蟬擬青霉類枯草桿菌蛋白酶基因的克隆及其序列和蛋白質分析

陳官菊，柴一秋，厲曉臘，方 鳴，劉又高，金軼偉

(浙江省亞熱帶作物研究所，浙江 溫州 325005)

蟬擬青霉(IsariacicadaeMique)既是我國傳統中藥蟬花，又是一種昆蟲的寄生真菌，其寄主范圍包括鱗翅目、膜翅目和同翅目[1-3]。因此，蟬擬青霉被廣泛應用于生物防治。蟲生真菌通過主動寄生于昆蟲，經過體表附著、體壁穿透、體內定殖和致死3個階段[4]，最終殺死寄主。大量的研究表明，蟲生真菌在入侵昆蟲體壁的過程中，能夠分泌蛋白酶、幾丁質酶、脂酶、淀粉酶等體壁降解酶以及分解纖維素和酚類等化合物的酶[5]，這些酶與入侵過程中表皮的降解、侵染結構的形成以及菌株的毒力等有關，表皮降解酶一旦作用于目標靶位，便逐漸將體壁結構物質降解而形成病菌進入寄主血腔的通道。上述所列酶系中，研究較多的是胞外蛋白酶系。因為蛋白質是昆蟲表皮的主要結構成分，因此，蛋白酶是決定病菌殺蟲毒力的關鍵酶。

隨著分子生物學技術水平的不斷提高，從基因水平研究蟬擬青霉對昆蟲的致死能力與蛋白酶活力之間的關系，對于了解蟬擬青霉侵染致病的分子機理有一定的指導意義。同時，其研究成果可用于將蟬擬青霉蛋白酶基因轉入殺蟲真菌受體菌，構建蟬擬青霉殺蟲超級菌株，以提高蟬擬青霉的殺蟲效率，這為解決蟬擬青霉致死慢、防效不穩定等問題提供了一套行之有效的方法[6]。

本研究將以蟬擬青霉為材料，根據GenBank中已注冊的蟲生真菌蛋白酶基因的序列，設計一對引物，用RT-PCR和3′/5′-RACE相結合的方法力圖從蟬擬青霉中克隆蛋白酶基因的cDNA全序列，為蟬擬青霉作為高效穩定的殺蟲物質資源的開發應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

蟬擬青霉I.cicadaeAPC20為浙江省亞熱帶作物研究所蟲生真菌研究室實驗室分離、保存。其寄主為山蟬(CicadaflammataDist.)，采自浙江省溫州市雁蕩山風景區。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、DNA Marker DL2000、PMD18-T載體、及膠回收試劑盒等購自TaKaRa公司；E.Z.N.A.TM Total RNA Kit Ⅰ購自OMEGA公司；引物合成及測序、pUCm-T載體、兩步法qRT-PCR試劑盒、GeneRacer TM Kit購自Invitrogen公司；感受態細胞E.coliTrans1-T1及JM109由南京農業大學饋贈。

1.3 總RNA的提取

按照E.Z.N.A.TMTotal RNA Kit Ⅰ提供的方法進行：培養蟬擬青霉菌絲體3 d，取30 mg組織經液氮和石英砂研磨成粉末，轉移粉末至TRK裂解液裂解，20 ℃，20 000 ×g，離心10 min；取上清，加入等體積的70%乙醇，充分混勻，將微型柱置于2 mL離心管之上， 并將所有的混合液加入到微型柱中，20 ℃，10 000 ×g，離心60 s，棄去濾液；加入300 μL RNA洗脫液Ⅰ，20 ℃，10 000 ×g，離心60 s，棄濾液；加入DNA酶Ⅰ消化，靜置15 min，加入500 μL RNA洗脫液Ⅰ，20 ℃，10 000 ×g，離心60 s，棄濾液；將微型柱置于新的2 mL離心管上，加入500 μL乙醇稀釋過的RNA洗脫液Ⅱ，20 ℃，10 000 ×g，離心60 s，棄濾液；加入500 μL RNA洗脫液Ⅱ再次洗滌微型柱，20 ℃，20 000×g，離心60 s，棄濾液；將離心柱置于空的2 mL離心管上，20 ℃，10 000 ×g，離心2 min。轉移微型柱至新的1.5 mL的離心管上，加入30 μL的DEPC處理的水洗脫柱子，20 ℃，20 000×g，離心3 min。-70 ℃保存備用。

1.4 cDNA特異片段的RT-PCR擴增

取總RNA(約1 μg)，加入1 μL oligo (dT)12～18(500 μg·mL-1)，1 μL dNTP(10 mmol·L-1)，加雙蒸水至12 μL，65 ℃水浴5 min，稍微離心甩一下，冰上放置5 min；加入4 μL 5×第一鏈合成緩沖液，2 μL DDT(0.1 mmol·L-1)，1 μL RNaseOUTTM核酸酶抑制劑(40 U·μL-1)，37 ℃溫浴2 min；加入1 μL M-MLV逆轉錄酶，混勻，37 ℃溫浴50 min，70 ℃加熱15 min終止反應。-20 ℃保存備用。

根據GenBank中已登錄的淡紫擬青霉、粉擬青霉、球孢白僵菌和金龜子綠僵菌的類枯草桿菌蛋白酶基因序列，用DNAStar軟件中的MegAlign比較其同源性，發現一對較為保守的DNA區域序列，據其設計的一對引物為：PCPr1F，5′-CTGGCTTCCGTGGTTATGCTGG-3′；PCPr1R，5′-CACCACCAAGAGACATGTTGGCGAC-3′。

PCR反應體系(25 μL)含有：2.5 μL 10×Taq酶緩沖液，dNTP各0.2 mmol·L-1，MgCl22.0mmol·L-1，引物各0.01 nmol·L-1，rTaq0.5 μL，模板DNA 1.0 μL。擴增反應在PCR儀上進行：95 ℃ 4 min，1個循環；95 ℃ 45 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個循環；最后72 ℃ 10 min。擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠(含EB)中電泳1 h，凝膠成像儀檢測結果。

使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification kit Ver 2.0電泳片段回收試劑盒進行特異條帶的回收，回收片段連接PMD18-T載體，轉化感受態細胞Trans1-T1，獲得轉化質粒，經菌落PCR驗證后委托上海Invitrogen測序公司進行測序。所有擴增反應均在美國Bio-Rad公司生產的PTC-200 PCR儀上進行。

1.5 3′/5′端RACE-PCR擴增

按GeneRacer TM Kit提供的方法進行，其中，GeneRacerTMRNA Oligo 序列為:5′-CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3′；GeneRa-cerTMOligo dT 引物序列為: 5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG(T)24-3′ (60 bases)

5′模板合成：加入7 μL總RNA，1 μL 10×CIP Buffer，1 μL RNase OUT(10 U·μL-1)，1 μL CIP(10 U·μL-1)，用槍頭輕輕混勻，瞬時離心，50 ℃水浴1 h，瞬時離心，置冰上；依次加入90 μL DEPC水和100 μL酚/氯仿混合液，上下混勻，最大轉速離心5 min，轉移上層至新的離心管；加入2 μL 10 mg·mL-1糖原，10 μL 3 mol·L-1醋酸鈉(pH 5.2)，混勻，再加入220 μL 95%乙醇，上下混勻，-20 ℃過夜保存，4 ℃，最大轉速離心20 min，棄去上清，加入500 μL 70%乙醇，顛倒幾次，上下混勻，4 ℃，最大轉速離心2 min，去乙醇，再次離心去除殘余乙醇，室溫干燥1～2 min；加入7 μL DEPC水重懸RNA；依次加入1 μL 10×TAP緩沖液，1 μL RNase OUT(10 U·μL-1)，1 μL TAP(0.5 U·μL-1)，用槍頭輕輕吸打混勻，瞬時離心，37 ℃溫浴1 h，瞬時離心，置冰上，沉淀RNA沉淀(方法同上)；加入7 μL DEPC水重懸RNA；將6 μL去磷酸化，去帽子結構的RNA加入分裝好RNA Oligo(0.25 μg)的試劑管(先離心)，吸打混勻，瞬時離心，65 ℃溫浴5 min，冰上放置約2 min，瞬時離心，加入1 μL 10×Ligase Buffer，1 μL ATP(10 mmol·L-1)，1 μL RNase Out(10 U·μL-1)，1 μL T4 RNA ligase(5 U·μL-1)，混勻，且瞬時離心；37 ℃溫浴1 h，瞬時離心，置冰上；依次加入10 μL RNA連接液，1 μL GeneRace oligodT，1 μL dNTP Mix，1 μL DEPC水，65 ℃溫浴5 min，冰上放置至2 min，瞬時離心，加入4 μL 5×First Strand Buffer，1 μL DTT(0.1 mol·L-1)，1 μL RNase Out(10 U·μL-1)，1 μL SuperSeript Ⅲ RT，槍頭吸打混勻，瞬時離心，50 ℃溫浴50 min，然后70 ℃溫浴15 min，冰上放置2 min，最大離心力瞬時離心，加入1 μL RNase H(2 U)，37 ℃溫浴20 min，瞬時離心，-70 ℃保存。

根據已獲得的蟬擬青霉Pr1基因片段序列，設計5′RACE引物序列：其中，SLP 5′RACE引物：rSLP-R1，5′-CGACATGGTGCCCGAGCCGTTAGA-3′(465-488)；rSLP-R2，5′-CCTCAACGTCAGGGTGGTTGCGAAT-3′(51-75)。5′GeneRacer outer primer，5′-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3′；5′GeneRacer inner primer，5′-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3′。

5′RACE擴增反應：第一輪反應體系(25 μL)：0.5 μL 5′RACE模板，1.0 μL 5′GeneRacer outer primer(10 μmol·L-1)，1.0 μL rSLP-R1(10 μmol·L-1)，22.5 μL Platinum PCR Supermix High Fidelity。Touch-down PCR循環條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，5個循環； 94 ℃ 30 s，70 ℃ 1 min，5個循環；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，25個循環。進行第二輪反應，PCR體系(25 μL)：0.5 μL第一輪PCR產物，1.0 μL 5′GeneRacer inner primer(10 μmol·L-1)，1.0 μL rSLP-R2(10 μmol·L-1)，22.5 μL Platinum PCR Supermix High Fidelity。循環條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，66 ℃ 30 s，68 ℃ 1 min，30個循環。二次反應結束后，1.2%瓊脂糖電泳檢測結果。切膠回收，連接pUCm-T載體，轉化感受態細胞JM109，送往上海Invitrogen公司進行測序。

3′模板合成：加入10 μL總RNA，1 μL GeneRacerTMOligo dT Primer，1 μL dNTP Mix，1 μL DEPC水，65 ℃溫浴5 min，冰上放置2 min，瞬時離心；依次加入4 μL 5×First Strand Buffer，1 μL DDT(0.1 mol·L-1)，1 μL RNaseOut(10 U·μL-1)，1 μL SuperSeript Ⅲ RT，槍頭吸打混勻，瞬時離心；50 ℃溫浴50 min，70 ℃溫浴15 min，冰上放置2 min，瞬時離心；加入1 μL RNase H(2 U)，37 ℃溫浴20 min，瞬時離心，-70 ℃保存。

根據已獲得的蟬擬青霉Pr1基因片段序列，設計3′RACE引物序列。其中，SLP 3′RACE引物：rSLP-F1，5′-CACCACCGTCCCCGTCACCACCA-3′；rSLP-F2，5′-GACACTCTCGGTTTCGGCACCTTCAA-3′。3′GeneRacer outer primer，5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；3′GeneRacer inner primer，5′-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3′。

3′RACE擴增反應。第一輪反應體系(25 μL)：0.5 μL 3′RACE模板，1.0 μL 3′GeneRacer outer primer(10 μmol·L-1)，1.0 μL rSLP-F1(10 μmol·L-1)，22.5 μL Platinum PCR Supermix High Fidelity。Touch-down PCR循環條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，5個循環；94 ℃ 30 s，70 ℃ 2 min，5個循環；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 2 min，25個循環。進行第二輪反應，PCR體系(25 μL)：0.5 μL第一輪PCR產物，1.0 μL 3′GeneRacer inner primer(10 μmol·L-1)，1.0 μL rSLP-F2(10 μmol·L-1)，22.5 μL Platinum PCR Supermix High Fidelity。循環條件為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 1.5 min，30個循環。二次反應結束后，1.2%瓊脂糖電泳檢測結果。切膠回收，連接pUCm-T載體，轉化感受態細胞JM109，送往上海Invitrogen公司進行測序。

1.6 全長基因的PCR檢驗

利用最終序列，設計引物rSLP-F: 5′-GCGTCAGCAACTCTCTACACT-3′；rSLP-R: 5′-CGACGCCACAACGGACAAGTT-3′，模板為5′、3′RACE擴增產物。PCR反應體系(25 μL)含有：模板DNA各0.5 μL，引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL，Platinum PCR Supermix High Fidelity(Invitrogen)22 μL。擴增反應在PCR儀上進行：94 ℃ 2 min，1個循環；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 1.5 min，30個循環；最后72 ℃ 10 min。擴增產物在1.2%瓊脂糖凝膠(含 EB)中電泳1 h，凝膠成像儀檢測結果。

1.7 蛋白結構分析和預測

蛋白質結構分析主要用DNAStar軟件分析；信號肽預測、等電點和分子量用網上服務器http://www.expasy.org分析工具SignalP、compute PI/MW。

2 結果與分析

2.1 蟬擬青霉類枯草桿菌蛋白酶cDNA特異片段的RT-PCR擴增

用引物PCPr1F和PCPr1R進行特異性擴增，經1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，得到一條特異性很好的條帶，估計長度600 bp左右，測序實得的序列長度為605 bp，與設計引物時所預測的序列長度(656 bp)有51 bp的差距。但用Blast在GenBank中進行比較的結果表明，該片段的核苷酸序列與蟲草菌(Cordycepscicadae)的PR1H(AGK07304.1)同源性最高，達到100%。

2.2 蟬擬青霉類枯草桿菌蛋白酶cDNA的3′/5′-RACE擴增

在第一輪RACE-PCR反應中，無論是3′-RACE反應，還是5′-RACE反應均為彌散的DNA條帶。但在第二輪的RACE-PCR反應中，分別得到一條很亮的特異條帶，其長度約為1 300 bp和500 bp(圖2)。對3′-RACE和5′-RACE的第二輪擴增產物進行測序，其結果分別為1 354 bp和549 bp，與上述特異片段分別有521個核苷酸和28個核苷酸重疊，所以第二輪擴增產物分別為同一cDNA的3′端和5′端。

M，Marker DL2000；1，擴增片段轉化DH5α后菌落PCR產物；2，擴增片段轉化DH5α后提取質粒PCR產物。M， Ladder marker of DL2000; 1， Cloned special fragment of DH5α colony; 2， Cloned special fragment of DH5α plasmid.

2.3 蟬擬青霉類枯草桿菌蛋白酶cDNA全序列分析

通過RT-PCR和3′/5′-RACE擴增片段的測序結果，除去重疊區域，最后確定蟬擬青霉類枯草桿菌蛋白酶cDNA全序列為2 031 bp(KC508612.1，GenBank)，與PCR方法檢查3′/5′-RACE擴增片段的電泳結果相吻合(圖3)。此蛋白起始密碼子(ATG)和終止子(TAA)分別在171堿基和1 770堿基處，編碼閱讀框由1 599個核苷酸組成，5′-非翻譯區(5’-UTR)與3′-非翻譯區(3′-UTR)分別為170個核苷酸和262個核苷酸(圖4)。

在GenBank中通過Blast進行比對，該基因編碼的蛋白序列與蟲草棒束孢(Isariafarinosa)、球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)和哈茨木霉(Trichodermaharzianum)類枯草桿菌蛋白酶(subtilisin-like protease)有較高的同源性，同源性分別為88%、88%、89%和71%，說明該基因確為蟬擬青霉類枯草桿菌蛋白酶基因。

M，Marker DL5000；5′，5′-RACE DNA擴增片段；3′，3′-RACE DNA擴增片段。M， Ladder marker of DL5000; 5′， 5′-RACE with rSLP-F1 and rSLP-R2; 3′， 3′-RACE with rSLP-R1 and rSLP-F2.

M，Marker DL5000；1，目的基因。M， Ladder marker of DL5000; 1， Target gene.

2.4 蟬擬青霉類枯草桿菌蛋白酶的生物信息學分析及其同源性分析

蟬擬青霉類枯草桿菌蛋白酶前體蛋白理論分子量為56.9 ku，理論等電點為6.329，為水溶性蛋白，共有532個氨基酸組成，其中含酸性氨基酸68個(D、E)，堿性氨基酸56個(K、R)，極性氨基酸129個(Y、S、T、C、M、N、Q)，疏水氨基酸187個(W、A、V、L、I、F)，分別占總氨基酸數量的12.8%，10.5%，24.2%，35.2%。

N端的18個氨基酸被Signal P在線預測為信號肽，這段信號肽堿性氨基酸1個(K)，極性氨基酸5個(S、Q)，疏水氨基酸12個(M、V、I、A、L)。

根據同源性比較，成熟的枯草桿菌蛋白酶應當從152的Lys開始，有5個半胱氨酸(Cys232、Cys335、Cys366、Cys401、Cys459)，有4個潛在的N-糖基化位點(258NGS、298NMS、336NYS和474NRS)(圖4)。

根據軟件預測結果顯示，蟬擬青霉枯草桿菌蛋白酶(PR1)位于細胞的液泡中與分泌途徑相關。通過SOPM方法和DNAMAN 4.0軟件預測蛋蛋白二級結構，表明蟬擬青霉枯草桿菌蛋白酶(PR1)二級結構中以α-螺旋和無規則卷曲為主，分別占32.52%和33.46%，β-片層占22.56%，β-轉角占11.47%。依據同源建模原理，運用SWISS-MODEL工具和X-RAY DIFFRACTION 2.10A方法對PR1蛋白的三級結構分析結果顯示，選取與蟬擬青霉枯草桿菌蛋白酶(PR1)相似率為31.14%的3whi.1.A作為模型，構建了蟬擬青霉枯草桿菌蛋白酶(PR1)的三級結構(圖5)。

圖4 蟬擬青霉類枯草桿菌蛋白酶cDNA和推導氨基酸序列

藍色部分表示α-螺旋；橙黃色部分表示無規則卷曲；紅色部分表示β-片層；綠色部分表示β-轉角。The blue part represented α-helixes; The orange part represented random colis; The red part represented β-sheets; The green part represented β-turns.

3 討論

目前已知昆蟲病原真菌的胞外酶系主要有蛋白酶、幾丁質酶、酯酶、脂肪酶、DNA酶及其他分解纖維素和酚類化合物的酶或酶系。上述所列酶系中，研究較為清楚的是蛋白酶，其次是幾丁質酶。因為蛋白質是昆蟲表皮的主要結構成分，因此，蛋白酶是決定病菌殺蟲毒力的關鍵酶[7-8]。在昆蟲病原真菌中與毒力有關的蛋白酶目前主要分為兩類：一類為絲氨酸彈性凝乳蛋白酶(類枯草桿菌蛋白酶，簡稱為Pr1)，另一類為絲氨酸類胰蛋白酶(簡稱為Pr2)。絲氨酸彈性凝乳蛋白酶是昆蟲病原真菌的重要毒力因子，并且是由多個同源蛋白酶組成的家族。已報道的與殺蟲活性有關蛋白降解酶20多種，包括Pr1A、Pr1B、Pr1C、Pr1D、Pr1E、Pr1F、Pr1H、Pr1I、Pr2和Pr3等類型。在昆蟲病原真菌中，第一個被克隆出來的表皮降解酶基因就是金龜子綠僵菌的Pr1A(當時被稱為Pr1)基因[9]，在蟬擬青霉中，本研究首次克隆了與侵染過程相關的類枯草桿菌蛋白酶基因。序列顯示它合成一個前體肽，包含信號肽和前肽。對于信號肽區域來講，通常認為疏水核心區含9個疏水氨基酸就可以滿足跨膜的需要[10]。這段信號肽符合上述特點，因此我們認定該蛋白為胞外分泌蛋白，可以分泌到細胞膜外來分解昆蟲體壁上的蛋白質，以協助真菌完成侵染過程。Leger等[9]克隆的Pr1A基因的信號肽也有18個氨基酸，不同的是其核心區僅含8個疏水氨基酸。前肽的作用可能是在轉運過程中屏蔽自身分解蛋白的活性，這是蛋白酶具有前肽的特點。但該區域和其他蟲生真菌PR1H的前肽同源性不高，Leger等[9]的研究曾指出該區域序列不保守，因而進化較快。

蟬擬青霉作為一類潛在的農業害蟲生防菌，在對其開發利用方面也存在蟲生真菌的通病。但是有關蟬擬青霉中降解昆蟲體壁蛋白酶基因的報道尚處于空白。盡管不同蟲生真菌的Pr1酶的功能是相同或相似的，但由于其編碼基因的部分核苷酸的變化可能使氨基酸序列發生改變，會造成二級結構差異，導致這些Pr1酶在親疏水性能和抗原性上表現出一定的差異[6]，因此，從蟬擬青霉中克隆具有降解昆蟲體壁功能的蛋白酶基因并對其功能進行鑒定分析，對了解蟬擬青霉的致病機理有著重要意義。對蟬擬青霉中具有降解昆蟲體壁功能的蛋白酶基因進行克隆，將為從分子水平探索病原菌-昆蟲的互作機制奠定基礎，并為新型高效安全的殺蟲劑的研發提供新思路，開辟新途徑。

本研究報道了蟬擬青霉類枯草桿菌蛋白酶基因片段的克隆，通過序列分析發現其與其他病原菌的類枯草桿菌蛋白酶基因之間存在較高的同源性，這為進一步獲取蟬擬青霉蛋白酶基因全序列奠定了基礎，并對今后研究蟬擬青霉蛋白酶結構和功能提供了依據。