甲氧蟲酰肼對蠶體谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的影響

呂艷艷 吳朋飛 王 飛 嚴會超 徐 成 王葉元※

（1.華南農業大學動物科學學院蠶絲科學系 廣東廣州 510642；2.華南農業大學藝術學院 廣東廣州 510642）

1 前言

家蠶是一種以桑葉為主飼料且能吐絲結繭的經濟昆蟲，在農業生態系統中，家蠶與其它昆蟲相比對農藥更為敏感，蠶體直接接觸或食下被農藥嚴重污染的桑葉時都會引起家蠶急性中毒或慢性中毒，因此它是一種我國農藥登記中環境生態的非靶標生物，也是廣泛用于科學研究的模式昆蟲之一[1]。

蠶品種、農藥類別和發育階段等多種因素都會影響到農藥對家蠶的毒性。一般情況下，除蟻蠶外，二齡蠶對農藥最為敏感，對其他齡期來說，齡期越大越不敏感。但是五齡期比較特殊，五齡中后期蠶會對農藥比低齡期更為敏感，即使添食微量的農藥也會導致家蠶結畸形繭或不結繭，使羽化后的雌蛾產卵量降低或不產卵。除此之外，也不是所有的農藥對家蠶都表現為急性致死效應，因此在評價作用機制比較特殊的殺蟲劑（例如甲氧蟲酰肼）對家蠶的毒性時，還應對它的生長發育及生理變化等情況做進一步觀察和研究[1～2]。

1.1 甲氧蟲酰肼簡介

農藥種類繁多，依據用途不同可將其分為：殺蟲劑、植物生長調節劑、殺菌劑、殺軟體動物劑、殺鼠劑、殺線蟲劑、除草劑等七個大類。

甲氧蟲酰肼是一種新型的殺蟲劑類型的農藥，主要適用于殺害鱗翅目害蟲，在昆蟲發生自然蛻皮之前的任何時間它都可以對昆蟲產生抑制蛻皮作用[3]。其原理是它的結構與鱗翅目昆蟲分泌的蛻皮激素相似，會導致鱗翅目類昆蟲提前發生蛻皮反應，但是由于體內的某些物質不足而不能形成新表皮，最后昆蟲會脫水或者饑餓而最終死亡。甲氧蟲酰肼以觸殺作用為主，也有少量的內吸作用。目前甲氧蟲酰肼已經被廣泛應用于蔬菜、小麥、果樹、棉花等農作物的田間鱗翅目害蟲（如甜菜夜蛾）的防治。因此，它成為桑園相鄰的農田害蟲防治中比較常用的農藥之一。

國內外對甲氧蟲酰肼的研究較多，主要是研究甲氧蟲酰肼對鱗翅目類害蟲的毒性。研究表明甲氧蟲酰肼對棉鈴蟲、玉米螟、甘薯麥蛾、甜菜夜蛾、薊馬、斜紋夜蛾、大螟、美國白蛾、楊小舟蛾、茶尺蠖、黃夜螟、菜青蟲等多種鱗翅目害蟲都有毒害作用，其中有些是關于甲氧蟲酰肼對上述某種鱗翅目害蟲的毒性、安全性評估、生理生化影響的研究[4～5]。

但關于甲氧蟲酰肼對家蠶的研究文獻較少，有關于甲氧蟲酰肼對家蠶的發育、變態和主要蛋白合成的影響[6]，及阿維菌素和甲氧蟲酰肼兩種農藥分別對家蠶的毒性及混合后對家蠶的毒性，并根據毒性測定結果進行了安全評估[7]。

1.2 谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶概況

谷丙轉氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，簡寫GPT）與蠶體內的蛋白質代謝有關。

丙氨酸是蠶絲的主要合成原料，故丙氨酸的生成量能夠在很大程度上影響蠶絲的生成量。而丙氨酸的合成有兩條主要途徑：I. 桑葉里的大量天門冬氨酸可以通過谷丙轉氨酶的作用及草酰乙酸的脫酸作用生成丙氨酸；II. 在輔酶Ⅰ的遞氫作用下，乳酸脫氫酶與谷氨酸發生偶聯反應，并在谷丙轉氨酶的作用下生成丙氨酸。在這兩條途徑中，谷丙轉氨酶都發揮了重要的作用，因此谷丙轉氨酶可以作為預測蠶桑經濟性狀的重要指標之一。

谷草轉氨酶（Glutamic-oxalacetic transaminase，簡寫GOT）也是蠶體內一種比較重要的酶，它大量存在于家蠶后部絲腺，跟谷丙轉氨酶的作用一樣，可以把谷氨酸轉化為絲素蛋白的主要氨基酸之一——甘氨酸。谷草轉氨酶也可以作為桑蠶經濟性狀的重要生化指標。

一些研究結果表明家蠶后部絲腺的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的活性與家蠶的繭質相關，五齡第三天呈顯著正相關，第五天則相關不顯著，第七天卻變為極顯著負相關。因此這兩種酶可作為預測家蠶產絲量的重要生化指標[9]。

關于蠶體不同部位谷丙轉氨酶含量的研究，劉限[10]測定了春柞蠶不同品種的中部、后部絲腺的谷丙轉氨酶活性，研究結果表明谷丙轉氨酶的含量是影響蠶絲質量的重要指標。關于蠶體內谷草轉氨酶的研究則特別少，關于谷草轉氨酶的研究大部分都是關于人體肝臟的。研究農藥對動物的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的含量的影響[11～13]，主要研究對象有魚類、哺乳動物類等。張彬彬[11]研究了農藥乙草胺對泥鰍肝臟內的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的活性的影響，主要通過不同濃度的乙草胺溶液浸泡泥鰍不同的時間后，測定泥鰍肝臟內的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶來研究該農藥對泥鰍生理生化的影響，該實驗結果表明：用乙草胺處理泥鰍一定時間可誘導其組織內的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的活性提高，除此之外乙草胺濃度和暴露時間與泥鰍的谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶的活性變化存在一定的劑量、時間效應關系。

1.3 研究意義及目的

家蠶是一種鱗翅目昆蟲，它是以桑葉為主飼料的寡食性昆蟲，其生長發育容易受到環境、飼料、病原微生物等因素影響，特別是桑園種植規模零星、分散，或與其它農作物混種，由于農藥使用不規范，環境污染越來越嚴重，養蠶安全逐漸受到關注。本文研究添食不同濃度的甲氧蟲酰肼對家蠶體內的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的影響，為家蠶的風險評估和制定家蠶安全健康養殖措施提供數據參考。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 藥品和試劑

谷草轉氨酶試劑盒（南京建成生物研究所），谷丙轉氨酶試劑盒（南京建成生物研究所），無水乙醇，85 %磷酸溶液，生理鹽水，考馬斯亮藍 G-250 ，標準蛋白溶液，99.1 %甲氧蟲酰肼原藥（由上海市農藥研究所有限公司生產，北京北納創聯生物技術研究所供應）。

2.1.2 儀器設備

玻璃十字柄勻漿器，離心機，天平，制冰機，冰箱，離心管，移液槍，量筒，燒杯，水浴鍋，紫外分光光度儀，容量瓶，錐形瓶，試管，比色皿，試管架，烘箱，玻璃棒。

2.1.3 實驗動物

9·芙蠶品種，由廣東省蠶業技術推廣中心提供。

2.2 方法

2.2.1 甲氧蟲酰肼添食方法

將桑葉完全浸泡在不同濃度的甲氧蟲酰肼溶液 10 s后，晾干，給家蠶添食。

2.2.1.1 二、三齡蠶添食方法

根據預試驗結果，96 h LC50為 0.144 mg a.i./L及GB/T31270.11 -2014 化學農藥環境安全評價試驗準則第 11部分：家蠶急性毒性試驗、中華人民共和國農業行業標準——化學農藥 家蠶慢性毒性試驗準則（征求意見稿）。將二、三齡蠶分為9個組，一個空白對照組，一個溶劑對照組和 7個不同濃度的甲氧蟲酰肼添食組，組距為 1.5，每組 3個平行，每個平行 25 頭蠶，同時在相同條件下養第四個平行30 頭蠶以備用。每組的編號及添食操作情況如表1。

其中受試物濃度的配置方法是：①稱取 0.01261 g受試物，用 0.4 mL N,N-二甲基甲酰胺和 0.025 g吐溫 80 溶解后，加入適量去離子水，轉移進50 mL容量瓶中，定容得到濃度為250 mg a.i./L的受試物溶液。②將該濃度的受試物濃度用去離子水稀釋到所需濃度。③溶劑對照組配制方法主要為先量取0.4mL N,N-二甲基甲酰胺和0.025 g吐溫80 加入50 mL容量瓶中，用去離子水定容至標線，得到溶劑對照組貯備液1。從中取0.5 mL于50 mL容量瓶中，用去離子水定容至標線，得到溶劑對照組貯備液 2。④從溶劑對照組貯備液2中量取6.40 mL于200 mL容量瓶，配制成溶劑對照組溶液。

表1 浸葉法—試驗分組及濃度設計

空白組的桑葉不用浸泡。試驗組和溶劑對照組在二齡起至三齡末期間添食不同濃度處理的桑葉，四至五齡添食正常桑葉。五齡第八天取樣蠶，-80 ℃的冰箱中保存以備使用。

2.2.1.2 五齡蠶添食方法

五齡家蠶采用同樣的分組方法，組距為1.8，受試物的配置方法與 2.2.1.1相同，但是受試物濃度分別為 1.63 ×10-4mg.a.i./L，2.94 ×10-4mg.a.i./L，5.29 ×10-4mg.a.i./L，9.53×10-4mg.a.i./L，1.71 ×10-3mg.a.i./L，3.09 ×10-3mg.a.i./L，5.56 ×10-3mg.a.i./L。從五齡起開始喂食，在五齡第八天取樣。

2.2.2 組織液獲取方法

在五齡第八天，每組的每個平行中隨機取1頭蠶，每組共3頭蠶，在-80 ℃存儲。實驗前取出蠶稱重，再與其體重9倍的生理鹽水混合后用玻璃十字柄勻漿器在冰水環境下研磨混勻后倒入離心管離心，2500 r/min離心10 min后，取上清液2 mL保存于離心管中做標記，并將這些標記好的上清液存于-40 ℃的冰箱中保存以待測量。剩余的上清液取出放入一個離心管內標記好保存在-40 ℃冰箱中另放好以備用。

2.2.3 測定蛋白質濃度的方法

主要采用考馬斯亮藍G-250 法測定[14]。

2.2.4 谷丙轉氨酶的測定

按試劑盒要求操作。

2.2.5 谷草轉氨酶的測定

按試劑盒要求操作。

2.2.6 數據分析處理

本次數據分析使用的軟件主要是 Microsoft Office家庭版和學生版2016 的Exce1和SPSS.24.0。Excel用來計算蛋白質濃度及谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的含量。SPSS軟件主要通過單因素方差分析比較來對添食不同濃度甲氧蟲酰肼的最終酶含量與對照組進行顯著性差異分析（P＜0.05）。如果差異性達到顯著關系再用Duncan’s多重比較分析。數據分析的結果均以“平均數±標準誤差a，b…”呈現。寫字母代表Duncan’s多重分析結果。

3 結果

3.1 蛋白質測定結果

3.1.1 標準曲線的測定

蛋白質測定標準曲線的結果如表 2。制作標準曲線如圖1，得到的回歸方程為y=0.0006 x-0.0213 ，用該公式計算蛋白質濃度，見表3。

表2 蛋白質測定標準曲線數據

圖1 測定蛋白質的標準曲線

3.1.2 蛋白質濃度結果

表3 蛋白質濃度結果

3.2 酶含量的測定結果

3.2.1 二三齡期添食酶含量

表4 二、三齡添食酶含量測定結果

從表 4可以看出，二、三齡蠶谷草轉氨酶活性，除了T3和 T7兩組之外，其它試驗組與對照組間都有顯著性增加。谷丙轉氨酶活性，除了 T3和 T7兩組，其它試驗組與對照組之間有顯著性增加。

3.2.2 五齡期添食酶含量

表5 五齡添食酶含量測定結果

五齡添食酶含量測定結果見表 5，谷草轉氨酶活性除了T4、T6和T7試驗組的結果顯著低于空白對照組外，其他試驗組與空白對照組都沒有顯著差異，且所有試驗組都與溶劑對照組沒有顯著差異。谷丙轉氨酶活性，試驗組 T2、T3、T5、T6與空白對照組之間有顯著增加；而與溶劑對照組相比，則只有T3和T5兩組有顯著差異。

4 討論與結論

4.1 討論

4.1.1 不同齡期對農藥敏感性不一樣

根據實驗結果可以看出，二、三齡蠶添食甲氧蟲酰肼，除了濃度為 2.27 ×10-3mg.a.i./L，1.40 ×10-2mg.a.i./L，其他添食濃度谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶含量有顯著增加。而五齡添食甲氧蟲酰肼，則大部分濃度都不會導致兩種酶的含量顯著增加，該結果與來有鵬[1]認為家蠶不同齡期對農藥的敏感程度是不一樣的結論相符。

4.1.2 家蠶生理變化與繭質調查結果

課題組后續調查了添食上述不同濃度的甲氧蟲酰肼對家蠶繭質的影響，結果表明二、三齡添食的蠶，試驗組全繭量、繭層量、繭層率和蛹重都相對對照組隨濃度的增加而降低，但經生物統計分析它們之間均無顯著差異。結合本實驗的結果推測可能是二、三齡添食甲氧蟲酰肼后，導致蠶體內蛋白代謝紊亂，故蠶體組織內谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶活性總體上有所增加，此時蠶體吸收的營養物質主要用于生長發育，并不是用于合成絲物質和造卵，故對蠶體后部絲腺的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶的含量并沒有顯著的變化，因此對繭質影響不大。

五齡蠶添食，試驗組全繭量、繭層量、繭層率和蛹重都相對對照組有顯著降低，并呈現出隨濃度的增加而降低的規律。五齡一直添食甲氧蟲酰肼，導致蠶體組織蛋白代謝紊亂，五齡期蠶消化吸收的營養主要用于絲物質合成，我們測定的是第八天的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶含量，有些濃度有差異、有些沒差異，可能我們測的是蠶體，而不能完全反應絲腺組織的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶，彭衛平[9]研究結果認為家蠶后部絲腺的谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶的活性與家蠶的繭質相關，五齡第三天呈顯著正相關，第五天則相關不顯著，第七天為卻變為極顯著負相關?？赡懿煌瑵舛鹊拿富钚耘c家蠶繭質也存在正相關或負相關。

4.1.3 建議

本實驗只研究了不同齡期和不同濃度的甲氧蟲酰肼對蠶的影響。甲氧蟲酰肼對蠶的毒性影響不僅受到齡期，藥物濃度等因素的影響，它還可能受到蠶品種，添食方法等多種因素影響。本次實驗結果表明即使是微量的甲氧蟲酰肼也會對家蠶的生理造成一定的影響，并會對繭質造成影響。因此，建議桑園一定要建立在遠離可能會使用甲氧蟲酰肼等農藥的農田，除此之外，也要十分注意桑園用水是否會受到甲氧蟲酰肼污染。

4.2 小結

不同齡期蠶食下不同濃度甲氧蟲酰肼的桑葉，谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶含量的變化規律不同。二、三齡蠶添食，除了個別濃度，大部分濃度蠶體內的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶都有顯著增加。而五齡蠶只有個別濃度蠶體的谷草轉氨酶和谷丙轉氨酶有顯著差異。