基于綠色低共熔溶劑法高效提取雞骨草中的黃酮和皂苷

陳 冉，李德慧，阮桂發，劉 珊，孫 科，黃鎖義，歐陽熙林

右江民族醫學院，百色 533000

雞骨草(AbruscantoniensisHance)屬豆科植物廣州相思子，盛產于廣西、廣東、云南等地。具有疏肝止痛、清熱解毒、創面修復之功效，作為臨床常用藥多用于肝炎、胃痛、肝硬化腹水等疾病的治療[1，2]。研究顯示雞骨草中含有大量黃酮類、皂苷類、生物堿類、多酚類等生物活性成分[3，4]。而作為其主成分的黃酮類和皂苷類化合物，具有良好的抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎鎮痛、抗病毒、降血壓、抗氧化等藥理作用，并且在保肝護肝方面療效明顯[5-7]。目前，針對黃酮類和皂苷類的提取多采用傳統有機試劑[8-11]，毒性大，給操作者和環境帶來較大危害。因此，探索一種綠色高效的方法實現雞骨草中黃酮類和皂苷類的快速提取十分必要。

低共熔溶劑(DESs)是繼離子液體之后，被Abbott于2003年首次引入的一種新型綠色溶劑[12]，既繼承了離子液體的大部分優點，又克服了其毒性高、成本高、生物降解性差等缺點。如經細胞毒性實驗研究，大部分的DESs無毒性，且具有良好的生物可降解性[13,14]。DESs主要由氫鍵供體(HBD，常用的季銨鹽)和氫鍵受體(HBA，如羧酸、多元醇、酰胺、氨基酸等)通過較強的分子間氫鍵作用相結合，這也是為何與傳統溶劑相比，DESs具有特殊的物理化學性質，如可忽略的揮發性、粘度可調諧性等。并且，在天然產物提取過程中，DESs因能與溶質間形成較強的分子間氫鍵，其萃取能力遠高于傳統溶劑，甚至對不穩定生物活性成分具有良好的增穩作用[15,16]。

DESs因具有低毒性、生物降解性、可回收性、價格低廉、易于制備、易于儲存等優點，使其在代替傳統有機試劑和離子液體用于天然產物提取方面具有很大的潛力，被逐漸應用于中藥生物活性成分的提取分離，并取得良好效果[13,14,17]。

本實驗設計并制備一系列基于氯化膽堿的DESs，結合星點設計-響應面法(BBD-RSM)探索雞骨草中總黃酮和總皂苷的提取工藝條件，以期提供一個更綠色、經濟、高效的提取新技術，實現黃酮類和皂苷類化合物的有效快速提取，促進雞骨草藥材的進一步開發利用。

1 材料和方法

1.1 植物藥材

雞骨草藥材采購于廣西玉林，由右江民族醫學院藥學院黃鎖義教授鑒定為豆科植物廣州相思子，烘箱干燥后取莖部粉碎，過40目篩，保存備用。

1.2 儀器

UV-1750紫外可見分光光度計(島津)、79HW-1恒溫磁力攪拌器(江蘇金壇市環宇科學儀器廠)、KQ-250DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、HH-ZK600智能恒溫水浴箱(鞏義市英峪高科儀器廠)、FA2004N型電子分析天平(上海民析精密科學儀器公司)、101-3型電熱鼓風干燥箱(上海齊欣科學儀器公司)、FWl77型中草藥粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

1.3 化學藥品和試劑

芹菜素標準品(98%，百靈威)、熊果酸標準品(98.5%，aladdin)；乳酸(優級純)，氯化膽堿(98%，百靈威)、乙二醇、丙三醇、1,3-丁二醇、果糖、木糖醇、葡萄糖、尿素、蘋果酸、乳酸、三乙胺、冰乙酸、高氯酸、香草醛、乙醇，均為分析純。

1.4 低共熔溶劑的制備

參考文獻方法[13]，選用氯化膽堿作為氫鍵供體，分別與9種氫鍵受體按一定的摩爾比混合，在80 ℃水浴中加熱攪拌直至形成透明均一的液體，最終得到9種不同類型的低共熔溶劑(見表1)。

表1 不同類型的低共熔溶劑

1.5 低共熔溶劑種類的篩選

參考文獻中的傳統溶劑提取方法[9]，作為總黃酮和總皂苷初步試驗考察的提取條件。精確稱取1.0 g雞骨草粉末，分別加入20 mL不同類型的低共熔溶劑，45 ℃下超聲提取60 min，并以等體積的50%乙醇代替其他有機試劑作為對照，過濾，待測。

1.6 單因素試驗

選定最合適的低共熔溶劑后，考察低共熔溶劑組分的摩爾比(1∶1，1∶2 ，1∶3，1∶4，1∶5)和含水量(10%，15%，20%，25%，30%，35%，40%)對總黃酮和總皂苷提取效果的影響，并對提取溫度、提取時間和液料比的影響進行初步研究。

1.7 含量測定方法

1.7.1 總黃酮含量的測定

文獻報道三乙胺顯色法(TEA法)比較適用于芹菜素類黃酮成分的含量測定，且以芹菜素或其糖苷做標準品，結果更準確，而雞骨草中含有豐富的芹菜素類黃酮，因此選用芹菜素做標準品[9]。將標準品溶液和提取液中分別加入1%的三乙胺-乙醇溶液顯色，再利用紫外可見分光光度計于200～600 nm波長進行掃描，對不加顯色劑的提取液做相同處理，作樣品空白對照。

基于光譜分析結果，參考文獻方法進行含量測定[9,18]。準確量取0.5 mL“1.5”項下所得提取液于10 mL的具塞比色管中，加入5 mL 1%的三乙胺-乙醇溶液作為顯色劑，用50%乙醇定容至刻度線，搖勻，溶液呈黃色，以不加顯色劑并稀釋同等倍數的樣品為空白，在400 nm處測吸光度。繪制標準曲線，計算提取液中總黃酮的含量。雞骨草中總黃酮提取率的計算公式如下：

X=C×V2×V/(m×V1)

式中，X 為雞骨草中總黃酮提取率(mg/g)，C 為標準曲線中總黃酮的濃度(mg/mL)，V1為取樣體積(mL)，V2為稀釋體積(mL)，V 為提取液總體積(mL)，m 為樣品重量(g)。

1.7.2 總皂苷含量的測定

選用熊果酸作標準品，對加入顯色劑顯色后的標準品溶液和提取液在200～800 nm波長范圍掃描，以不加顯色劑的提取液作空白對照。依據光譜分析結果，參考文獻方法進行含量測定，并略作修改[10,19]。準確量取0.1 mL“1.5”項下所得提取液于10 mL的具塞比色管中，先后加入0.4 mL 5%的香草醛-冰乙酸溶液，0.8 mL高氯酸，輕輕搖勻，于60 ℃水浴中加熱15 min，接著用冰浴迅速冷卻，再用冰乙酸定容至5 mL，搖勻，靜置30 min，以不加顯色劑稀釋同等倍數的樣品為空白，在550 nm處測定吸光度。繪制標準曲線，計算提取液中總皂苷的含量。雞骨草中總皂苷提取率的計算公式同上。

1.8 試驗設計和統計分析

基于單因素實驗結果，優選出最適合總黃酮和總皂苷提取的低共熔溶劑及其成分比例、含水量。以提取溫度(X1)、提取時間(X2)、液料比(X3)3個主要影響因素為獨立變量，以總黃酮的提取率(Y1)或總皂苷的提取率(Y2)為響應變量，利用BBD和RSM設計得到三因素三水平試驗，其真實值和編碼水平分別見表3、表4。

由BBD試驗所得數據均采用Design-Expert 8.06進行多元回歸分析和方差統計分析。

2 結果與討論

2.1 紫外可見吸收光譜圖

為了驗證檢測方法及標準品的選擇是否準確合適，掃描得到標準品和提取液的紫外可見光譜圖。圖1A為采用三乙胺顯色所得到的芹菜素標準品和提取液的光譜圖，如圖所示，標準品和提取液在370～450 nm范圍內均有一個較高的吸收峰，且λmax為400 nm，而樣品空白在此波長范圍內無吸收峰，說明以芹菜素為標準品的三乙胺顯色法適用于雞骨草中總黃酮的檢測，最佳波長為400 nm。圖1B為基于香草醛-冰乙酸-高氯酸顯色所得的熊果酸標準品和提取液的光譜圖，很顯然，選擇在高波長進行檢測時背景干擾可忽略不計，標準品和提取液均在550 nm左右有吸收峰，峰位置一致，說明采用熊果酸作標準品測定雞骨草中的總皂苷是合適的。

圖1 紫外可見吸收光譜圖Fig.1 Uv-vis absorption spectrum注：(A)基于三乙胺顯色；(B)基于香草醛-冰乙酸-高氯酸顯色。Note:(A) color development based on triethylamine;(B) color development based on vanillin-glacial acetic acid-perchloric acid.

2.2 低共熔溶劑的篩選

低共熔溶劑具有獨特的性質，如極性可調諧性、黏度可調諧性、增溶能力等，直接影響目標化合物的提取效率，因此選擇合適的DESs十分重要。但在研究的9種DESs中，有4種DESs(DES-2,DES-3,DES-4,DES-6)與測定總皂苷的顯色劑之間發生顯色反應。最終，采用9種DESs用于雞骨草中總黃酮的提取研究，5種DESs用于總皂苷的提取研究，并以50%乙醇提取作對照，結果見表2。

表2 DESs對雞骨草中總黃酮和總皂苷提取率的影響

由表2可知，對于黃酮化合物來說，DES-1、DES-2、DES-3和DES-7這4種DESs擁有較高的提取率，但DES-8 和DES-9的提取效果卻很差，低于傳統試劑—50%乙醇。然而，對于皂苷化合物來說，結果卻截然相反，DES-8 和DES-9的提取效率遠高于50%乙醇，其次為DES-1、DES-5，而DES-7的提取效果較差。研究的9種DESs中，以DES-4、DES-5、DES-9的黏度最高，其次為DES-2、DES-3和DES-8，黏度最低的是DES-1、DES-7。由此可見，DESs的黏度并非是決定提取能力的關鍵因素。

為了進一步探索低共熔溶劑的性質與提取效率的關系，本實驗將不同濃度的乙醇(40%、50%、60%、70%、80%)用于雞骨草中總黃酮和總皂苷的提取。結果顯示，采用60%乙醇作提取溶劑時，總黃酮和總皂苷的提取率均達到最大值，說明雞骨草中黃酮類和皂苷類化合物的極性相近。因此，若依據“相似相溶”的原理，理論上這幾種DESs對總黃酮和總皂苷的提取效率具有相似的規律。但實驗結果并非如此，說明DESs的極性不是影響提取能力的主要因素。

前人研究顯示DESs主要通過與目標物形成分子間氫鍵和靜電作用而增加其溶解度。研究的9種DESs中，DES1-6含有大量的羥基，DES-7含有大量的氨基，DES8-9含有大量的羧基，均能與黃酮和皂苷化合物形成分之間氫鍵[18-20]。黃酮化合物因含有多個苯環結構，形成π-π大共軛體系，具有很高的電子云密度，而DES的羧基因C=O鍵的電負性強而具有較高的電子云密度，當二者接近時，電子云會因相互排斥而影響氫鍵的穩定性；然而皂苷類化合物沒有π-π共軛體系，不存在電子云相排斥的問題，且較強電負性的C=O有利于氫鍵的形成，這也可以解釋為何含羧基的DESs對總黃酮的提取效果最差而對總皂苷的提取效果最好。因此，在篩選溶劑種類時，推測DESs的組成和結構是影響提取效率的關鍵因素而不是黏度或極性。最終選擇DES-1、DES-8分別作為總黃酮和總皂苷的提取溶劑進行后續研究。

2.3 低共熔溶劑組分摩爾比的影響

DESs組分的比例會直接影響其物理化學性質，如黏度、極性、表面張力等，從而影響提取效果。因此本實驗考察氯化膽堿-乙二醇及氯化膽堿-乳酸的不同摩爾比例分別對總黃酮和總皂苷提取效率的影響，結果見圖2A-B。隨著乙二醇比例的增加，總黃酮的提取效率大幅度提高，當氯化膽堿-乙二醇的比例為1∶2時達到最大值，繼續增加乙二醇，提取率反而降低。造成這種現象的原因是，增加乙二醇含量可降低低共熔溶劑的粘度和表面張力，從而增加目標組分的擴散和質量轉移能力，改善提取效率；但是，氯化膽堿含量太低卻會導致目標組分與低共熔溶劑的相互作用減弱。而氯化膽堿-乳酸的比例對總皂苷提取效率的影響呈相似趨勢，并在1∶4時提取率達到最大值。最終選擇氯化膽堿-乙二醇的比例為1∶2，氯化膽堿-乳酸的比例為1∶4進行后續的試驗研究。

2.4 低共熔溶劑含水量的影響

DESs的含水量是影響目標組分提取效果的重要因素，因此，對不同含水量DESs的影響做考察，結果見圖3A-B。當DESs的含水量由10%上升到40%的過程中，總黃酮和總皂苷提取率均發生顯著變化，呈先增加后降低的趨勢，并且分別在含水量為30%和25%時達到最大值。這是因為少量水的加入能降低DESs的粘度和增加其極性。因此，適量的水能大大改善總黃酮和總皂苷提取效果。但過量的水反而會破壞DESs因氫鍵構建的超分子結構，同時降低DESs與目標組分間的相互作用[20]。最終，分別選擇含水量30%的氯化膽堿-乙二醇和含水量25%的氯化膽堿-乳酸進行后續的試驗研究。

圖2 DESs(氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/乳酸)的組成比例對總黃酮(A)和總皂苷(B)提取率的影響Fig.2 Extraction yields of total flavonoids (A) and total saponins (B) using the DESs (ChCl/ethylene glycol and ChCl/lactic acid) with different ratios

圖3 低共熔溶劑(氯化膽堿/乙二醇、氯化膽堿/乳酸)的含水量對總黃酮(A)和總皂苷(B)提取率的影響Fig.3 Extraction yields of total flavonoids (A) and total saponins (B) using DESs (ChCl/ethylene glycol and ChCl/lactic acid) with different water content

2.5 提取溫度、時間、液料比的影響

初步研究結果顯示，這3個因素對總黃酮和總皂苷的提取效率均有一定影響，并且以提取溫度影響最明顯，因此選用其做星點設計試驗研究。

2.6 星點設計試驗

2.6.1 總黃酮的BBD 試驗

基于單因素實驗結果，采用BBD和RSM進行試驗設計和模型擬合。得到以提取溫度(X1，℃)、提取時間(X2，min)、液料比(X3，mL/g)為獨立變量，以總黃酮的提取率(Y1，mg/g)為響應變量的17個試驗，結果見表3。通過對實驗數據進行多元回歸分析，得到代表總黃酮提取率的二階多項式方程：

Y1= 0.635 + 0.038X1-5.566×10-3X2+ 0.244×10-4X3+ 1.494×10-4X1X2-8.125×10-4X1X3+ 2.7×10-4X2X3-1.233×10-4X12-6.763×10-5X22-6.202×10-3X32

方差分析(ANOVA)被用于評估獨立變量和響應變量的關系以及提取方法的最佳條件，結果見表5。模型的F-value為47.08，P<0.000 1，說明建立的模型達到極顯著水平，具有統計學意義。失擬項(Lack of fit)表示模型預測值與實際值不擬合的概率，其P值為0.299 5，說明失擬項不顯著，該模型選擇合適。R2為0.983 7進一步表明該模型擬合成功。ANOVA 中，P-value代表各因素對響應值影響的顯著性，P越小，該因素的影響越顯著。因此，依據表5中數據可知，一次項X1(提取溫度)、X3(液料比)和二次項X32對總黃酮提取率的影響均達到極顯著水平(P<0.01)，交互項X1X3則達到顯著水平(P<0.05)，而X2(提取時間)的影響較小。

表3 總黃酮的星點設計試驗條件及結果

三維響應面法能更形象的展示響應值與變量的關系及各變量間的相互影響。圖4A～C為提取溫度、提取時間、液料比的交互作用對總黃酮提取效果的影響結果。如圖4A，隨著提取溫度的升高，總黃酮的提取率大幅度增加，影響十分顯著，因為高溫能加快DESs的滲透作用，促進目標組分從植物體向DESs中轉移；但改變提取時間，提取率只有微小的變化。如圖4B，液料比在低溫下比在高溫條件下對總黃酮的提取率的影響更大，說明這2種因素相互影響；隨著液料比的增加，提取率呈先增加后降低的趨勢，這是由于溶劑太少時藥材和試劑接觸不充分，不利于提??；而溶劑太多會引起其他雜質成分溶出增加，反而降低目標組分的溶出。

考慮到超聲提取溫度太高時不易控制，且提取率的增加幅度在高溫階段趨于平緩，而提取時間的影響很小，為節省能源，最終選取提取溫度為80 ℃，提取時間為40 min。

2.6.2 BBD test for總皂苷

采用BBD法，以提取溫度(X1，℃)、提取時間(X2，min)、液料比(X3，mL/g)為獨立變量，以總皂苷的提取率(Y2，mg/g)為響應變量設計3因素3水平的共17個試驗，數據結果見表4。通過對實驗數據進行多元回歸分析，得到代表總皂苷提取率的二階多項式方程：

Y2=-3.464 + 0.204X1+ 0.206X2+ 0.506X3+ 4.375×10-5X1X2-1.016×10-3X1X3-3.281×10-4X2X3-7.797×10-4X12-1.489×10-3X22-3.689×10-3X32

方差分析(ANOVA)結果見表5。模型的F-value為23.77，說明該模型具有統計學意義。模型失擬項的P值為0.425 3，說明失擬項不顯著，該模型選擇合適。較大的R2值進一步表明該模型擬合成功。X1(提取溫度)、X3(液料比)、X22、X32的P-value均小于0.05，說明這幾項對總皂苷的提取率影響顯著。

圖4D-F為提取溫度、提取時間、液料比的交互作用對總皂苷提取效果的影響三維響應面圖。圖4D中，隨著提取溫度的升高，總皂苷的提取率明顯提高，并在達到高溫后，增幅趨于平緩。圖4E中，隨著液料比的增加，總皂苷的提取率呈先增加后降低的趨勢，并且在低溫條件下比在高溫條件下的變化幅度大。提取時間對提取率的影響也是呈先增加后降低的趨勢，但變化幅度較小，見圖4F。

最終得到總皂苷的最佳提取條件：溫度為80 ℃，時間為64.18 min，液料比56.12∶1。

由圖4A-F可看出，提取溫度、提取時間、液料比及其交互作用對總黃酮和總皂苷提取率影響的趨勢相似，各因素的影響顯著性：提取溫度﹥液料比﹥提取時間。

表4 總皂苷的星點設計試驗條件及結果

表5 總黃酮和總皂苷提取率的二次模型的方差分析數據統計

注：P﹤0.05，表示差異顯著；P﹤0.01，表示差異極顯著。

Note:P﹤0.05,indicated significant difference;P﹤0.01,indicated extremely significant difference.

圖4 總黃酮(A～C)和總皂苷(D～F)的響應面圖Fig.4 The response surfaces of total flavonoids (A-C)and total saponins(D-F)

2.7 模型驗證

根據建立的數學模型，得到總黃酮的優化提取條件為：提取溫度80 ℃、提取時間40 min、液料比15.28∶1，此條件下預測總黃酮的提取率為4.956 mg/g；總皂苷的優化提取條件：提取溫度80 ℃、提取時間64.18 min、液料比56.12∶1，此條件下預測總皂苷的提取率為26.814 mg/g?？紤]到實際操作，將提取時間和液料比稍加調整為整數。按優選的工藝條件平行提取3次，得到總黃酮和總皂苷的平均提取率分別為 4.967、26.569 mg/g，與預測值十分接近，說明由建立的模型優選工藝條件是合理、可靠的。

2.8 方法對比

將文獻報道方法[9,10]用于雞骨草中總黃酮(50%乙醇，按液料比20∶1，超聲提取50 min)和總皂苷(50%乙醇，按液料比25∶1，超聲提取25 min)提取，并與本實驗優化的條件進行對比。結果，總黃酮和總皂苷的提取率分別提高33.3%、96.4%。說明本研究建立的方法更加高效、簡單，具有較好的應用前景。

3 結論

本實驗建立了一種綠色、高效、經濟的提取方法。DESs的性質，如粘度、極性及組成影響對目標組分的提取率均有影響，而DESs的組成和結構在改善目標組分提取效率中擔任重要角色。在研究的9種DESs中，氯化膽堿-乙二醇和氯化膽堿-乳酸分別是最適用于總黃酮和總皂苷的提取溶劑。采用單因素試驗，結合星點設計和響應面法能快速、準確篩選出工藝參數；總黃酮的最佳提取條件∶摩爾比為1∶2、含水量為30%的氯化膽堿-乙二醇作溶劑，提取溫度80 ℃，提取時間40 min，液料比15∶1；總皂苷的最佳提取條件∶摩爾比為1∶4、含水量為25%的氯化膽堿-乳酸作溶劑，提取溫度80 ℃，提取時間64 min，液料比56∶1。結果顯示，與傳統有機試劑提取方法相比，DESs擁有明顯優勢，總黃酮和總皂苷的提取率分別提高33.3%、96.4%。DESs有望應用于更多植物源中生物活性成分的研究。