酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶研究進展

潘 超，高慶超，梁 穎，3，張志勇，3，李亞輝，3*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212001；2.江蘇省農業科學院 農產品質量安全與營養研究所，江蘇 南京 210014；3.江蘇省農業科學院江蘇省食品質量安全重點實驗室，江蘇 南京 210014）

香氣是評價葡萄酒品質的重要指標[1]。萜烯類化合物，尤其是單萜烯，是構成不同品種葡萄典型香氣的重要化合物[2]。葡萄酒中的萜烯類化合物大多以糖苷的形式存在，降解之后可釋放出揮發性香氣物質，因此糖苷被稱為香氣前體物[3]。糖苷的降解主要通過酸解或酶解實現，實際生產中一般采用酶解的方法來降解糖苷[4]。

糖苷酶是降解糖苷物質的主要酶類，對葡萄酒香氣的改善具有十分重要的作用[1]。糖苷酶廣泛存在于各種微生物中，在葡萄酒發酵中，酵母菌的糖苷酶含量少、活性低，因此大部分糖苷仍留在葡萄酒中[5]。研究表明，酒類酒球菌（Oenococcus oeni）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和片球菌（Pediococcus claussen）等乳酸菌都具有較高的糖苷酶活性[6]。雙糖苷首先在α-L-阿拉伯糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶或β-D-芹菜糖苷酶作用下產生單糖苷，然后單糖苷在β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）EC 3.2.1.21作用下降解產生香氣物質和葡萄糖；而單糖苷直接在β-葡萄糖苷酶作用下降解釋放出香氣物質和葡萄糖[7-8]。因此β-葡萄糖苷酶是降解糖苷產生香氣物質的關鍵酶[9-11]。

葡萄酒釀造主要包括由酵母菌完成的乙醇發酵和由乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）完成的蘋果酸乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）[12-13]。蘋果酸乳酸發酵是葡萄酒釀造中繼乙醇發酵后重要的二次發酵，在葡萄酒釀造中具有降低酸度、提高生物穩定性和增加葡萄酒香氣、改善葡萄酒風味等作用，是葡萄酒生產中的重要步驟[1，14]。酒類酒球菌是蘋果酸-乳酸發酵的主要啟動者和執行者[3]。

酒類酒球菌是葡萄酒釀造中的重要乳酸菌，β-葡萄糖苷酶是結合態香氣前體物質糖苷降解的關鍵酶，由于兩者在葡萄酒釀造中的重要作用，越來越多的學者對酒類酒球菌的β-葡萄糖苷酶進行了研究。國外許多研究機構致力于β-葡萄糖苷酶的分子生物學研究，從基礎領域研究酶的催化機制及表達調控機制[15-17]；國內近年來對β-葡萄糖苷酶的研究逐漸成為熱點，已由過去的研究β-葡萄糖苷酶的簡單提取到現在的酶的培養條件優化以及粗酶液的純化，β-葡萄糖苷酶基因的克隆表達也已得到實現[18]。

本文簡單介紹了β-葡萄糖苷酶的定義、分類、作用機制和測定方法，闡述了酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活，探討了pH值、發酵溫度、乙醇濃度、糖含量和二氧化硫含量對酶活的影響，并在分子生物學水平上研究了酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶基因，并對酒類酒球菌葡萄糖苷酶未來的研究熱點和研究方向進行了展望。

1 β-葡萄糖苷酶

1.1 β-葡萄糖苷酶定義和分類

糖苷酶是自然界中最豐富的酶類之一，糖苷酶是一類以內切或外切方式水解各種含糖化合物中的糖苷鍵生成單糖、寡糖或糖復合物的酶[15]。β-葡萄糖苷酶是一種重要的糖苷酶。1837年，LIEBIGH和WOHLER在苦杏仁中首次發現，因此又被稱為苦杏仁苷酶、龍膽二糖酶、纖維二糖酶和β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，是纖維素分解酶系中的重要組成成分，屬于纖維素酶類，是能夠催化水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖糖苷鍵，釋放出β-D-葡萄糖和相應配基的一種酶[15]。

在碳水化合物活性酶數據庫（carbohydrate-active enzymes database，CAZy）中，β-葡萄糖苷酶被歸類為糖苷水解酶家族[19-20]，其主要功能為降解糖苷鍵。依據氨基酸序列的同源性和結構的相似性，已知的β-葡萄糖苷酶被分為GH1、GH3、GH5、GH9、GH30和GH116等6個家族，微生物來源的β-葡萄糖苷酶主要屬于GH1和GH3，真菌來源的β-葡萄糖苷酶主要屬于GH3家族[15]。

1.2 β-葡萄糖苷酶作用機制

葡萄與葡萄酒中的糖苷一般分為單糖苷和雙糖苷，極少見三糖苷[9]。單糖苷風味前體物酶解，主要是在β-葡萄糖苷酶作用下，移除β-D-葡萄糖后釋放出具有揮發性香氣物質[21]。雙糖苷的酶解可分為一步酶解法和兩步酶解法（見圖1）[22]。一步酶解法中，雙糖苷在β-葡萄糖苷酶作用下直接生產二糖和揮發性香氣物質；兩步酶解法中，首先末端糖與β-D-葡萄糖之間的糖苷鍵在α-阿拉伯糖苷酶、β-洋芹糖苷酶或β-鼠李糖苷酶的作用下裂解，釋放出相應的單糖和β-葡萄糖單糖苷，然后單糖苷再在β-葡萄糖苷酶作用下降解產生β-D-葡萄糖和揮發性香氣物質。β-葡萄糖苷酶是糖苷水解過程中的關鍵酶，對香氣物質的釋放起著重要作用。

圖1 雙糖苷酶解示意圖Fig.1 Schematic diagram of enzymatic hydrolysis of diglycoside

1.3 β-葡萄糖苷酶酶活測定方法

測定β-葡萄糖苷酶酶活的方法主要有分光光度法、熒光法、京尼平苷顯色法和比色法等[23-24]。

分光光度法是以水楊苷作為底物，將水楊苷裂解為水楊醇和葡萄糖，然后利用分光光度計對水楊醇和葡萄糖進行比色測定。此方法反應容易遭受干擾，檢測的靈敏度也不是很高，因此不是目前測定葡萄糖苷酶的常用方法[25]。

熒光法是用4-甲基傘形酮葡萄糖苷作為底物，經酶解后產生4-甲基傘形酮，通過測定酶解出的4-甲基傘形酮的熒光吸光度來計算酶的活性。該方法靈敏度高且速度快，但由于實驗過程復雜、重現性低，且成本昂貴，因此應用較少[26]。

京尼平苷顯色法是對京尼平苷水解后產生的京尼平與氨基酸反應生成穩定的藍色進行測定的一種方法。此方法檢測結果穩定，操作簡單，但其靈敏度較低，且耗時比較長[27-28]。

比色法是目前應用最為普遍的方法，它以對硝基苯基β-D-葡萄糖苷（p-nitrophenyl-glycosides，pNPG）為底物，底物水解后釋放出的對硝基苯酚在波長400～420 nm可見光范圍內有特征吸收峰，可直接進行比色測定。該法操作簡單、快速，靈敏度高，且重現性好。

2 酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶酶活

蘋果酸-乳酸發酵可以顯著提升葡萄酒的香氣特征，提高葡萄酒的品質，酒類酒球菌是進行蘋果酸-乳酸發酵的主要微生物，多數研究結果顯示酒類酒球菌具有糖苷酶活性[29]。GUILLOUX-BENATIER M等[30]首次在人工合成的培養基中檢測到了葡萄酒釀造乳酸菌（主要是酒類酒球菌）的β-葡萄糖苷酶活性；VIVAS N等[31]研究發現酒類酒球菌能夠從二甲花翠素-3-葡萄糖苷中釋放二甲花翠素，進一步證明了酒類酒球菌具有β-葡萄糖苷酶活性；MCMAHON H等[32]篩選了7株酒類酒球菌商業菌株，在合成底物培養基中沒有檢測到β-葡萄糖苷酶活性，因此認為培養基的組成可能是誘導葡萄糖苷酶活性的重要因素。GRIMALDI A等[33]用合成底物pNPG檢測了12株商業酒類酒球菌的β-葡萄糖苷酶活性，發現11株酒類酒球菌的完整細胞和上清液中均不同程度的存在β-葡萄糖苷酶活性，并且在不同生長階段均存在酶活，此外，還檢測到了β-木糖苷酶活和α-阿拉伯糖苷酶活。GRIMALDI A等[34]還對其他22株商業酒類酒球菌菌株進行了檢測，發現均存在β-葡萄糖苷酶活，但不同菌株之間酶活存在一定差異。LóPEZ-SEIJAS J等[35]在研究的所有酒類酒球菌中都檢測到了β-糖苷酶活，并表明有助于改善和提高區分阿爾巴尼奧葡萄酒的芳香成分。LI Y等[36]用合成底物和天然底物分別評價了酒類酒球菌SD-2a和31MBR完整細胞的β-葡萄糖苷酶活性，并對其部分特性進行了研究。為更好地探明酒酒球菌SD-2a的增香能力，LI Y等[37]還分別測定了SD-2a不同部位和不同生長時期的β-葡萄糖苷酶活，證明了酒類酒球菌SD-2a潛在的增香潛力。SAGUIR F M等[38]研究表明，從阿根廷葡萄酒中分離出的大多數酒類酒球菌在蘋果酸乳酸發酵初期都可以檢測到葡萄糖苷酶活性。MATURANO C等[39]研究了3株本地酒類酒球菌菌株，發現均具有β-葡萄糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶和α-鼠李糖吡喃糖苷酶活性；陳其玲等[40]從酒類酒球菌自身耐酸能力的視角去分析評估菌株糖苷酶活性；FIA G等[41]采用熒光法測定了31株酒類酒球菌的β-葡萄糖苷酶活性，發現在MRS培養液中β-葡萄糖苷酶在完整細胞和上清液中的活性水平和分布具有強的菌株依賴性。關于β-葡萄糖苷酶在酒類酒球菌中的位置，MANSFIELD A K等[29]研究發現，酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶為胞外酶；而PéREZ-MARTíN F等[42]研究發現酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶為胞內酶；其他研究也發現酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶為胞內酶，且完整細胞也具有一定酶活[16，43-44]。這些研究表明了β-葡萄糖苷酶在酒類酒球菌中普遍存在，主要為胞內酶，酶活在不同菌株間有一定差異。

3 影響酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活性的因素

在蘋果酸乳酸發酵中影響酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活的因素主要有pH值、發酵溫度、乙醇濃度、糖含量和SO2含量等。

3.1 pH值對β-葡萄糖苷酶活性的影響

β-葡萄糖苷酶活性的最適pH值為5.0。MESAS J M等[43]在MRS培養基中觀察不同pH下酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活性的變化，發現最適pH值在5.0左右；楊芮等[45]在MRS培養基中研究了10株酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活性隨pH值變化，酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶酶活呈鐘罩形曲線，大部分菌株在pH值5.0時酶活最高；王玲等[46]在酸性番茄培養基（acidic tomato broth，ATB）中研究了pH值對兩株酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活酶活影響，發現最適pH值也在5.0左右。β-葡萄糖苷酶分子上帶有許多酸性、堿性氨基酸殘基，pH值能影響這些氨基酸殘基的解離狀態，可能改變酶的空間結構，或影響與底物的結合和進一步催化反應，進而影響酶的活性。

3.2 溫度對β-葡萄糖苷酶活性的影響

β-葡萄糖苷酶活性的最適溫度為40.0～45.0 ℃。MICHLMAYR H等[16]在MRS培養基中通過改變溫度來觀察酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活性變化，發現在45 ℃時酶活最高；楊芮等[45]研究了溫度對5株酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶酶活的影響，商業酒類酒球菌OENO2的酶活在44.9 ℃達到最大，其他菌株酶活在32～39.3 ℃之間達到最大，菌株OENO2的酶活在溫度高于44.9 ℃后迅速降低，其他菌株酶活在49 ℃時幾乎為零；MESAS J M等[43]觀察到，酒類酒球菌ST81的β-葡萄糖苷酶酶活在40 ℃時最高，在20～40 ℃范圍內酶活隨著溫度升高而升高，當溫度高于40 ℃時，酶活隨著溫度升高而降低。人們也對蘋果酸乳酸發酵中酒類酒球菌的β-葡萄糖苷酶活進行了研究，發現不同菌株酶活不同，酶活最適溫度也因菌株不同而具有一定差異[45]。

3.3 乙醇濃度對β-葡萄糖苷酶活性的影響

β-葡萄糖苷酶活性的最適乙醇體積分數為8%～16%。FIAG等[41]在MRS培養基中研究了乙醇對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活性的影響，發現低濃度乙醇對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶酶活有促進作用，當乙醇體積分數超過8%時，乙醇對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶具有抑制作用；LI Y等[36]研究了乙醇對酒類酒球菌SD-2a和31MBR完整細胞β-葡萄糖苷酶活的影響，結果表明，SD-2a在乙醇體積分數為0～16%時具有較高酶活，當乙醇體積分數為24%時仍具有一定酶活，而菌株31MBR在乙醇體積分數為16%～24%時表現出較高酶活，在20%時活性最高，且體積分數16%～20%的乙醇對菌株31MBR完整細胞β-葡萄糖苷酶活具有一定的促進作用，這可能是完整細胞對細胞內β-葡萄糖苷酶的保護作用引起的；DIEZ-OZAETA I等[47]研究發現，低濃度乙醇對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活影響較小，而體積分數12%～14%的乙醇使酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活顯著下降。以上研究結果表明，不同濃度乙醇對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活具有不同影響，低濃度乙醇對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活具有促進作用，高濃度乙醇則表現出抑制作用。低濃度乙醇的促進作用可能是因為乙醇能夠改變細胞膜的通透性，從而更容易獲得細胞內的酶和底物，高濃度乙醇的抑制作用可能是因為乙醇使酶蛋白變性，從而改變酶的結構引起的。

3.4 糖含量對β-葡萄糖苷酶活性的影響

關于糖含量對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活的影響，王玲等[46]研究發現，低質量濃度（0.1 g/L）葡萄糖對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活影響較小，當葡萄糖質量濃度為1.0 g/L時，菌株β-葡萄糖苷酶活迅速下降，當葡萄糖質量濃度為10 g/L時，酶活幾乎全部被抑制；楊芮等[45]研究了葡萄糖對10株酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活影響，結果表明，低濃度葡萄糖對酶活影響較小，當葡萄糖質量濃度為7.5 g/L時一些菌株的酶活被顯著抑制，高濃度質量葡萄糖（20 g/L）時大多數菌株的酶活都被強烈抑制。由此可見，糖含量對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活的影響存在菌株間差異。葡萄糖對β-葡萄糖苷酶活的抑制為非競爭性抑制，由于底物和抑制劑與酶的結合位點不同，酶可以同時與抑制劑和底物結合，這種結合引起糖苷酶分子構象變化，進而抑制酶活。

3.5 二氧化硫含量對β-葡萄糖苷酶活性的影響

目前關于pH值、溫度、糖和乙醇對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活的影響已有較多研究，而二氧化硫對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活影響的報道目前還較少。MATURANO C等[39]研究了二氧化硫對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活的影響，結果表明，在pH3.8條件下，80 mg/L二氧化硫對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活沒有影響；FIA G等[41]研究發現，增加游離二氧化硫質量濃度（0.2～0.6 mg/L），可使細菌生長和蘋果酸乳酸發酵減慢，對β-葡萄糖苷酶活也有一定抑制作用。這是因為分子二氧化硫可穿過細菌細胞膜，通過擴散進入細胞，抑制細胞生長并破壞細胞內部結構，從而抑制β-葡萄糖苷酶活。

3.6 各因素協同作用對β-葡萄糖苷酶活性的影響

通常情況下，不同因素間對β-葡萄糖苷酶酶活的影響還存在一定的協同作用。FIA G等[41]研究表明，在pH 3.4的葡萄酒中進行蘋果酸乳酸發酵，乙醇和二氧化硫表現出了協同抑制作用，這是導致β-葡萄糖苷酶活下降的根本原因；DIEZ-OZAETA I等[47]研究了pH和乙醇組合對β-葡萄糖苷酶活的影響，結果表明，pH和乙醇對酶活具有協同抑制效應，在一定乙醇濃度下，降低pH會導致酶活顯著下降。

4 酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶分子生物學研究

目前國內外主要利用基因工程和蛋白質工程來獲取高活性的β-葡萄糖苷酶。國內對β-葡萄糖苷酶的研究起步較晚，從酶的提取、分離、純化，已逐漸發展到對酶基因的研究，而國外對β-葡萄糖苷酶分子方面的研究已有較多報道。到目前為止，已有上百種不同來源（如動物、植物、微生物）的β-葡萄糖苷酶基因被成功克隆和測序[48]。酒類酒球菌PSU-1作為標準菌株，其全基因組已被測序，其中也包括β-葡萄糖苷酶基因的信息[49]。通過在美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數據庫中查找分析得到酒類酒球菌PSU-1共含有5個不同的β-葡萄糖苷酶基因，分別為OEOE_RS07570、OEOE_RS05830、OEOE_RS01060、OEOE_RS01630、EOE_RS01635，其中OEOE_RS07570編碼β-葡萄糖苷酶，其余4個基因編碼6-磷酸（P）-β-葡萄糖苷酶。關于酒類酒球菌這些葡萄糖苷酶基因目前已有較多研究。

APALDO A等[17]對葡萄糖苷酶基因OEOE_RS01060、OEOE_RS01630和OEOE_RS01635進行了克隆和表達，并對其酶活性進行了測定。楊世玲等[50]從酒類酒球菌中成功克隆出了β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS07570，并對其編碼的蛋白質進行了生物信息學分析，結果顯示該蛋白疏水性較弱，無信號肽，無跨膜區，屬于糖苷水解酶GH3。

楊世玲等[51]還對酒類酒球菌的6-P-β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS01060進行了克隆、測序，生物信息學分析顯示其編碼的蛋白質為可溶性酶，主要存在于細胞質內，屬于糖苷酶GH1。LI Y等[36]對酒類酒球菌SD-2a和31MBR的β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS07570進行了克隆、測序及生物信息學分析，結果表明，兩株菌株的β-葡萄糖苷酶基因高度同源（＞99%），為胞內酶、主要存在細胞質中。陳其玲等[40]對脅迫突變酒類酒球菌菌株的6-P-β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS01060進行了測序，結果顯示，大部分菌株的糖苷酶基因沒有發生變化。SPANO G等[52]對6-P-β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS01060進行了表達量分析，結果證實了溫度和乙醇脅迫對酒類酒球菌葡萄糖苷酶活具有一定的抑制作用。WANG J F等[53]對酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS07570和6-P-β-葡萄糖苷酶基因OEOE_RS01060進行了表達量分析，結果表明，這兩個基因的高表達量導致了酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶活的升高。LI Y等[37]對酒類酒球菌不同葡萄糖苷酶基因OEOE_RS05830、OEOE_RS07570和OEOE_RS01060的表達量進行了研究，通過對比酶活和不同基因表達水平，推測基因OEOE_RS01060和OEOE_RS05830可能與酒類酒球菌完整細胞的β-葡萄糖苷酶活相關，OEOE_RS07570與菌體破碎液的β-葡萄糖苷酶活相關。李亞輝[18]同時對酒類酒球菌中的5個糖苷酶基因（OEOE_RS07570、OEOE_RS05830、OEOE_RS01060、OEOE_RS01630、EOE_RS01635）進行了克隆和表達量分析，從分子水平上驗證了“碳代謝抑制”理論，并從一定程度上揭示了基因OEOE_RS01060編碼的6-P-β-葡萄糖苷酶是酒類酒球菌完整細胞具有β-葡萄糖苷酶活的原因。ZHANG J等[54]對酒類酒球菌中不同葡萄糖苷酶基因進行了同源性分析，并對基因OEOE_RS01060進行了克隆。MICHLMAYRH等[55]在大腸桿菌中成功表達了酒類酒球菌中的基因OEOE_RS07570，并對其活性進行了研究。由此可見，目前對酒類酒球菌葡萄糖苷酶基因的研究主要集中在OEOE_RS07570和OEOE_RS01060上，而對其他三個基因的研究還較少。6-P-β-葡萄糖苷酶的存在及其基因可以很好地解釋酒類酒球菌細菌完整細胞具有β-葡萄糖苷酶活性的原因，但目前對其研究還較少。

葡萄糖苷酶中6-P-β-葡萄糖苷酶是細菌磷酸烯醇式丙酮酸轉移酶系統（phosphoenolpyruvatephospho transferase system，PEP-PTS）中的重要組成部分，其只降解磷酸化的葡萄糖苷，對非磷酸化的底物不起作用[56]。細菌完整細胞通過PEP-PTS系統中轉運酶將底物轉運到細胞內，并在磷酸化酶作用下將其磷酸化，然后在胞內6-磷酸-β-葡萄糖苷酶作用下將其降解釋放出葡萄糖糖基和相對應配體[57]。該機制首先在大腸桿菌中發現，現在已證明也存在于革蘭氏陽性菌和陰性菌中，PEP-PTS是碳水化合物輸入的重要機制，在乳酸菌碳水化合物分解代謝中也是一個常見機制，但關于乳酸菌PEP-PTS中糖苷酶活性的信息還很有限。關于酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶，目前大多數研究只關注了其胞內、胞外或是分離純化后的酶活，而對于實際生產具有重要意義的完整細胞的酶活則關注的較少[26，39-42，58]。6-磷酸-β-葡萄糖苷酶及其基因可以很好地解釋為什么酒類酒球菌細菌完整細胞具有β-葡萄糖苷酶活性，而目前對其研究還較少。

6 總結及展望

研究酒類酒球菌β-葡萄糖苷酶對提升葡萄酒整體品質具有重要意義。糖苷在酒類酒球菌細胞內的代謝是一個復雜的體系，涉及多種酶的參與，并且機制錯綜復雜。目前關于酒類酒球菌和酒類酒球菌糖苷酶的研究非常有限。對酒類酒球菌糖苷酶的研究主要集中在β-葡萄糖苷酶的活性，以及提取、分離和純化，而對酒類酒球菌6-P-β-葡萄糖苷酶的研究還較少，而6-P-β-葡萄糖苷酶是糖代謝途徑磷酸烯醇式丙酮酸轉移酶系統中的關鍵酶，也是酒類酒球菌完整細胞具有β-葡萄糖苷酶活的重要原因。因此，對酒類酒球菌6-P-β-葡萄糖苷酶的酶活、提取、分離、純化，以及從分子水平上探明其誘導機制和表達過程將會是未來研究的重點和主要內容。