中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥病理學診斷及兩種病原的檢測

劉力碩，楊宗英，胡 鯤，楊先樂

(1.上海海洋大學國家水生動物病原庫，上海 201306；2.上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；3.上海海洋大學農業部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306；4.南昌市農業科學院，南昌 330038)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)養殖業是我國水產養殖的支柱產業之一。近年來，江蘇省中華絨螯蟹養殖產業飛速發展，2014年江蘇省河蟹總產值達40億美元[1]，然而養殖迅猛發展的同時病害問題也愈演愈烈，2015年和2016年江蘇省興化市暴發了中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥，俗稱“水癟子”，造成總產量損失達40%～50%[2]，2017年雖呈現稍緩態勢，但仍威脅著我國河蟹產業的健康發展。早在2001年，東太湖已發現類似疾病[3]，但一直未得到足夠的關注。目前尚未有學者詳細描述該病各典型癥狀的變化過程，對完整病程中各階段的劃分也存在不足，該病的病原仍存在爭論，主要集中于微孢子蟲[2]、白斑綜合征病毒(WSSV)[4]和非生物因素[3，5～6]。為探究以上問題，實驗在江蘇省興化市采集80只該病病蟹，從中選取處于不同患病階段共12只，進行組織病理學研究和微孢子蟲、WSSV兩種病原的檢測，系統地闡述了該病各典型癥狀的變化過程，并創新地依據肝小管病變程度，將完整病程劃分為4個時期，最后對病原檢測結果進行討論分析，為中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥提供臨床診斷和預防的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2018年4-6月，于江蘇省泰州市興化市采集患中華絨螯蟹肝胰腺壞死綜合征病蟹共80只(50～100 g),為全面了解該病各時期的病理變化，挑選處于該病各階段且具有所處階段典型癥狀的病蟹，共12只(1～12號)，分別采集這12只病蟹的肝胰腺、肌肉和鰓組織于波恩氏液中固定24 h后轉入70%乙醇中于4 ℃下保存，用于制作組織病理切片，同時采集肝胰腺和肌肉組織于-80 ℃下保存，用于病原檢測實驗。

1.2 實驗方法

病蟹活體剖檢觀察：活體解剖病蟹(1～12號)，觀察體表及各內臟器官的病變情況，與健康蟹進行比較，以確定該病的主要病變規律和病變器官，采集圖片并做出臨床解剖診斷。

組織病理學切片制備和觀察：將所保存的組織用銳利手術刀修整為長5 mm寬2 mm高1 mm左右的組織塊，經過體積分數70%～100%的乙醇逐級脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片機切片(厚度5 μm)、H.E.染色、中性樹膠封片制成組織病理切片，在奧林巴斯高級攝像顯微鏡(BX51/DP72)下觀察拍照。

巢式PCR檢測WSSV：利用巢式PCR技術檢測病蟹肝胰腺和肌肉組織中的WSSV。PCR引物序列參照文獻[7]，PCR反應程序參照文獻[8]。PCR產物在1.5%的瓊脂凝膠上進行電泳，在BIO-RAD凝膠成像系統中觀察拍照。

常規PCR檢測微孢子蟲：利用常規PCR技術檢測病蟹肝胰腺和肌肉組織。PCR引物序列及PCR反應程序參照文獻[2]。PCR產物在1.5%的瓊脂凝膠上進行電泳，在BIO-RAD凝膠成像系統中觀察拍照。

2 結果

2.1 病蟹剖檢觀察的臨床癥狀

肝胰腺癥狀表現：與健康河蟹肝胰腺(圖版Ⅰ-1)對比，發現1～3號病蟹肝胰腺明顯增生、腫大(圖版Ⅱ-1)，同時，腺體因體積增大，出現向泄殖腔拓張的癥狀(圖版Ⅱ-2、3)；4～6號病蟹肝胰腺出現黃色與白色肝小管交錯的癥狀(圖版Ⅱ-4～6)；7～9號病蟹肝胰腺出現肝小管全部白化的癥狀(圖版Ⅱ-7～9)；10～12號病蟹肝胰腺出現嚴重萎縮、粘液增多、渾濁、半透明、粥樣的特征(圖版Ⅱ-10～12)。

鰓部癥狀表現：6、12號病蟹鰓部變黑(圖版Ⅱ-6、12)；1、5、9、10號病蟹鰓部顏色變暗(圖版I-1、5、9、10)。

副肢癥狀表現：副肢均無力，甲殼變薄、脆，易被外力(如：手指按壓)造成形變。

綜上所述，肉眼可見的肝胰腺白化、萎縮，鰓絲顏色變深，副肢無力、變軟，腹腔積水為該病的臨床癥狀。

2.2 病蟹的組織病理變化

2.2.1 肝胰腺組織病理變化

與健康河蟹肝胰腺組織切片(圖版Ⅰ-2)對比，發現12只病蟹的肝小管上皮細胞均有不同程度的病變及損傷，體現出該病病程中不同階段的病理特征。1～3號病蟹的肝小管上皮細胞大量增生，病變為區別于健康肝小管單層上皮細胞的多層上皮細胞(圖版Ⅲ-1～3)；4～6號病蟹肝胰腺中的部分肝小管空泡化，與正常肝小管交錯分布(圖版Ⅲ-4～6)，4號病蟹空泡化的肝小管上皮細胞輕度溶解(圖版Ⅲ-4)；7～9號病蟹的全部肝小管均重度空泡化(圖版Ⅲ-7～9)；10～12號病蟹的全部肝小管上皮細胞均嚴重溶解(圖版Ⅲ-10～12)。肝胰腺組織在該病發展過程中的不同階段體現出規律的病理變化特征，其病變癥狀對該病診斷起最重要作用。

2.2.2 鰓組織病理變化

與健康河蟹鰓組織切片(圖版Ⅰ-3)對比，發現12只病蟹的鰓組織細胞結構完整，僅局部鰓弓和個別鰓小葉發生病變，1～3以及6號病蟹鰓弓和鰓小葉不同程度充血(圖版Ⅳ-1～3、6)。1、2、5、6號病蟹嗜酸性粒細胞有不同程度的浸潤(圖版Ⅳ-1、2、5、6)。4～10以及12號病蟹鰓部多處不同程度水腫，其中9號病蟹鰓小葉上皮細胞融合(圖版Ⅳ-4～10、12)。鰓部并未呈現出規律性的病理變化，病理癥狀種類各異，個體差異性較大，多與其生長水體的水質情況差異性有關，如：理化因子含量、渾濁度、pH等，亦可能因患病個體抵抗力下降，繼而被病毒、真菌、細菌、寄生蟲等侵染所致。

2.2.3 肌肉組織病理變化

與健康河蟹肌肉組織切片(圖版Ⅰ-2)對比，發現隨著12只病蟹肝胰腺病變的加劇，肌肉組織也呈現出愈發嚴重的萎縮(圖版Ⅴ-1～12)，同時個別部位出現嗜堿性粒細胞浸潤的病理癥狀(圖版Ⅴ-1、6、9)，最終病蟹肌肉嚴重萎縮部位被結締組織的增生所取代(圖版Ⅳ-10～12)。

2.3 病蟹肝胰腺中微孢子蟲和WSSV的PCR結果

微孢子蟲檢測的擴增片段預期大小為931 bp，白斑綜合征病毒(WSSV)檢測的擴增片段預期大小為982 bp，陽性目標條帶均出現在1 000 bp分子標準的下方。

12只病蟹肝胰腺和肌肉組織中微孢子蟲的檢測結果顯示，4～7號病蟹肝胰腺組織檢測呈陽性(圖1-A)，肌肉組織檢測全部呈陰性(圖1-B)，統計(表1)顯示，4只病蟹肝胰腺檢測結果呈陽性，肌肉檢測結果全部呈陰性。

圖1 肝胰腺和肌肉組織寄生微孢子蟲的PCR檢測結果Fig.1 Results detected by conventional PCR of hepatopancreas and muscle parasitized by microsporidian M：DL2000分子質量標準;A:肝胰腺組織中微孢子蟲檢測；B：肌肉組織中微孢子蟲的檢測。

樣品肝胰腺肌肉樣 品肝胰腺肌肉1--7+-2--8--3--9--4+-10--5+-11--6+-12--

注：+ 為陽性結果；- 為陰性結果。

12只病蟹肝胰腺和肌肉組織WSSV檢測結果顯示，僅12號呈陰性(圖2-A)，肌肉組織檢測中僅3、12號呈陰性(圖2-B)。統計(表2)顯示，11只病蟹肝胰腺檢測呈陽性，10只病蟹肌肉檢測呈陽性。

圖2 肝胰腺和肌肉組織中WSSV的PCR檢測結果Fig.2 Results detected by conventional PCR of hepatopancreas and muscle infected by WSSV M：DL2000分子標準；P：陽性對照；N:陰性對照；A:病蟹肝胰腺組織中WSSV檢測；B：病蟹肌肉組織中WSSV的檢測

樣 品肝胰腺肌肉樣 品肝胰腺肌肉1++7++2++8++3+-9++4++10++5++11++6++12--

注：+ 為陽性結果；- 為陰性結果。

3 討論

3.1 中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥癥狀及產生過程

實驗結果以2個病理特征診斷中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥：(1)肝胰腺的肝小管出現上皮細胞增生、黃白肝、白化、粥樣化癥狀之一。(2)副肢軟化、肌肉萎縮、局部白濁。

目前，楊宗英等[9]已對肝胰腺顏色變化機理進行了充分的闡釋，本研究則重點針對肝胰腺自肥大到壞死萎縮、肌肉萎縮和腹腔積水等典型癥狀的變化過程及其關聯進行描述。首先肝胰腺作為該病完整周期中的主要病變器官，呈現出先增生、功能增強而后器官衰竭、壞死、萎縮的變化特點，推測這種病理變化是由于致病因子導致肝胰腺機能負擔增加，作為反應，肝胰腺在病理條件下發生肥大、肝小管上皮細胞增生，器官功能增強，但儲備力卻相對降低，屬于典型的代償性肥大[10]，當肝胰腺的機能負擔超過其代償限度時，造成器官功能不全，肝小管上皮細胞空泡增多、壞死、溶解，肝胰腺逐步衰竭，無法儲存營養物質，同時病蟹食欲減弱、食物攝入量嚴重不足，機體通過分解肌肉組織以補充能量供應，最終造成肝胰腺和副肢肌肉嚴重萎縮，由于中華絨螯蟹的循環系統屬開管系統，導致腹腔內大量血液堆積以填充肝胰腺萎縮的空間，因此出現腹腔積液的癥狀。

3.2 中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥的四個發展階段及命名

目前，已有學者依據肝胰腺顏色變化將該病劃分為淺黃、淺粉、乳白和灰白四個階段[11]，但這種依靠肝胰腺顏色劃分發病階段的方法存在以下三點不足：第一，未包含肝胰腺增生這一發病階段；第二，肝小管的白化并不同步，是逐個白化，存在黃、白肝小管交錯的時期，依據肝胰腺顏色進行劃分則無法體現這一階段特點；第三，肝胰腺呈現淺粉、乳白色時，肝小管已完全白化，應當屬于同一發病階段。結合病蟹剖檢觀察及組織病理觀察結果，發現可根據肝小管病變特點，將中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥的完整病程劃分為以下四個時期。

Ⅰ期：肝胰腺增生期，此階段病蟹臨床解剖表現為肝胰腺腫大，顏色正常，因腺體體積增大而向泄殖腔拓張(圖版Ⅱ-2、3)。組織病理顯示，肝小管上皮細胞有明顯的增生現象，即出現多層上皮細胞，區別于健康的單層柱狀上皮細胞；此時期副肢肌肉萎縮較輕。

Ⅱ期：部分肝小管白化期，此階段為Ⅰ期和Ⅲ期之間的過渡期，病蟹臨床解剖表現為增生期肝小管與白化期肝小管交錯分布。組織病理顯示，Ⅰ期和Ⅲ期肝小管交錯分布；此時期副肢肌肉輕度萎縮。

Ⅲ期：肝小管完全白化期，此階段病蟹臨床解剖表現為肝胰腺徹底白化或白中透著微黃，肉眼觀察為純白色或淡粉色，但腺體還未發生嚴重萎縮現象；組織病理顯示，肝小管柱狀上皮細胞的細胞質嚴重空泡化，空泡占比65%以上；此時期副肢肌肉萎縮較重。

Ⅳ期：肝胰腺壞死期，此階段病蟹臨床解剖表現為病蟹肝胰腺明顯萎縮，肝小管粘連、呈粥樣的半透明糊狀；組織病理顯示，肝小管上皮細胞出現崩解、自溶的現象，柱狀上皮細胞結構不完整，但肝小管管壁并未破損；此時期副肢肌肉萎縮嚴重。

3.3 中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥致病因子的分析

實驗結果顯示，僅有33.3%的病蟹肝胰腺中檢測出微孢子蟲，因此，微孢子蟲作為中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥病原的可能性較小。WSSV在病蟹肝胰腺和肌肉組織中的檢出率為91.7%和83.3%，但WSSV為高毒性病毒，有研究表明，健康中華絨螯蟹經過人工感染WSSV 96 h后的存活率不足20%[12]，同時實際生產中發生白斑綜合癥的河蟹養殖池塘存在大量病蟹死亡的現象，與肝胰腺壞死癥死亡率低的特點不符，同時肝胰腺壞死綜合征病蟹雖感染白斑綜合征病毒卻未引發相應癥狀，推測是由于病蟹體內的WSSV濃度較低，未達到引起疾病癥狀產生的最低病毒濃度，故認為病蟹作為WSSV攜帶者的可能性較大，而WSSV作為肝胰腺壞死癥致病因子的可能性較小。

依據采集病蟹樣品期間的流行病學調查發現，發病池塘在當年4月底殺蟲作業時，均存在嚴重的阿維菌素濫用情況，用量超使用說明劑量5～10倍，5月中旬即出現處于肝胰腺壞死病早期的個體，結合該病早期具有肝胰腺代償性肥大癥狀，不排除有毒素致病的可能性，有研究表明[13]，阿維菌素亞致死暴露下，河蟹肝胰腺中乳酸脫氫酶(LDH)和乙酰膽堿酯酶(AChE)活性顯著降低，谷胱甘肽S-轉移酶(GSTs)活性呈現先顯著提高而后逐步降低的趨勢，其中LDH參與有氧氧化和糖類代謝，并發揮重要作用[14],其活性的改變會造成糖類代謝異常，抑制機體供能，進一步造成器官損傷，在一定程度上更敏感地反映臟器的功能狀況[15]，AChE的活性與沖動傳導、神經細胞的能量代謝等重要生理過程有關[16]，GSTs是一種參與機體解毒的酶，通過提高谷胱甘肽(GSH)合成，增強機體清除脂質過氧化物自由基的能力。這項研究顯示健康河蟹在阿維菌素誘導下，肝胰腺排毒功能先增強后衰弱、營養代謝功能持續衰退的特點，與中華絨螯蟹肝胰腺壞死癥初期肝胰腺代償性肥大，后期器官衰竭的特點具有相似性，同時也為該病的進一步研究提供了思路，因此，實驗結果更加傾向于支持非生物因素作為該病致病因子的觀點，但仍需對四個病理時期肝胰腺中LDH、AChE和GSTs三種酶作進一步研究，同時也需要采用實際生產中藥物濫用劑量，對健康中華絨螯蟹進行中長期持續誘導的實驗加以驗證。

圖版Ⅰ 健康中華絨螯蟹
Plate.Ⅰ Healthy ChineseE.sinensis
1.健康河蟹解剖圖；2.健康河蟹肝胰腺組織石蠟切片；3.健康河蟹鰓組織石蠟切片；4.健康河蟹肌肉組織石蠟切片。

圖版Ⅱ 病蟹解剖圖
Plate.Ⅱ Anatomical drawning of sick crabs 1.1號病蟹 肝胰腺腫大、增生(H)；2.2號病蟹 肝胰腺腫大，腺體有向泄殖腔拓張的趨勢(E)；
3.3號病蟹 肝胰腺嚴重腫大，出現腺體向泄殖腔拓張的癥狀(E)；4～5.4、5號病蟹 部分肝小管白化(W)，黃、白肝小管交錯；6.6號病蟹 少量肝小管白化(W)，鰓絲嚴重變黑(B)；7～9.7～9號病蟹 肝小管全部白化(W)；
10.10號病蟹 肝胰腺粥樣病變、重度萎縮(A)，少量腹水(as)；11.11號病蟹 肝胰腺粥樣病變、重度萎縮
(A)；12.12號病蟹 肝胰腺粥樣病變、嚴重萎縮(A)，腹水較多(as)，鰓絲變黑(B)。

圖版Ⅲ 病蟹肝胰腺組織病理
Plate.Ⅲ Histopathology of hepatopancreas in sick crabs
1～3.1～3號病蟹 肝小管上皮細胞增生(H)；4.4號病蟹 白化肝小管空泡化(V)，細胞溶解(D)，未白化的肝小管，上皮細胞增生(H)；5～6.5、6號病蟹 白化肝小管空泡化(V)，肝小管上皮細胞少量增生
(H)；7～9.7～9號病蟹 肝小管上皮細胞空泡化嚴重(V)；10～12.10～12號病蟹 肝小管上皮細胞溶解(D)。

圖版Ⅳ 病蟹鰓組織病理
Plate.Ⅳ Histopathology of gill in sick crabs
1.1號病蟹 鰓絲、鰓弓充血(hy)，嗜酸性粒細胞(eo)和嗜堿性粒細胞(bg)浸潤；2.2號病蟹 鰓小葉尖端充血(hy)，嗜酸性粒細胞浸潤(eo)；3.3號病蟹 鰓弓充血(hy)；4.4號病蟹 鰓小葉尖端水腫(ed)；5.5號病蟹 鰓小葉水腫(ed)，嗜酸性粒細胞浸潤(eo)；6.6號病蟹 鰓小葉充血(hy)、水腫(ed)，嗜酸性粒細胞浸潤(eo)；7～8.7、8號病蟹 鰓小葉輕微水腫
(ed)；9.9號病蟹 鰓小葉嚴重水腫(ed)、上皮細胞融合(an)、嗜酸性粒細胞浸潤(eo)；10.10號病蟹 鰓弓水腫(ed)；
11.11號病蟹 鰓小葉尖部萎縮(A)；12.12號病蟹 鰓小葉尖部萎縮(A)、水腫(ed)。

圖版V 病蟹肌肉組織病理
Plate.V Histopathology of muscle in sick crabs
1.1號病蟹 肌肉萎縮較輕(A)，嗜堿性粒細胞浸潤(bg)；2～5.2～5號病蟹 肌肉萎縮較輕(A)；6.6號病蟹 肌肉輕度萎縮(A)，嗜堿性粒細胞浸潤(bg)；7～8.7、8號病蟹 肌肉重度萎縮(A);9.9號病蟹 肌肉萎縮較輕(A)、
嗜堿性粒細胞浸潤(bg)；10～12.10～12號病蟹 肌肉重度萎縮(A)，結締組織增多(S)。