景寧木蘭熱脅迫下實時熒光定量PCR內參基因的篩選

王倩穎，常鵬杰，申亞梅，張 超，董 彬，時寶柱

（1.浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州 311300；2.奈曼旗橋河國有母樹林經營林場，內蒙古 通遼 028300）

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）是在普通PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術，具有靈敏度高、定量準確、特異性強、重復性好及高通量等優點，已被廣泛應用于基因表達分析的相關研究中［1-2］。但在實驗過程中，目的基因的表達結果經常受RNA的提取質量、反轉錄合成效率等的影響，使實驗結果出現偏差［3］，因此需要引入內參基因對基因表達結果進行校正和標準化以消除背景誤差的影響［4］。理想的內參基因是指在不同的組織，不同時期，不同環境條件下甚至是不同植物下皆可相對穩定表達的基因。它們是構成細胞的基本轉錄組成分，參與維持細胞的基本功能，且與要分析的目標基因具有相似的表達水平［5］。但大量實驗研究表明，許多內參基因的轉錄水平會因為植物的發育階段或實驗條件的不同而出現差異，這種差異會影響試驗結果的準確性，甚至得出錯誤的結論［6-7］。因此，在進行qRT-PCR試驗前，選擇合適的內參基因變得尤為重要。景寧木蘭Magnolia sinostellata是木蘭科Magnoliaceae木蘭屬Magnolia新種，落葉灌木，先花后葉，花色艷麗，花瓣數量9～18瓣，觀賞價值極高，分布于浙江南部地區海拔1000 m以上的區域，是浙江省特有種，屬于極度瀕危物種［8］。景寧木蘭性喜溫涼濕潤、水分充足的環境，但隨著全球氣候變暖，城市熱島效應的加劇，高溫環境嚴重影響著植物的生長。目前對景寧木蘭的研究集中在花色和花芽分化的轉錄組分析上［9］，抗逆性研究鮮有報道。通常情況下，采用遮陽等措施來降低高溫對景寧木蘭的傷害，但植物自身的抗熱脅迫的遺傳特性才是起決定作用的因素。因此，研究景寧木蘭對高溫脅迫的抗逆機制，解析其響應高溫的基因表達調控網絡，有針對性地發掘相關抗性基因，對景寧木蘭的保護、分子育種有積極的意義。目前，尚未見到基于qRT-PCR技術篩選景寧木蘭內參基因的相關報道。因此，本研究以熱脅迫下景寧木蘭1年生實生苗的根、莖、葉組織為材料，選取13個內參基因，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術和geNorm，NormFinder和BestKeeper等3個表達分析軟件篩選熱脅迫下表達穩定的內參基因，以期為景寧木蘭熱脅迫下相關目的基因的表達提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

采用的植物材料為種植于浙江農林大學苗圃內景寧木蘭1年生實生苗。選取長勢一致，無病蟲害的植株16盆，分別置于2個人工氣候箱內（POX-1000A-12H），氣候箱光合光子照度為800 μmol·m-2·s-1，濕度控制在75%～80%，溫度分別為25℃（對照）和40℃（高溫處理），光周期為12 h/12 h。分別在處理24和48 h時采取根、葉片和莖段，在液氮中速凍后于-80℃中保存，用于RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉錄cDNA的合成 將凍存的樣品在液氮中研磨成粉后，用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）試劑提取材料的總RNA，通過質量濃度為1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性， 紫外分光光度計來檢測 RNA 的純度［D（260）/D（280）=1.8～2.1， D（260）/D（230）＞1.8］及質量濃度［終質量濃度（mg·L-1）=D（260）×n×40。 其中， D（λ）為波長 λ 處的吸光度， n 為稀釋倍數］。 全長 cDNA 第 1條鏈的合成按照PrimeScriptTM RT Master Mix（Takara，大連）試劑說明書操作，將得到的cDNA在-20℃保存。

1.2.2 候選內參基因及定量引物設計 從前期構建的景寧木蘭轉錄組數據庫中，選取13個功能基因作為候選內參基因的熒光定量PCR引物。引物信息見表1。

表1 13個候選內參基因和目的基因的引物序列Table 1 Primer sequences of the 13 candidate reference genes and target genes

1.2.3 內參基因熒光定量PCR擴增程序 將反轉錄產物cDNA稀釋10倍，使用SYRB Premix Ex TapⅡ（Takara，大連）實時定量PCR試劑盒，在Light Cycler 480Ⅱ（Roche）實時定量PCR儀進行定量分析。反應體系為 SYRB Premix Ex Tap Ⅱ10.0 μL， cDNA 模板 2.0 μL， 上下游引物各 0.8 μL（10 μm·L-1）， 雙蒸水（ddH2O）6.4 μL，共20.0 μL體系。每個樣品3次重復，擴增反應程序為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃預變性30 s，共40個循環，然后60～95℃持續15 s作為溶解曲線分析程序。

1.2.4 引物擴增效率的計算 將12個樣品的cDNA等量混合作為模板，按照5倍梯度稀釋產物，共5個梯度進行熒光定量PCR，制作標準曲線。利用公式E=（10-1/K-1）×100%計算得出內參引物的擴增效率。其中E為擴增效率，K為標準曲線斜率。R2=（總平方和-殘差平方和）/總平方和，總平方和為標準曲線中響應濃度Ct的實際值與平方值的平方差之和，殘差平方和為相應濃度下Ct的估計值與實際值的平方差之和［10］。

1.2.5 數據分析和處理 利用geNorm，NormFinder和BestKeeper 3個軟件分析13個候選內參基因在不同處理下不同組織中的表達穩定性進行分析，從而得到熱脅迫下景寧木蘭表達相對穩定的內參基因。其中，BestKeeper軟件直接通過計算Ct對每個候選內參基因進行分析；geNorm和NormFinder將Ct根據公式Q=ECtmin-Ctsample進行轉化，式中E為擴增效率，當其接近100%時，默認為2進行計算［11］；Ctmin為該基因在所有組織中的最小Ct；Ctsample為該基因在各個組織中的Ct。

2 結果與分析

2.1 景寧木蘭RNA的質量檢測

提取的RNA條帶清晰，沒有彌散片狀或條帶消失的現象，說明RNA完整性良好，且沒有降解。景寧木蘭RNA樣品的D（260）/D（230）皆約2.0，＞1.8，說明RNA純度較高，符合后續實驗的要求。

2.2 景寧木蘭候選內參基因引物特異性及擴增效率檢測

將12個樣品的cDNA等量混合，按照10倍梯度稀釋產物作為模板，進行普通PCR和定量PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：13個引物的產物只有單一條帶，無可見引物二聚體，且13個引物的溶解曲線都只有明顯的單一峰，說明引物的特異性良好。計算擴增效率結果顯示：擴增效率為97.36%～110.91%，UBC最高，GADPH最低，相關系數R2為0.990～0.999（表2）。符合qRT-PCR試驗的要求。

表2 候選內參基因擴增特性Table 2 Candidate reference genes amplification specificity

2.3 景寧木蘭候選內參基因表達水平分析

利用比較Ct的方法評估13個候選內參基因在不同處理下平均表達水平（圖 1）。18S的Ct最小，為4.601，平均表達水平最高；余下12個候選內參基因的Ct為15.869～23.072，表達水平相差不大。

圖1 候選內參基因不同組織中的CtFigure 1 Candidate reference genes Ctvalues in different tissues

2.4 景寧木蘭候選內參基因表達穩定性分析

geNorm軟件根據計算得到的平均表達穩定指數M來進行穩定性排序，M越大表明基因越不穩定，以M=1.5為標準，M＜1.5認為是理想內參基因的穩定表達標準。同時，該軟件還通過內參基因標準化的配對差異分析（Vn/Vn+1）來得到內參基因的合適數量，軟件默認以Vn/Vn+1=0.15為標準，當Vn/Vn+1＜0.15時，表明n個內參基因已經可以穩定作為內參基因，沒必要引入第n+1個基因［12］。通過圖2可知：13個基因的M為0.0500～0.2000，＜1.5，說明13個候選內參基因都達到了作為內參基因的標準，其中ACTIN-7和EF-1α最為穩定，M=0.33449。GADPH的M最大，為1.14166，是所有候選內參基因中表達最不穩定的。圖3表明：V2/V3為0.021＜0.15，說明2個基因可穩定作為內參基因，結果可靠，無需引入第3個基因。進一步分析表明：ACTIN-7和EF-1α為最佳內參組合。

BestKeeper軟件通過計算內參基因Ct的標準偏差（SD）對內參基因的的穩定性進行排序，標準偏差越小表明內參基因的穩定性越好，如果標準偏差＞1，則認為該基因不穩定［8］。表3顯示：在不同組織中，NADP和GADPH的標準偏差大于1，說明這2個基因表達不穩定。余下的11個內參基因的標準偏差皆小于1，其中UBC，EF-1α，ACTIN-7和GTB穩定性最好，排名最高。

NormFinder軟件通過計算組內和組間的方差得到表達穩定值，并對候選內參基因進行排序，穩定值越小，表明內參基因越穩定。表3顯示：UBQ，EF-1α和TEF分別排在前3位，表達穩定值較為接近，表達最為穩定；CYP的穩定值最大，為0.237，表達穩定性最差。

圖2 geNorm軟件分析內參基因表達穩定值Figure 2 Reference genes expression stability by geNorm

圖3 geNorm軟件分析內參基因配對變異值Figure 3 Reference genes pairwise variation value by geNorm

表3 BestKeeper和NormFinder軟件分析內參基因表達穩定性及排名Table 3 Reference genes expression stability and ranking by BestKeeper and NormFinder

2.5 景寧木蘭候選內參基因表達穩定性驗證

綜合以上3個軟件分析的結果，本研究選擇了穩定性較好的3個基因（UBC，EF-1α和ACTIN-7）和1個基因組合（EF-1α和ACTIN-7）。通過分析CSLD3和KOR基因在景寧木蘭不同組織的表達模式來進一步驗證篩選的候選內參基因的穩定性。CSLD3是植物合成根毛細胞壁的重要纖維素合成酶基因，可以引起細胞壁形成的缺陷［13］。研究表明此基因在根部中表達最高［14］。KOR基因是植物合成細胞壁中發揮重要作用的纖維素合成酶基因，在莖中和木質部中表達量最高［6,15］。對3個內參基因進行相對表達量量化（圖4），CSLD3在根中表達最高，KOR在莖中表達最高。以EF-1α和ACTIN-7內參基因組合標準化，目的基因也顯示出一致的表達水平，進一步表明了這3個內參基因的可靠性。

3 討論

SPIEGELAERE等［16］研究認為軟件間的算法和判斷標準不同導致結果的差異，因此在評估內參基因時應先綜合分析各軟件的結果，再進行比較排序，最終篩選出最適宜的內參基因。理想的內參基因應在各種類型的組織、細胞和各種實驗因素條件下均恒定表達［17-18］。但大量實驗表明：內參基因只是在一定的范圍內可以穩定表達，在特定的實驗條件下，應該篩選特定的內參基因來進行實驗［19］。因此，本研究選擇了景寧木蘭在熱脅迫下的根、莖、葉組織進行內參基因的篩選研究。得到UBC，EF-1α和ACTIN-7為熱脅迫下不同組織的最佳內參基因，這3個內參基因均是傳統內參基因，其中UBC基因是泛素蛋白翻譯后修飾的的基因，參與細胞多種調控過程，如細胞周期，細胞的增值與分化，信號轉導等［20］，在桂花Osmanthus fragrans花芽的不同發展階段［21］、 桉樹Eucalyptus robusta不同組織［22］中均表達穩定；ACTIN是細胞的骨架成分，幾乎在所有的真核細胞中均有表達［23］，在楊樹Populus tomentosa不同光周期和低溫條件下的莖尖、幼葉、成熟葉和樹皮組織中、油菜Brassica campestris的營養組織中以及番茄Lycopersicon esculentum的葉子和根組織中也表現出最佳的穩定性［24-26］。EF-1α是一種重要的多功能蛋白，參與細胞轉導、翻譯控制、骨架組成等多種重要的細胞學過程［27］。ACTIN和EF-1α在毛果楊Populustrichocarpa不同組織為材料［11］和梧桐Firmiana platanifolia種子的不同發育階段［28］中均表現出較高的穩定性。SILVEIRA等［29］在一種重要牧草珊狀臂形草Brachiaria brizantha的內參基因篩選中同樣得到EF-1α穩定性最佳的結果。

圖4 CSLD3和KOR在景寧木蘭不同組織中的表達分析Figure 4 Expression of CSLD3 and KOR in different tissues of Magnolia sinostellata

理想的內參基因的表達水平應是適中的，不宜過高，也不宜過低，Ct應為15～30［30］。本研究中18SrRNA基因的Ct遠低于15，表達豐度過高，影響其穩定性，不適宜作為內參基因。在光皮樺Betula luminifera的根、莖、葉和種子等不同組織中也出現了18S的Ct過低的情況［10］。在牡丹Paeonia suffruticosa不同組織不同花期［31］以及水稻Oryza sativa受到稻縱卷葉螟Chaphalocrocis medinalis蟲害誘導后內參基因研究［32］中也得到了相同結果。而周良云等［33］對黃花嵩Artemisia annua進行不同濃度的鎘處理，最終選取了ACTIN-7，18S和PAL為內參基因來校正目的基因的表達量；蘇曉娟等［11］也發現毛果楊在鋅脅迫下18SrRNA穩定性較好，可用作內參基因。進一步表明了不同植物在不同條件下，內參基因穩定性差異較大。

研究中選擇2個或2個以上的基因可以有效增加結果的可靠度及精確度，以此來減弱單一內參基因可能造成的結果偏差［17］。劉文哲等［10］在光皮樺中通過目的基因的表達分析驗證內參基因的可靠性，結果顯示了3個內參基因及其組合對目的基因定量標準化差異較小。PARK等［34］在不同品種甘薯Dioscorea esculenta的非生物脅迫條件下，使用單個穩定的內參基因ARF和最佳內參基因組合（ARF/COX）對2個目的基因IbLEA14和swpa2進行表達驗證，結果也顯示了單個內參基因和組合驗證對目的基因表達水平的校準結果基本一致。本研究以EF-1α和ACTIN-7為組合內參基因進行表達驗證，發現單個內參EF-1α與其有微小差異，2個基因組合可使基因定量結果更加準確。但是與單個基因做內參相比，2個或2個以上的基因做內參需要增加更多的樣本量和耗費大量成本，且實驗結果并無明顯差異。因此，在實驗過程中可綜合考慮后再進行選擇。