl、NaNO3和KNO3；0～5.0 mmol/L的MgSO4、CaCl2和BaCl2；0～20.0 mmol/L的FeSO4、CoCl2、NiCl2、CuSO4、ZnSO4、MnCl2、AlCl3、FeCl3、HgCl2、Pb(NO3)2和Cd(NO3)2；測定加入各金屬離子后的中國鱟幾丁質酶活力。以未添加金屬離子的對照組酶活力為100%，計算各試驗組的相對酶活力。

相對酶活力/%=(a/amax)×100%

式中，a為各試驗組酶活力，amax為對照組酶活力。

1.2.8 有機溶劑對中國鱟幾丁質酶活力影響的測定

在幾丁質酶測活體系中，分別加入0～50.0%體積分數的甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丙酮、二氧六環和二甲亞砜等7種有機溶劑，以未添加有機溶劑的對照組酶活力為100%，計算各試驗組的相對酶活力。

2 結果與分析

2.1 pH對中國鱟幾丁質酶活力的影響

由圖1可見，pH對中國鱟幾丁質酶活力的影響呈鐘罩型曲線變化，幾丁質酶最適pH為5.4，隨pH逐漸增大，幾丁質酶活力也不斷下降。

圖1 中國鱟幾丁質酶的最適pH

由圖2可見，幾丁質酶在pH 4.6～6.0的緩沖液中預處理1 h后，相對酶活力還保留在80.7%以上，說明幾丁質酶在pH 4.6～6.0內相對穩定，經pH 8.0緩沖液處理1 h后幾丁質酶相對活力僅有11.5%；而在pH≤4.4的緩沖液中處理后幾丁質酶活力也呈下降趨勢，說明該幾丁質酶對環境中酸堿度的變化敏感。

圖2 中國鱟幾丁質酶的酸堿穩定性

2.2 溫度對中國鱟幾丁質酶活力的影響

由圖3可見，中國鱟內臟幾丁質酶的最適溫度為55 ℃，之后隨溫度升高酶活力不斷下降，溫度達80 ℃時，酶活力剩余36.6%。

圖3 中國鱟幾丁質酶的最適溫度

由圖4可見，幾丁質酶在20～60 ℃預處理1 h后相對酶活力保持在88%以上，酶在65 ℃處理1 h相對酶活力還保留有79.8%，在90 ℃下處理1 h相對酶活力還剩34.3%，表明中國鱟內臟幾丁質酶具較好的熱穩定性。

2.3 中國鱟幾丁質酶米氏常數和最大反應速度的測定

Lineweaver-Burk雙倒數作圖(圖5)顯示，反應初速度倒數(y)與底物濃度倒數(x)的回歸方程為y=1.494x+0.687，求得催化膠體幾丁質底物水解的中國鱟幾丁質酶米氏常數為2.175 mg/mL，最大反應速度為1.456 μmol/(mL·min)。

圖4 中國鱟幾丁質酶的溫度穩定性

圖5 中國鱟幾丁質酶米氏常數米氏常數的測定

2.4 金屬離子對中國鱟幾丁質酶活力的影響

2.4.1 正一價金屬離子對酶活力的影響

2.4.2 堿土金屬離子對酶活力的影響

由圖6可見，在0～5.0 mmol/L濃度內，堿土金屬離子Ca2+和Ba2+對中國鱟幾丁質酶有微弱的激活作用，1.0 mmol/L Ca2+和Ba2+可分別使酶活力提高10.1%、11.3%，但Mg2+對中國鱟幾丁質酶活力影響不大。

2.4.3 過渡金屬離子對酶活力的影響

由圖7可見，過渡金屬離子Fe2+對中國鱟幾丁質酶活力影響不大；而Co2+在低濃度時對中國鱟幾丁質酶先表現為激活，后隨Co2+濃度增大逐漸轉為抑制作用，5 mmol/L Co2+可使幾丁質酶活力提高16.3%，而20 mmol/L Co2+則可使酶活力下降14.3%。Ni2+和Mn2+對中國鱟幾丁質酶活力均呈抑制作用，10 mmol/L的Ni2+和Mn2+可分別使幾丁質酶活力下降27.4%和41.6%。

圖6 正二價堿土金屬離子對中國鱟幾丁質酶活力的影響

圖7 過渡金屬離子對中國鱟幾丁質酶活力的影響

2.4.4 正三價金屬離子對酶的效應

由圖8可見，低濃度的Fe3+對中國鱟幾丁質酶有微弱的激活作用，但隨Fe3+濃度的增大對幾丁質酶反而有微弱的抑制作用，5 mmol/L Fe3+能使幾丁質酶活力提高4.3%，而20 mmol/L Fe3+對幾丁質酶抑制了9.2%。Al3+對中國鱟幾丁質酶活力具有一定的抑制作用，10 mmol/L的Al3+可使幾丁質酶活力下降18.6%。

2.4.5 重金屬離子對酶活力的影響

由圖9可見，低濃度的Cu2+對中國鱟幾丁質酶有微弱的激活作用，但隨Cu2+濃度的增大逐漸呈現出對幾丁質酶的抑制作用，10 mmol/L Cu2+能使幾丁質酶活力下降39.5%；而Cd2+、Pb2+、Zn2+和Hg2+等重金屬離子對中國鱟幾丁質酶均呈不同程度的抑制作用，10 mmol/L的Cd2+、Pb2+、Zn2+和Hg2+可分別使幾丁質酶活力抑制17.5%、23.9%、33.1%和83.0%，Hg2+對幾丁質酶的抑制作用最強。

圖8 Fe3+和Al3+對中國鱟幾丁質酶活力的影響

2.5 有機溶劑對中國鱟幾丁質酶活力的影響

由表1可見，甲醇、乙醇、異丙醇和正丙醇對中國鱟幾丁質酶均有抑制作用，抑制作用順序為甲醇>乙醇>異丙醇>正丙醇；丙酮對中國鱟幾丁質酶有一定的激活作用，10%體積分數的丙酮會使酶活力提高16.0%；二氧六環和二甲亞砜在低濃度時對中國鱟幾丁質酶有激活作用，隨濃度升高，對幾丁質酶轉為抑制作用，2%體積分數的二氧六環和二甲亞砜可分別使幾丁質酶活力提高7.7%和14.5%，而其在30%體積分數時，可分別使幾丁質酶活力下降11.3%和23.1%。

圖9 重金屬離子對中國鱟幾丁質酶活力的影響

表1 7種有機溶劑對中國鱟幾丁質酶相對酶活力的影響 %

3 討 論

3.1 幾丁質酶的穩定性

不同來源的幾丁質酶對酸堿敏感度不同。凡納濱對蝦[15]幾丁質酶酸堿穩定性區域為pH 4.6～7.0；而蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensisssp.colmeri)15A3[3]幾丁質酶B酸堿穩定在pH 4.0～8.0。馮金榮等[17]研究的伊薩酵母(Issatchenkiaterricola)幾丁質酶在pH 5.0～9.0內較為穩定，pH超出此范圍，酶將迅速失活。在本研究中，中國鱟幾丁質酶在pH 4.6～6.0內較為穩定，在pH>6.5和pH<4.5下酶失活加快，對酸堿較為敏感。

蠶蛹(Bombyxmori)[18]幾丁質酶在溫度45 ℃以上時酶失活速度加快；毛殼菌(Chaetomiumsp.)YMF1.00843[19]幾丁質酶在溫度高于40 ℃時易失活，酶穩定性較差。Kopparapu等[20]也從石榴(Punicagranatum)果汁中分離純化到一種熱穩定性很好的幾丁質酶，溫度在65 ℃內酶基本穩定。而中國鱟幾丁質酶則具有較好的熱穩定性，在20～60 ℃溫度內酶基本穩定，60 ℃處理1 h后酶活力還保留88%，相比中國鱟外切型幾丁質酶——N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶，溫度穩定性范圍為20～50 ℃，兩者最適溫度均為55 ℃[16]，因此，在鱟幼體生長的適宜水溫(30 ℃左右)下，中國鱟內切和外切幾丁質酶活力均較低。

3.2 金屬離子對幾丁質酶的影響

Li+和K+對海洋微生物短芽孢桿菌(Brevibacillussp.)Bsp1[21]幾丁質酶活性有不同程度的激活作用，可分別使酶活力提高17%和3%，Na+對其又有微弱的抑制作用；而Li+對蘇云金芽孢桿菌[3]幾丁質酶B則呈現一定的抑制作用，Na+對其又有微弱的激活效應。此外，Na+和K+對中華根瘤菌(Sinorhizobiumsp.)L03[22]幾丁質酶活性有不同程度的抑制作用；5 mmol/L Na+和K+可分別使疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)[23]幾丁質酶活力提高45.6%和30.4%。本試驗結果顯示，K+、Na+和Li+對中國鱟幾丁質酶幾乎沒有影響。

堿土金屬離子常對酶呈激活效應。Ca2+和Mg2+對毛殼菌[19]和芽孢桿菌(Bacillussp.)Hu1[24]幾丁質酶均有激活作用；50 mmol/L Mg2+和Ba2+可顯著提高中華根瘤菌[22]幾丁質酶的活性，Ca2+對其則呈現抑制作用。而Ca2+和Ba2+對凡納濱對蝦[15]幾丁質酶活性也有一定激活作用，Mg2+對其卻沒有影響，這與本試驗結果相似，1.0 mmol/L Ca2+和Ba2+可分別使中國鱟幾丁質酶活力提高10.1%和11.3%，但Mg2+對酶活力影響不大。

過渡金屬離子對酶活性的影響呈現多樣性。Fe2+、Mn2+和Co2+對黏質沙雷氏菌(Serratiamarcesens)[25]幾丁質酶有不同效應，Fe2+表現明顯的抑制作用，Mn2+有微弱激活作用，Co2+又幾乎沒有影響；5 mmol/L Co2+可以使短芽孢桿菌[21]幾丁質酶活性提高1.4倍，Ni2+對其則表現為抑制作用；而5 mmol/L濃度的Mn2+、Co2+和Fe2+對重組幾丁質酶rchiGR52-1[26]均有明顯的抑制作用，Ni2+對其又具有一定的促進作用。在本試驗中，Fe2+對中國鱟幾丁質酶活力影響不大，低濃度Co2+對酶表現為激活效應，之后隨濃度增大轉為抑制作用，Ni2+和Mn2+對酶具有不同程度的抑制作用。

Fe3+對毛殼菌[19]幾丁質酶影響不大，對蘇云金芽孢桿菌[3]幾丁質酶B活性有促進作用，但又強烈抑制中華根瘤菌[22]幾丁質酶的活性。在本試驗中，低濃度Fe3+對中國鱟幾丁質酶有微弱的激活效應，后隨濃度增大轉為抑制作用。此外，10 mmol/L Al3+可分別使蠶蛹[18]和凡納濱對蝦[15]幾丁質酶失活5.2%和14.2%，在同樣濃度下，Al3+可使中國鱟幾丁質酶失活18.6%。

重金屬經常是酶的抑制劑。Zn2+、Cu2+和Hg2+能強烈抑制短芽孢桿菌[21]幾丁質酶活性；10 mmol/L Cu2+、Zn2+和Cd2+可分別使黏質沙雷氏菌[25]幾丁質酶失活17.4%、28%和26.7%；Zn2+和Hg2+也可分別抑制疏綿狀嗜熱絲孢菌[23]幾丁質酶活性；10 mmol/L Hg2+和Pb2+可使宛氏擬青霉(Paecilomycesvariotii)DG-3[27]產生的胞外幾丁質酶(Chi46)完全失活；而凡納濱對蝦[15]幾丁質酶在10 mmol/L的Cd2+、Pb2+和Hg2+中可分別失活11.7%、35.0%和95.6%。本試驗結果表明，低濃度Cu2+對中國鱟幾丁質酶表現為激活效應，后隨濃度增大轉為抑制作用，Cd2+、Pb2+、Zn2+和Hg2+對幾丁質酶抑制作用順序為Hg2+>Zn2+>Pb2+>Cd2+，10 mmol/L Hg2+可使幾丁質酶活力喪失83.0%。

目前，金屬離子對內切型幾丁質酶的影響機制研究報道較少，但對具有外切酶性質的幾丁質酶——N-乙酰β-D-氨基葡萄糖苷酶的影響機理研究較多。有研究表明，Hg2+對凡納濱對蝦[28]N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制屬于不可逆抑制，底物對Hg2+的抑制還具有保護作用，且Hg2+是通過與半胱氨酸的巰基共價結合從而導致酶失活的；而Zn2+對凡納濱對蝦N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制則表現為可逆的非競爭性抑制作用，Zn2+可能是與N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶蛋白的組氨酸或半胱氨酸結合，導致酶蛋白構象的變化，從而引起酶的失活[29]；但是，Zn2+對擬穴青蟹(Scyllaserrata)[14]N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的抑制則是一種可逆的混合型抑制作用；此外，Cd2+對尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[30]精巢N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶具有較強抑制作用，抑制類型屬于競爭性抑制作用；但CuSO4對該酶的抑制則表現為非競爭性的抑制作用[31]。

因此，不同金屬離子對幾丁質酶有不同的影響，同一種金屬離子對不同來源的幾丁質酶效應也不同。

3.3 有機溶劑對幾丁質酶的影響

酶依賴其活性中心與底物結合并產生催化反應，有機溶劑能滲透入酶的活性中心，降低活性中心的極性，從而增加酶與底物的靜電斥力，降低了酶與底物的結合能力。因為不同有機溶劑的極性大小不同，必然對酶呈現不同的影響效應。本試驗結果顯示，甲醇、乙醇、異丙醇和正丙醇等4種有機溶劑對中國鱟幾丁質酶均呈現抑制作用，其抑制作用的強弱與4種有機溶劑的極性大小(甲醇>乙醇>異丙醇>正丙醇)呈正相關，其中甲醇極性大，對幾丁質酶的抑制作用最強。甲醇、乙醇和正丙醇對凡納濱對蝦[13]體壁幾丁質酶也有類似的抑制作用。

丙酮對蘇云金芽孢桿菌[32]幾丁質酶活力有較強的激活作用，激活效果在2.5%～25%的體積分數內與體積分數成正相關；而在0～50%體積分數內，丙酮對凡納濱對蝦[13]幾丁質酶也呈激活作用。本試驗中，丙酮也同樣具有促進中國鱟幾丁質酶活力的作用。丙酮是非質子極性溶劑，酶蛋白與溶劑之間直接接觸，蛋白質分子的表面結構有所變化，這些變化可能使幾丁質酶活性中心的柔性增強，有利于酶功能的發揮。

有研究表明，低體積分數的二氧六環和二甲亞砜對凡納濱對蝦[13]幾丁質酶有激活作用，且隨體積分數升高激活作用減弱并逐漸轉為抑制作用，與本試驗中二氧六環和二甲亞砜對中國鱟幾丁質酶的影響效應相似。二甲亞砜對蘇云金芽孢桿菌[32]幾丁質酶也表現為先激活后抑制的效應；但是，二氧六環在體積分數小于5%時，對蘇云金芽孢桿菌[32]幾丁質酶的影響不明顯，當體積分數大于5%時，對酶開始呈現激活作用。