團頭魴NOS2基因的克隆和組織表達分析

王玉青，鄔長松，馬潔樂，陳會杰，劉小玲

(華中農業大學水產學院水生動物醫學系，湖北省水生動物病害防控工程技術研究中心，水產養殖國家級實驗教學示范中心，武漢 430070)

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)是一氧化氮(nitric oxide，NO)合成的關鍵酶，具有催化L-精氨酸氧化生成L-瓜氨酸和一氧化氮的功能。根據NOS的來源及催化特性的不同，可將其分為神經型NOS(neuronal nitric oxide synthase，nNOS或NOS1)、誘導型NOS(inducible nitric oxide synthase，iNOS或NOS2)和內皮型NOS(endothelial nitric oxide synthase，eNOS或NOS3)三種亞型[1-3]。1989年，NOS2被首次報道[4]，目前普遍認為，NOS2主要存在于巨噬細胞中，也存在于肥大細胞、中性粒細胞、神經小膠質細胞、血管內皮細胞和各種腫瘤細胞內。NOS2是二聚體，每一個亞基都含有兩個區域，一個區域是包含亞鐵血紅素和四氫生物蝶呤的氧化區，另一個區域是結合FAD、FMN和NADPH的還原區。當生物體受到細菌等外界因素或內源性炎癥細胞因子，如白細胞介素1(IL-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素γ(IFN-γ)的刺激后，NOS2被誘導表達，隨后催化合成大量的NO，產生的NO可參與多種免疫調節過程，具有殺菌、抗病毒和抗寄生蟲等多種免疫效應[5]。

團頭魴(Megalobramaamblycephala)，俗稱武昌魚，我國特有的淡水鯉科魚類。近年來細菌病的暴發，導致大量的團頭魴死亡，從而給團頭魴養殖業造成極大損失。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是公認的感染魚類的重要病原菌，屬于弧菌科氣單胞菌屬，是典型的人畜魚共患病病原[6]。2010年，田甜等[7]報道嗜水氣單胞菌可引起團頭魴急性出血性敗血癥。細菌性敗血癥對養殖魚類危害最重，暴發傳播的速度極快，患病魚死亡率很高[8]。在敗血癥過程中，致炎因子和內毒素可引起多種細胞和組織中NOS2的表達，從而產生大量的NO，過量的NO會造成細胞和組織損傷。

劉立等[9]研究證明，殼寡糖(chtiosanoligosaccharide，COS)和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可以激活團頭魴的巨噬細胞，上調NOS2的表達，增加NOS2的酶活，提高活性氮的表達水平。然而，病原菌感染團頭魴時NOS2基因的組織表達水平及調控機制尚不清楚。因此，本實驗克隆了團頭魴NOS2基因的全長cDNA序列，應用實時熒光定量PCR技術分析了嗜水氣單胞菌感染團頭魴后NOS2基因在肝臟、脾臟、頭腎和腸中的表達變化，旨在探究NOS2在團頭魴個體免疫中發揮的作用，為后續研究其在細菌感染后的免疫調控機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究所用團頭魴體重為400 g左右，購自湖北百榮水產良種有限公司，于華中農業大學水產基地淡水循環養殖系統中暫養兩周，待供試魚適應環境，并確認無疾病癥狀后，用于實驗。實驗期間水溫控制在25～26 ℃，水源為充分曝氣的自來水，使用充氣泵24 h不間斷充氧，每天分兩次投喂(8∶00，17∶00)，每次投喂相當于魚體重1.5%的人工配合飼料(武漢海大飼料有限公司生產)。

病原：供試菌株為筆者所在研究室保存的嗜水氣單胞菌(AhJ-1株系)，該株系為南京農業大學惠贈。將菌株接種在LB液體培養基(1 L培養液中，含酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蛋白胨10 g，調節pH至7.4)中，28 ℃條件下培養過夜培養，離心收集細菌，磷酸鹽平衡鹽溶液(PBS)洗滌三次，調整菌液濃度為3×107CFU/mL，作為攻毒菌液備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA的提取

解剖3尾健康團頭魴，取頭腎30～50 mg，根據總RNA提取試劑盒RNAiso Plus (TAKARA)的操作說明，提取總RNA。用微量核酸測定儀NanoDrop 2000測定RNA的純度及濃度。使用反轉錄試劑按照既定步驟反轉錄得到cDNA (PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TAKARA)。

1.2.2 團頭魴NOS2基因cDNA片段的克隆

根據草魚NOS2基因的序列設計引物，擴增團頭魴的中間序列，根據中間序列設計特異性引物，以團頭魴頭腎cDNA為模板，按照Takara公司的3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase和5′-Full RACE Kit with TAP試劑盒，擴增NOS2基因的3′和5′端，將PCR產物與pMD18-T載體連接，轉化到感受態細胞DH5α(全式金，北京)中，選取陽性克隆的菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序。

1.2.3 生物信息學分析

用DNASTAR軟件對測序后獲得的序列進行拼接，得到NOS2的cDNA全長。采用在線BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對NOS2的cDNA全長進行同源性檢索。使用ExPASy網站(https://www.expasy.org/)在線預測氨基酸序列并且分析氨基酸序列的分子質量、等電點和功能結合位點。使用clustalX軟件進行多重序列比較，同時用MEGA6.0(Neighbor-Joining，NJ法)構建進化樹。

1.2.4 嗜水氣單胞菌感染團頭魴后NOS2基因的表達變化

魚體感染和取樣參照Liu等[10]的方法并稍加改動，選取健康的團頭魴50尾，隨機分為2組，實驗組注射100 μL上述菌液，對照組注射等量的PBS。在注射后0、3、6、12、24、48、72 h取樣，每個時間點每組隨機選取3尾活魚，抽取血液后，解剖分離出30～50 mg左右的肝臟、脾臟、頭腎和腸，分別放入加有1 mL預冷Trizol的1.5 mL的EP管中，凍存于-80 ℃冰箱。所有樣品取完后，提取總RNA，反轉錄得到cDNA。使用熒光定量PCR對NOS2基因進行表達分析。反應程序：預變性95 ℃ 10 min，1個循環；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40個循環；溶解曲線從65 ℃到95 ℃。qPCR反應在羅氏480熒光定量PCR儀上進行，每個待測樣品設定3組重復，以NOS2基因mRNA在不同組織中的表達量與β-actin的表達量進行對比，作NOS2基因的相對表達量的分析，相對定量分析采用2-ΔΔCT法[11]。為了方便觀察NOS2基因在不同時間點的相對表達量，本實驗將0h的NOS2的相對表達量的值設定為1。用SPSS16.0軟件進行實驗數據的統計處理，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 團頭魴NOS2基因cDNA全長及序列特征

PCR擴增得到的產物經過純化、連接、轉化和測序之后，得到的序列經過DNAstar軟件拼接，除去重疊序列和接頭序列，最后得到團頭魴NOS2的cDNA全長(所用引物見表1)。使用在線BLAST對獲得的序列和已報道的NOS2序列進行同源性分析，該序列與草魚和斑馬魚的NOS2序列全長相似性大于80%，說明得到的序列為團頭魴NOS2。核苷酸序列已提交至GenBank數據庫，序列登錄號為KJ668755。團頭魴NOS2的cDNA序列全長4 215 bp，5′非編碼區為197 bp，3′非編碼區為775 bp，開放閱讀框為3 243 bp，編碼1 080個氨基酸，預測分子質量約為122.51 kW，理論等電點為7.36。使用clustalX軟件對團頭魴、草魚、斑馬魚、墨西哥脂鯉和虹鱒的序列進行多重序列比對，使用ExPASy網站在線分析其功能結合位點。如圖1所示，參與比對的序列N-末端都具有Heme、BH4和CAM結合位點，C-末端都具有FMN、FAD和NADPH結合位點，這些區域在硬骨魚類中高度保守。

表1 本實驗所用引物Tab.1 Primers used in these experiments

圖1 團頭魴NOS2的氨基酸序列比對Fig.1 Multiple alignment of the NOS2 amino acid sequencesNOS2的保守一致序列用彩色陰影標示，缺失的氨基酸殘基用破折號表示，下劃線標示輔因子的結合位點

2.2 團頭魴NOS2基因系統進化分析

為了得到團頭魴NOS2的進化信息，從NCBI數據庫中選取33個NOS2的蛋白序列，將其進行BLAST分析。用MEGA 6.0(Neighbor-Joining，NJ法)對33個NOS2的蛋白序列構建系統發育樹如圖2所示。脊椎動物的NOS分成NOS1、NOS2、NOS3三個分支，其中NOS1和NOS3與無脊椎動物的NOS的親緣關系更近。團頭魴與草魚、斑馬魚、鯉和金魚聚為鯉形目的一簇，其中團頭魴的NOS2與草魚的NOS2親緣關系最近。9個魚類的NOS2組成了硬骨魚類的分支，同時與哺乳類、鳥類和爬行類聚為脊椎動物NOS2分支。

圖2 團頭魴NOS2和其它動物的NJ分子進化樹Fig.2 NJ-phylogenetic tree of the NOS2 gene constructed by using amino acid sequences團頭魴NOS2用▲標出。節點處數值為自展置信值，自展重復1 000次，進化樹分析所用蛋白見表2

2.3 團頭魴NOS2基因在嗜水氣單胞菌感染后的表達變化

團頭魴感染嗜水氣單胞菌至72 h，各組團頭魴均無死亡。不同組織NOS2的表達水平如圖3所示，在肝臟組織中，NOS2在感染后3 h表達量極顯著上調，出現峰值，12 h顯著下調，隨后顯著上調，并且在48 h出現第二個峰值。在脾臟組織中，NOS2在感染后3 h表達量極顯著上調，出現峰值，6 h顯著下調，其余時間點極顯著下調表達。在頭腎組織中，NOS2在注射后3 h表達量達到最高，出現峰值，12 h恢復到注射前水平，在其余時間點表達量均是極顯著上調。在腸道組織中，NOS2在3 h極顯著下調表達，6 h顯著上調表達，24 h顯著下調表達。

圖3 嗜水氣單胞菌感染后，團頭魴肝臟、脾臟、頭腎和腸中NOS2在mRNA水平的表達變化Fig.3 Changes of relative mRNA expression levels of the NOS2 in the liver，spleen，head-kidney and intestine of M.amblycephala after challenged with A.hydrophila

3 討論

本研究通過同源克隆和RACE技術獲得團頭魴NOS2的cDNA全長，預測蛋白分子量為122.51 KW，等電點7.36。氨基酸序列同源性比對結果表明，團頭魴的NOS2與草魚的NOS2和斑馬魚的NOS2b的相似度較高。氨基酸序列分析表明，NOS2的N-末端都具有Heme、BH4和CAM結合位點，C-末端都具有FMN、FAD和NADPH結合位點，與汪新艷等[12]在草魚上的研究結果一致。進化分析表明，團頭魴的NOS2在進化關系上與草魚的NOS2最接近，與硬骨魚類的NOS2聚為一支，共同構成脊椎動物的NOS2分支，說明不同種屬的NOS2的異構體具有高度的同源性；團頭魴NOS2與脊椎動物NOS1和NOS3以及無脊椎動物NOS的進化關系較遠，進一步證實我們克隆的基因是NOS2。

在病原菌刺激時，不同物種、不同組織的NOS2表達變化存在差異[13-14]。本研究用實時熒光定量PCR檢測了嗜水氣單胞菌感染團頭魴后NOS2在肝臟、頭腎、脾臟和腸道的表達變化。在肝臟中，NOS2在感染早期表達量極顯著上調，12 h顯著下調，隨后顯著上調。然而，Yao等[15]研究發現，凡納濱對蝦注射LPS后，NOS基因在肝胰腺中表達量顯著降低，可能是不同物種間的免疫系統存在差異性。肝臟參與魚類的非特異性免疫反應，在細菌脂多糖、細胞因子等的誘導下，肝細胞、庫普弗細胞和貯脂細胞轉錄表達NOS2[16]。溫振才[17]用嗜水氣單胞菌刺激鯉魚后檢測的NOS2組織表達情況表明，NOS2在頭腎中的表達量最高。本實驗檢測嗜水氣單胞菌刺激的團頭魴的組織表達情況表明，NOS2在頭腎中亦被大量誘導表達。頭腎是魚類重要的免疫器官，當受到外來病原體感染時，頭腎中的免疫細胞如粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞發生增殖分化，大量表達NOS2，進而產生大量NO來對抗入侵的微生物[18-19]。在脾臟中NOS2在3 h上調表達，其余時間點表達量均顯著下調。郭建等[20]采用捕食應激模式，發現大鼠脾臟NOS2活性程度與動物心理應激程度密切相關，應激過程中NOS2活性增加，應激后期NOS2的活性又逐漸降低。因此推測脾臟NOS2早期的上調表達可能是團頭魴對嗜水氣單胞菌產生的應激反應。在腸道組織中NOS2基因除了在6 h有微弱的上調表達之外，總體呈現下調表達趨勢。對大鼠腸道的研究表明，NOS2的表達水平與腸道病理損傷指數呈顯著正相關關系；調節NOS2活性，減少NO生成量，可減輕腸組織損傷[21-22]。以上結果為探究NOS2在團頭魴個體免疫反應中的作用提供了一定的理論基礎。

NOS2可以催化產生大量的NO，NO具有殺菌、抗腫瘤等防御作用，過量表達NO則加劇炎癥反應，造成機體組織損傷，因此研究NOS2在先天性免疫反應中的作用則顯得極其重要。本實驗室前期工作已經證實團頭魴TLR2參與抗嗜水氣單胞菌的免疫反應[23]，Toll樣受體識別微生物的組分后被激活，活化NF-κB等轉錄因子，隨后轉錄因子激活NOS2的啟動子，誘導NOS2表達[24-25]。對于團頭魴，NOS2的表達同TLR2-NF-κB是否存在聯系尚不清楚，其分子機制仍需要進一步探索。目前對NOS2基因的研究多是在離體細胞水平[9，26]，而對個體水平中NOS2基因的表達調控及功能研究較少。本研究檢測了嗜水氣單胞菌感染團頭魴后其不同組織NOS2基因的表達水平及變化趨勢，為研究NOS2在團頭魴抵御嗜水氣單胞菌感染過程中的功能提供基礎數據。