硫化氫合成酶抑制劑金絲桃素的體內外抗結腸癌作用研究

尹春麗，騫 婧，王 軍，牛衛寧*

1西安文理學院生物與環境工程學院，西安 710065；2西北工業大學生命學院，西安 710072

胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthase，CBS)是體內催化合成氣體信號分子硫化氫(H2S)的三種酶之一[1，2]，硫化氫在哺乳動物體內參與多種生物學過程[3，4]。近期研究表明在結腸癌、卵巢癌和乳腺癌中CBS來源H2S濃度的升高促進了腫瘤細胞的增殖和遷移[5-7]。通過RNA干擾或加入抑制劑降低CBS活性則抑制了腫瘤細胞的增殖，減少了體內腫瘤的生長[8，9]，這些發現表明CBS可能是一個潛在的抗腫瘤靶點。因此，研發高效的CBS選擇性抑制劑具有重要的意義。

氨基氧乙酸(AOAA)是目前唯一被廣泛使用的CBS抑制劑。AOAA通過不可逆結合磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′-phosphate，PLP)輔因子抑制酶活性，因此AOAA是PLP依賴酶的廣譜性抑制劑[10]。另外，在生理條件下抑制CBS活性需要高濃度的AOAA(1～10 mmol/L)，因此AOAA作為CBS抑制劑存在選擇性差和抑制作用弱的不足[11]。在作者實驗室前期研究中，通過高通量篩選天然產物化合物文庫獲得幾個CBS選擇性抑制劑，其中來源于中草藥貫葉連翹(HypericumperforatumL.)的化合物金絲桃素(hypericin)對CBS活性具有強的抑制作用[12]。金絲桃素是一種天然的光敏劑，經光激活產生單線態氧可以誘導腫瘤細胞凋亡并抑制其生長，同時金絲桃素對腫瘤組織具有特異的親和力，也被廣泛用于腫瘤的光動力學診斷中[13-15]。然而，金絲桃素作為CBS抑制劑的抗腫瘤活性并不清楚。本論文研究了金絲桃素作為CBS抑制劑的體內外抗結腸癌活性。

1 材料與儀器

1.1 材料

金絲桃素(純度≥98%)購自成都曼斯特生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、同型半胱氨酸、氨基氧乙酸(AOAA)和炔丙基甘氨酸(PAG)購自美國Sigma公司；CCK-8細胞活性檢測試劑盒購自日本Dojindo公司；CBS抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；人結腸癌細胞HT29購自美國典型菌種保藏中心(ATCC)；親和層析柱GSTrap FF和HisTrap FF 購自美國GE公司；其他所有試劑均為分析純。

1.2 儀器

多功能酶標儀(SynergyTMH1,Biotek,美國)；蛋白質轉印系統(Bio-rad，美國)；化學發光成像系統(TanonTM5200，北京原平皓生物技術有限公司，中國)；超聲波細胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，中國)；恒溫震蕩搖床(上海智城分析儀器制造有限公司，中國)；大容量高速冷凍離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司，中國)；二氧化碳培養箱(Thermo,美國)。

2 實驗方法

2.1 人胱硫醚-β-合成酶(CBS)和人胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的表達純化

人CBS的表達純化根據作者以前發表的文獻進行[1,12]。重組大腸桿菌發酵液(6 L)經離心后得到菌體，然后將菌體重懸于500 mL 裂解液中(50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH7.4)并使用超聲波細胞破碎儀破碎。隨后，在4 ℃下 12 000 rpm離心30 min獲得上清液，上清液過預先平衡的GSTrap FF親和層析柱，然后使用平衡緩沖液(50 mM Tris-HCl,pH8.0)洗脫除去雜蛋白。在層析柱中加入凝血酶(5 U/mg重組蛋白)4 ℃柱上酶切16 h，收集CBS蛋白儲存于-80 ℃備用。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測結果表明重組CBS純度大于90%。人胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的表達純化參照作者發表的文獻進行[12]。

2.2 硫化氫(H2S)含量測定

使用亞甲藍法測定反應液中H2S的含量[11]。當測定CBS重組蛋白催化合成H2S的實驗時，反應液(200 μL)包含 50 mmol/L HEPES 緩沖液 (pH7.4)、 0.4 mmol/L Pb(NO3)2、 2 mmol/L 同型半胱氨酸和 5 μg CBS 蛋白。當測定HT29細胞裂解液催化產生H2S的實驗時，使用冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌培養的HT29細胞3次，然后將收獲的細胞在液氮/水浴中凍融5次破碎，反應液200 μL包含180 μL細胞裂解液和2 mmol/L 同型半胱氨酸。在反應液中加入2 mmol/L半胱氨酸底物開始反應，在37 ℃孵育30 min后加入25 μL 20 mmol/L的N,N-二甲基-1,4-苯二胺(溶解于7.2 mol/L HCl)和25 μL 30 mmol/L的FeCl3(溶解于1.2 mol/L HCl)終止反應。孵育15 min后反應液在12 000 rpm離心10 min獲得上清液。轉移上清液至96孔板中，在670 nm波長下測量吸光度。使用標準濃度的Na2S溶液制作H2S濃度與吸光度標準曲線圖，根據標準曲線計算樣品中H2S濃度。

2.3 金絲桃素對CBS活性的影響

使用亞甲藍法測定不同劑量金絲桃素對CBS活性的影響，金絲桃素抑制CBS活性的半抑制濃度(IC50)被測定，反應混合物總體積為200 μL，包括2 mmol/L 半胱氨酸、2 mmol/L 同型半胱氨酸、5 μg CBS、 0.4 mmol/L Pb(NO3)2和體積分數為5%的DMSO。以未加金絲桃素的反應混合物作為對照。

2.4 小干擾RNA(siRNA)介導的CBS基因沉默

為了研究哺乳動物細胞中CBS蛋白是否是金絲桃素作用的靶標，通過RNA干擾技術抑制CBS基因的表達，siRNA的序列如下所示。5′-GGAAGAAGUUCGGCCUGAATT-3′，5′-GGAACUACA UGACCAAGUUTT-3′和5′-CCAUUGACUUGCUGAA CUUTT-3′，隨機的siRNA被作為陰性對照。所有siRNA序列的設計和合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。當HT29細胞生長到30%～40%融合度時，使用轉染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)進行siRNA轉染，轉染后的細胞在37 °C繼續培養48 h。

2.5 細胞活力檢測

HT29細胞在DMEM培養基(Life Technologies公司)中37 °C，φB=5% CO2進行培養，培養基包含φB=10%的胎牛血清(Biological Industries公司)和青霉素-鏈霉素溶液(Sigma公司)。使用CCK-8細胞活性檢測試劑盒測定金絲桃素抑制HT29細胞增殖的IC50值。接種HT29細胞于96孔板中(每孔包含1×104個細胞)，培養24 h后更換含有不同濃度金絲桃素的新鮮培養基繼續培養24 h，然后加入CCK8溶液在37 °C孵育2 h，在450 nm測定吸收度。以不包含金絲桃素的樣品作為對照，計算不同濃度金絲桃素存在條件下的細胞存活率。

2.6 體內抗腫瘤活性

BALB/c裸鼠購自中國醫學科學院實驗動物科學研究所，動物實驗由西北工業大學實驗動物福利與倫理委員會批準進行(批準號：2018017)。將HT29 細胞(每毫升1×107個細胞，100 μL)皮下接種于5周齡雌性小鼠的右前肢腋窩。使用游標卡尺每三天測定腫瘤的體積(腫瘤體積=0.5×長×寬2)，當腫瘤體積達到約100 mm3時，所有小鼠被隨機分成5組(每組6只)，分別為溶劑對照組(包含φB=5%的DMSO和ρB=5 g/L的羧甲基纖維素鈉溶解于PBS緩沖液中)、陽性藥物AOAA對照組(10 mg/kg·d)、金絲桃素低(5 mg/kg·d)、中(10 mg/kg·d)和高劑量組(30 mg/kg·d)，小鼠每周注射藥物6次，連續給藥2周。

2.7 Western blot法檢測細胞CBS蛋白表達水平

使用冰冷的PBS溶液洗滌細胞3次，然后加入裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH7.4,150 mmol/L NaCl,ρB=5 g/L的脫氧膽酸鈉,φB=1%的NP40和蛋白酶抑制劑)裂解細胞，在4 °C下12 000 rpm離心10 min獲得上清液，BCA法測定蛋白濃度并進行SDS-PAGE電泳，然后進行轉膜，封閉。加入兔源CBS一抗(1∶1 000)4 °C過夜孵育，加二抗孵育2 h(1∶5 000),使用天能TanonTM化學發光成像系統進行分析拍照，使用 Image J軟件分析Western-blot條帶灰度值進行相對定量。

2.8 數據分析

采用GraphPad Prism version 6.0 軟件對數據進行統計學分析，數據表示為平均值±標準偏差(SD)，P< 0.05為差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 金絲桃素選擇性抑制CBS活性

作者實驗室前期通過高通量篩選天然產物文庫獲得了幾種CBS抑制劑，其中金絲桃素(圖1A)對CBS活性的抑制作用最強[12]。本研究中使用亞甲藍方法測定不同濃度金絲桃素對CBS和CSE活性的影響，結果如圖1B所示。在底物2 mmol/L半胱氨酸和2 mmol/L同型半胱氨酸存在的條件下，金絲桃素抑制CBS活性的IC50為7.9 ± 1.42 μmol/L。另外，測定了AOAA(目前普遍使用的CBS抑制劑)對CBS產H2S活性的影響，結果如圖1C所示，IC50為8.2 ± 1.14 μmol/L，表明金絲桃素對CBS活性的抑制效果和AOAA基本一致。另外，為了評估金絲桃素抑制CBS的選擇性，分別測定了不同濃度金絲桃素對CSE(另一種H2S合成酶)活性的影響，結果表明金絲桃素對CSE僅有非常微弱的抑制活性，IC50為83.0 ± 16.68 μmol/L(圖1D)，以上結果表明金絲桃素對CBS活性的抑制具有較高的選擇性(相對于CSE)。

3.2 金絲桃素抑制HT29細胞的增殖

作者前期研究表明在HT29細胞中CBS蛋白存在高表達，而另一種H2S合成酶CSE表達量則非常低[16]。在本研究中使用亞甲藍法測定HT29細胞裂解液中CBS和CSE蛋白的產H2S活性，反應液中加入PAG(普遍使用的CSE特異性抑制劑)或AOAA(CBS和CSE的抑制劑)。結果如圖2A所示，未加抑制劑的HT29細胞裂解液產H2S活性為36.6 ± 1.13 nmol/h·mg 蛋白，當在細胞裂解液中加入2 mmol/L PAG或1 mmol/L AOAA后，H2S產生活性分別為33.1 ± 1.04 nmol/h·mg蛋白和6.3 ± 0.35 nmol/h·mg蛋白。因此，計算得知CSE來源的H2S產率為3.5 nmol/h·mg蛋白，CBS來源的H2S產率為26.8 nmol/h·mg蛋白，CBS來源H2S產率超過CSE來源H2S產率的8倍，以上結果表明CBS是HT29細胞中催化合成H2S的主要酶。另外，當在細胞裂解液中加入0.5 mmol/L金絲桃素后，H2S產生活性為7.7 ± 0.62 nmol/h·mg蛋白，表明金絲桃素和AOAA均能顯著抑制細胞裂解液中CBS的產H2S活性。

圖1 金絲桃素和AOAA劑量依賴性地抑制CBS活性Fig.1 Dose-dependent inhibition of CBS activity by hypericin and AOAA注： A.金絲桃素的化學結構；B.不同濃度金絲桃素對CBS活性的抑制曲線及其IC50值；C.不同濃度AOAA對CBS活性的抑制曲線及其IC50值；D.不同濃度金絲桃素對CSE活性的抑制曲線及其IC50值。Note:A.Chemical structure of hypericin;B and C.Dose-response curves of hypericin and AOAA versus CBS activity;D.Dose-response curves of hypericin versus CSE activity.

Szabo等研究表明CBS蛋白的高表達在促進結腸癌細胞增殖過程中起關鍵作用[5]，因此本研究測定了金絲桃素和AOAA對HT29細胞增殖的影響。結果如圖2B所示，金絲桃素抑制HT29細胞增殖的IC50值為22.2 ± 2.25 μmol/L。然而，目前普遍使用的CBS抑制劑AOAA對HT29細胞增殖的抑制作用非常微弱，其IC50值為152.5 ± 35.68 μmol/L。

圖2 金絲桃素和AOAA對HT29人結腸癌細胞活力的影響Fig.2 Effects of hypericin and AOAA on the viability of HT29 human colon cancer cells注：A.不同抑制劑對HT29細胞裂解液催化合成H2S的影響；B.不同濃度金絲桃素對HT29細胞活力的影響；C.不同濃度AOAA對HT29細胞活力的影響。Note:A.The H2S-producing activities of CBS and CSE in the HT29 cell lysate were measured in the presence of PAG,AOAA or hypericin.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;B.Effect of hypericin on the viability of HT29 colon cancer cells;C.Effect of AOAA on the viability of HT29 colon cancer cells.

AOAA作為一種極性小分子，細胞膜透性可能較差，這可能是導致AOAA對HT29細胞增殖抑制作用較弱的原因。

3.3 細胞內CBS可能是金絲桃素的靶標之一

為了研究在哺乳動物細胞中CBS蛋白是否作為金絲桃素作用的潛在靶標，利用siRNA干擾HT29細胞內CBS蛋白的表達，結果如圖3A所示。Western blot結果表明與對照組相比siRNA干擾后細胞內CBS蛋白表達量減少到44%。接下來測定了金絲桃素對siRNA干擾后HT29細胞增殖的影響，結果如圖3B所示。金絲桃素抑制細胞增殖的IC50為55.8 ± 5.30 μmol/L，是金絲桃素抑制未處理HT29細胞增殖IC50值的2.5倍。同時，AOAA抑制siRNA干擾后HT29細胞增殖的IC50值增加到304.5 ± 63.01 μmol/L(圖3C)。這些結果表明在哺乳動物細胞內CBS蛋白可能是金絲桃素的靶標之一。

圖3 金絲桃素對siRNA干擾后HT29細胞活力的影響Fig.3 Effects of hypericin on the viability of HT29 cells with siRNA-mediated knockdown of CBS.注：A.使用陰性對照siRNA(NC siRNA)或CBS靶向的siRNA(CBS siRNA)轉染HT29細胞，細胞裂解液進行western blot 分析，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參；B.不同濃度金絲桃素對siRNA干擾HT29細胞活力的影響；C.不同濃度AOAA對siRNA干擾HT29細胞活力的影響。Note:A.HT29 cells were transfected with a negative control siRNA (NC siRNA) or a CBS targeted siRNA (CBS siRNA) for 48 h;then,cell lysates were used for immunoblotting analysis.Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was used as the loading control;B.The IC50 value of hypericin against HT29 cells after the siRNA mediated knockdown of CBS was determined using the CCK-8 assay;C.The IC50 value of AOAA against HT29 CBS knockdown cells.

3.4 金絲桃素體內抗腫瘤活性

為了研究金絲桃素體內抗腫瘤活性，本研究建立了人結腸癌裸鼠原位移植瘤模型。當腫瘤體積達到約100 mm3時，注射高(30 mg/kg·d)、中(10 mg/kg·d)、低劑量(5 mg/kg·d)金絲桃素和AOAA(陽性藥物對照組)進行2周給藥。實驗結果表明和溶劑對照組相比AOAA處理組(10 mg/kg·d)的小鼠體重顯著性降低，說明目前普遍使用的CBS抑制劑AOAA對小鼠具有一定的毒副作用，但是各種劑量金絲桃素處理組(5～30 mg/kg·d)的小鼠體重與溶劑對照組相比均無顯著性變化(表1)。

表1 不同藥物處理對小鼠體重的影響

注：*P<0.05 表示和對照組相比，體重差異有統計學意義。

Note:Compared with control,*P< 0.05.

小鼠給藥2周后被處死，剝離瘤體并稱重。結果表明與溶劑對照組相比不同劑量的金絲桃素(5～30 mg/kg·d)與AOAA處理組均顯著地抑制了腫瘤的生長(圖4A-C)，并且金絲桃素劑量依賴性地抑制腫瘤的生長。相對于溶劑對照組30 mg/kg·d劑量的金絲桃素以及AOAA處理分別使腫瘤重量減少了68%和86%(圖4D)，表明金絲桃素和AOAA均具有顯著的抗結腸癌作用。然而，需要指出的是AOAA的體內抗腫瘤活性可能并不完全歸因于其作為CBS的抑制劑。首先，CBS蛋白主要在細胞質中表達，AOAA必須透過細胞膜才能抑制CBS活性，繼而抑制腫瘤生長。然而本研究表明AOAA僅有非常弱的抑制HT29結腸癌細胞增殖活性，其IC50值為152.5 ± 35.68 μmol/L(圖2C)。其次，AOAA是PLP依賴酶的廣譜性抑制劑，對CBS的選擇性較差[10，11]，AOAA在體內可能還有其它的靶標。綜上所述，本研究結果表明金絲桃素在體內外均具有顯著的抗結腸癌活性。

圖4 金絲桃素抑制人結腸癌裸鼠移植瘤生長Fig.4 Hypericin inhibits tumor growth in human colon cancer xenograft models.注：A.不同給藥處理2周的腫瘤外觀(每組6只小鼠)；B.不同給藥處理腫瘤體積的變化情況；C.不同給藥處理2周腫瘤的體積；D.不同給藥處理2周腫瘤的重量。Note:A.The macroscopic appearance of tumors in BALB/c nude mice 14 days after treatment (n=6 per group);B and C.Hypericin treatment significantly reduced the tumor volume after the s.c.injection of HT29 cells in human tumor xenograft models.Each data point represents the mean ± SD (n=6);D.Mean tumor weight (±SD).*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

AOAA是目前唯一一種被廣泛使用的CBS抑制劑，但其存在抑制作用弱和選擇性差的不足，抑制HT29細胞增殖的IC50值高達152.5 ± 35.68 μmol/L。同時，本研究發現10 mg/kg·d劑量的AOAA對小鼠也具有一定的毒副作用，因此急需獲得高效的CBS選擇性抑制劑。金絲桃素是從金絲桃屬植物中分離得到的一種天然光敏劑[17]，被廣泛用于腫瘤的診斷和光動力學治療研究中[18,19]，金絲桃素介導的光動力學治療可以增強化療藥物順鉑對結腸癌細胞的抑制作用[20]。然而，金絲桃素作為硫化氫合成酶抑制劑的抗腫瘤活性未見報道。本研究結果表明金絲桃素作為CBS的選擇性抑制劑在體內外均具有顯著的抗結腸癌活性。綜上所述，金絲桃素能作為CBS的選擇性抑制劑用于結腸癌的治療研究中。