間充質干細胞外泌體治療小鼠干眼的療效評價△

李娟 周穎 譚鋼 王甜 鮮盼盼 龍乾發

外泌體(exosome)是細胞胞外囊泡的一種，直徑30～150 nm，由細胞內多囊泡體與質膜融合后從胞膜釋放，攜帶大量的蛋白、脂類和核酸如microRNA(miRNA)等[1]，近年來其作為治療藥物、運輸載體、生物學標記物等備受關注[2]。有研究證實，間充質干細胞外泌體(mesenchymal stem cells derived exosomes，MSC-Exo)參與免疫抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、炎癥反應、細胞自噬、組織損傷的修復等許多病理生理過程[3]。新近證據表明，MSC-Exo對眼底疾病如年齡相關性黃斑病變、脈絡膜黑色素瘤、眼底缺血性病變及新生血管性疾病等具有積極治療潛能，而且還對角膜移植排斥反應有抑制作用[4-6]。盡管如此，目前尚無MSC-Exo治療干眼的相關研究，同時考慮干眼發生的最關鍵因素是眼表炎癥[7-8]，因此推測MSC-Exo對小鼠干眼模型具有一定的治療作用。本課題利用苯扎氯銨連續滴眼建立小鼠干眼模型，而后接受MSC-Exo或PBS處理，通過淚膜功能及系統的組織學分析研究其對小鼠干眼模型的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物選取32只健康雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，體質量18～22 g，購于西安交通大學醫學部實驗動物中心，為無特定病原體級實驗動物(SPF級動物)。使用裂隙燈顯微鏡及眼底鏡檢查眼前節、眼底無異常。將24只小鼠置于標準環境：室溫(25±1) ℃，濕度(60±10)%，交替的12 h明暗周期(800～2000)。所有的小鼠都給予相同的水量和食物。本研究所涉及的全部研究方法均遵循《赫爾辛基宣言》，動物實驗符合視覺與眼科協會規定的對于動物眼科和視覺研究的使用，同時獲得了西安交通大學醫學部(陜西省)動物倫理委員會批準。

1.1.2 人臍帶血MSC-Exo滴眼液的制備MSC-Exo滴眼液的制備(中國發明專利申請號201811538991.3)：MSC-Exo經提取、鑒定，-80 ℃保存備用[9]。25 g·L-1外泌體，準備密封容器，配置輔配料，滴眼液配置，最終分裝成無菌方便使用的制劑。

1.2 方法

1.2.1 分組及處理32只(64眼)健康雄性BALB/c小鼠，隨機分為 A、B、C、D四組，每組8只(16眼)。除D組正常對照的8只不予處理外，其余24只均以2 g·L-1苯扎氯銨滴雙眼，每天2次，連續2周，建立中重度干眼模型[10]。造模成功后開始治療，A組選用MSC-Exo滴眼液滴眼，每天3次，連續7 d；B組PBS緩沖液滴眼，每天3次，連續7 d；C組為陰性對照組，造模后不予治療。分別在治療前和治療后第1、4、7天觀察實驗小鼠淚膜功能相關指標，包括：淚液分泌實驗(SchirmerⅠtest，SⅠT)、淚膜破裂時間(tear break-up time,BUT)、角膜熒光素染色(corneal fluorescein staining,FL)評分。于相應時間點收集其角結膜組織，行蘇木精-伊紅染色及透射電子顯微鏡下觀察角膜上皮組織超微結構變化。

1.2.2 SⅠT檢測取酚紅棉線，一端置于小鼠右眼外眥中外1/3處，計時60 s。用游標卡尺測量酚紅棉線紅色部分的長度，計算淚液分泌量[10]。進行每次檢查時應注意控制變量，應由同一人在相同的時間、地點、照明亮度、濕度及溫度下操作。

1.2.3 BUT檢測使用1 μL 10 g·L-1熒光素鈉滴眼液滴入實驗小鼠結膜囊中，使其瞬目，在裂隙燈顯微鏡鈷藍光下觀察記錄角膜染色區出現第1個破裂點的時間[11]。進行每次檢查時應注意控制變量，應由同一人在相同的時間、地點、照明亮度、濕度及溫度下操作。

1.2.4 角膜FL評分用1 μL 10 g·L-1熒光素鈉滴眼液滴入實驗小鼠結膜囊中，使其瞬目，在裂隙燈顯微鏡下觀察各組小鼠角膜上皮缺損的部分及范圍。評分參考文獻[11]將角膜劃分為4個象限，每一象限0-3分，每個象限評分標準為：(1)0分：無染色；(2)1分：輕度染色<5個點；(3)2分：中度染色≥5個點；(4)3分：重度染色≥5個點，并有絲狀染色或潰瘍，總分上限為12分。

1.2.5 HE染色治療1周后收集各組實驗動物的角膜及結膜組織，40 g·L-1多聚甲醛固定后，常規石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色。顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.6 透射電子顯微鏡觀察參照文獻[11-12]，實驗動物角膜標本經體積分數2.5%戊二醛前固定2 h，10 g·L-1鋨酸固定1～2 h，乙醇梯度脫水,包埋，經枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾雙重染色后于透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統計學方法使用SPSS 20.0統計軟件及GraphPad Prism 7.00處理實驗數據，計量資料以均數±標準差表示，計數資料用χ2檢驗；兩組治療前后及兩組間同一時間點的均數比較采用重復測量設計方差分析，三組比較采用方差分析后的兩兩比較，檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 各組小鼠治療前后干眼檢測指標結果比較治療前以及治療后各時間點A、B、C三組與D組SⅠT、BUT差異均有統計學意義(均為P<0.05)，治療前A、B、C三組間差異均無統計學意義(均為P>0.05)。治療后第1天，各組SⅠT及BUT均未見明顯改變，組間差異均無統計學意義(均為P>0.05)。治療后第4天、第7天：A組SⅠT顯著增加，BUT延長，治療前后差異均有統計學意義 (均為P<0.05)。B組SⅠT、BUT無明顯改變，治療前后差異均無統計學意義(均為P>0.05)。C組各項指標差異均無統計學意義(均為P>0.05)。第4天、第7天，A組SⅠT較B組、C組明顯增加，A組BUT較B組、C組明顯延長，差異均有統計學意義(均為P<0.05)。D組各時間點差異均無統計學意義(均為P>0.05)。

2.2 角膜FL評分A組治療后第7天，角膜基本透明，未見著染(圖1A)；B組治療后第7天，角膜可見點片狀著染(圖1B)；C組整個角膜FL評分區域明顯增加，呈點片狀著染(圖1C)；D組角膜光滑，透明，未見著染(圖1D)。

A、B兩組治療前和治療后第1天角膜FL評分相比較，差異均無統計學意義(tA=0.341,tB=0.512,均為P>0.05)，兩組間治療前和治療后第1天角膜FL評分比較，差異均無統計學意義(tA=0.469,tB=0.573,均為P>0.05)。治療后第4天、第7天，A組角膜FL評分較治療前明顯好轉，差異有統計學意義(均為P<0.05)，而B組角膜FL評分較治療前無明顯變化，差異無統計學意義(t4=7.432,t7=1.143,均為P>0.05)；兩組FL評分相比，差異有統計學意義(t4=5.893,t7=2.214,均為P<0.05，見表3)。C組、D組未行任何處理，治療后第1、4、7天 FL評分均未見明顯改變(均為P>0.05)。

表1 各組小鼠治療前和治療后各時間點SⅠT比較

表2 各組小鼠治療前和治療后各時間點BUT比較

表3 各組小鼠治療前和治療后各時間點角膜FL評分比較

圖1 治療后第7天，各組小鼠角膜FL染色情況。A～D分別表示A組、B組、C組、D組

2.3 各組小鼠角膜HE染色情況比較正常角膜上皮HE染色常表現為整齊排列的4～6層上皮細胞，基底細胞為單層柱狀上皮細胞層，排列緊密整齊。A組治療后第7天，角膜上皮細胞層數為(5±1)層，組織形態基本恢復正常,大致整齊(圖2A)。B組治療后第7天角膜上皮細胞層數為(8±1)層(圖2B)，伴有表層上皮細胞損傷、脫落，角膜表面欠光滑(圖2B，箭頭所示)。C組滴眼后2周，角膜上皮細胞層數開始增多，上皮厚度增加，翼狀細胞及基底細胞排列紊亂(圖2C)。D組角膜上皮細胞HE染色排列緊密整齊，表現正常(圖2D)。各組小鼠角膜上皮層數A組較B組、C組明顯減少，差異均有統計學意義(均為P<0.05)，與D組相比，差異均無統計學意義(均為P>0.05)。

2.4 各組小鼠角膜超微結構的變化正常角膜上皮細胞會向外伸出許多微絨毛和微皺襞，排列整齊。通過透射電鏡下可見A組豐富的微絨毛，呈指狀突起，排列規則(圖3A)；B組存在微絨毛脫落、缺失，排列紊亂(圖3B)；C組未進行治療，角膜上皮微絨毛可見明顯減少、脫落、缺失，排列紊亂；D組角膜上皮微絨毛形態呈指狀突起，排列整齊，數量多；C組也與A組和D組有很大差別(圖3C、D)。

圖2 治療后第7天各組小鼠角膜組織HE染色情況。A～D分別表示A組、B組、C組、D組。*示排列紊亂的基底細胞及翼狀細胞

圖3 治療后第7天各組小鼠角膜組織透射電鏡下超微結構情況(×10 000)。A～D 分別表示A組、B組、C組、D組

3 討論

外泌體是直徑30～150 nm的雙分子層囊泡，可以由幾乎所有類型的細胞分泌釋放出來，其中含有多種物質，且其內容物可隨分泌細胞種類的不同而改變，在血液等體液內傳播，包括外周血、尿液、唾液等，幾乎分布于全身各處[13-16]。最初研究認為，外泌體就是一種簡單的細胞排泄物，不具備生物學功能。然而，越來越多的研究證實外泌體在細胞間的交流通訊中發揮著重要作用，它能夠攜帶其來源細胞的蛋白質、脂質及核酸，并將這些物質傳遞給附近或遠處的受體細胞進而傳遞生物信號，影響細胞的微環境并調節相關蛋白的表達。此外，還有研究表明，外泌體還能夠促進T細胞的免疫性能,通過呈遞抗原到CD4+或CD8+ T細胞，激活或者抑制免疫系統和調節補體系統來參與免疫反應的調節，進而很好地抵抗細菌的感染,抑制T淋巴細胞增殖和IFN-γ的釋放，促進抗炎分子IL-10的分泌，并降低炎癥分子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12的轉錄[13]。同時，外泌體富含重要的蛋白和基因，具有調控和誘導修復受損組織細胞的功能[3-4]。而且與細胞相比，外泌體更加穩定而且儲備容易，能夠避免細胞治療所帶來的致瘤、致栓的不良后果，在體內或局部給藥后發生免疫排斥反應的可能性小[6，17]。

目前，干眼患者在眼科門診就診的患者中占比率較大，2017年國際淚膜和眼表協會干眼疾病工作組第二次會議(TFOS DEWS Ⅱ)的統計數據顯示干眼患者正逐年增加，患病率在全球達到了5%～50%[8，18-19]。而炎癥因素被認為是干眼的主要致病因素[19-21]，因此本研究針對外泌體具有免疫抗原呈遞、抑制炎癥因子參與免疫調節、細胞自噬及組織損傷的修復等生物功能[13]，而展開了外泌體對干眼治療的研究。本研究采用苯扎氯銨誘導的小鼠干眼模型、臍帶血MSC-Exo作為研究材料。其中，苯扎氯銨是臨床滴眼液中常用的防腐劑，經研究證實由苯扎氯銨誘導的小鼠干眼模型不僅在眼部臨床體征上和人類干眼相似，在眼部組織病理改變中也與人類干眼改變大致相同[10,12]。而間充質干細胞是最容易獲得的主要細胞之一，可以很容易地從脂肪組織、臍帶血、肝臟、羊水、胎盤等多種組織中提取得來[13]。賈喆等[6]的研究中將MSC-Exo應用于角膜移植的動物模型，證實MSC-Exo對角膜移植排斥反應有一定的抑制作用。本研究通過將MSC-Exo制成混懸液對干眼模型小鼠進行治療，發現外泌體混懸液能使干眼小鼠SⅠT增加，BUT延長，角膜FL染色評分降低，從而表明MSC-Exo混懸液對干眼模型小鼠有一定的治療作用。同時經外泌體治療后小鼠角結膜的組織病理學及超微結構檢測的結果也表明，經外泌體治療后，小鼠角膜和結膜中浸潤的炎癥細胞較前減少，而且角膜上皮細胞形態更加規整，透射電鏡結果顯示外泌體治療后的角膜上皮細胞連接規則，排列整齊，微絨毛濃密，相比模型組的微絨毛脫落和細胞連接缺失展現了明顯的治療效果。從而說明MSC-Exo混懸液可以減輕干眼小鼠角膜上皮的損傷，從而對干眼產生治療作用。

眼表炎癥目前被認為是干眼發生的關鍵因素，有研究表明，IL-6、IL-8、IL-1β 和 TNF-α在各種類型的干眼患者及動物模型中均呈現高表達，干眼的結膜及角膜上皮本身均可以產生 IL-1β 和TNF-α，它們不僅對干眼眼表炎癥的發生及發展具有重要作用，而且其表達水平與干眼的嚴重程度正相關。本研究結果表明，MSC-Exo能夠降低炎癥分子IL-1β、IL-6、TNF-α的轉錄，激活或者抑制免疫系統和調節補體系統來參與免疫反應的調節，由此我們推測，MSC-Exo混懸液可以通過降低這些與干眼相關的炎癥分子IL-1β、IL-6、TNF-α而減輕干眼小鼠角膜上皮的損傷[11,19,22]。由于客觀原因的限制，本研究并未進行相關炎癥因子的進一步檢測，將在后續研究中對外泌體治療干眼的具體機制進行進一步研究。同時，有研究表明，外泌體和自噬存在協調機制，相互影響參與清除和排出細胞內受損或過剩的蛋白和細胞器[23]，那么外泌體是否還能通過影響細胞自噬而調節淚液蛋白的分泌而對干眼起到一定的治療作用還有待進一步研究。