貴州古茶樹種質資源基于形態特征的多樣性研究

牛素貞，宋勤飛，安紅衛，黃 政，劉 霞，趙德剛，陳正武

(1.貴州省農業科學院 茶葉研究所/貴州省茶葉研究所，貴州 貴陽 550006； 2.貴州大學 農業生物工程研究院，山地植物資源保護與種質創新教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025； 3.貴州大學 茶學院，貴州 貴陽 550025)

植物多樣性是地球上極為重要的財富，是人類賴以生存和發展的重要物質基礎。遺傳多樣性越豐富，改良栽培品種或選育新品種的潛力就越大。然而，隨著農業耕作方式和人們生活方式的不斷改變，生態環境的惡化加劇，植物的遺傳多樣性正在逐步減少[1]。茶樹種質資源遺傳多樣性評價是茶樹育種研究的重要組成部分，對于更有效地利用現有的種質資源，提高育種的準確性具有重要意義。目前，伴隨著生物學、遺傳學和分子生物學的發展，遺傳多樣性的檢測方法不斷完善，已經從形態學、細胞學(染色體)、生理生化水平逐漸發展到分子水平。同時我們也注意到，各種方法在理論或實際研究中都有其各自的優點和局限性[2-4]。形態多樣性研究是目前種質資源研究的重要內容，也是物種遺傳多樣性研究的重要組成部分。不同植物生理生態特性的改變以及遺傳分化，一般會從形態特征反映出來。因此，根據形態特征的不同，在很大程度上能夠反映同種植物之間的相似性以及不同種植物之間的本質差異[5-7]。本研究對144份貴州古茶樹種質資源進行形態性狀的多樣性分析，目的在于分析貴州32個分布地古茶樹種質資源形態性狀的變異，從形態學上評價貴州古茶樹種質資源的多樣性，為貴州古茶樹種質資源的利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

以分布在貴州的32個分布地的古茶樹種質資源為材料(表1)。

按照陳亮等[8]的分類，包括山茶屬CamelliaL.茶組Sect.Thea(L.) Dyer的大廠茶(C.tachangensisF.C. Zhang)25份、大理茶(C.taliensis(W.W. Smith) Melchior)9份、禿房茶(C.gymnogynaChang)9份、茶(C.sinensis(L.) O. Kuntze)57份、待分類的茶組植物(Camelliassp.)44份。

1.2 方法

1.2.1 形態學性狀調查方法

2009年10月—2011年11月對分布在貴州省的古茶樹種質資源進行野外調查，參照江昌俊[9]的方法，調查的性狀是：樹型、樹姿、葉面積、葉色、葉脈對數、葉身、葉尖、柱頭分裂數、子房室數、葉形10個形態性狀。數據調查基本為單人調查，避免了某些性狀的視覺誤差。根據調查的數據對部分質量性狀進行賦值，數量性狀按照測量值進行記錄和統計。將數據匯集以后進行數據的標準化轉換，以便進行性狀的遺傳多樣性分析。

1.2.2 形態學性狀的數據標準化及統計分析

參考陳亮等[8]對茶樹葉片形態性狀的分級標準進行分級和標準化(表2)。根據調查的數據對部分質量性狀進行賦值。數量性狀按照測量值進行記錄和統計。將所有數據錄入Excel表格，然后對數據進行標準化，構成性狀原始數據矩陣。依據葉長和葉寬計算葉面積，葉面積=葉長×葉寬×0.7，再根據葉面積的平均值，確定葉片的大小并進行賦值。

表1 貴州古茶樹種質資源分布地信息

Table1Information of original area of ancient tea plants in Guizhou

編號調查地點東經北緯海拔材料數量種質No.OriginEastlongitude/ENorthlatitude/NAltitude/mSamplenumberSpeciesandvarieties1黔東南108°11′-108°41′26°23′-26°29′613-1478187C.sinensis,11CamelliasspSoutheasternGuizhou2黔西南104°44′-105°36′24°56′-26°13′1147-1900549C.sinensis,22C.tachangensis,SouthwesternGuizhou17Camelliassp.,6C.taliensis3黔南106°35′-107°54′25°21′-26°30′772-14572820C.sinensis,3C.tachangensis,SouthernGuizhou5Camelliassp.4黔北105°53′-108°36′27°27′-29°27′621-12393611C.gymnogyna,15C.sinensis,NorthernGuizhou10Camelliassp.5黔中105°36′-106°36′26°13′-26°32′1154-130888Camelliassp.CentralGuizhou

表2 茶樹主要形態形狀特征及數量化

Table2Morphological characteristics of tea plants and numerical values

性狀指標Trait質量性狀數量化Quantificationofqualitativetrait12345樹型Planttype喬木Arbor小喬木Semi-arbor灌木Shrub樹姿Growthhabit開展Horizontalspreading半開展Semi-erect直立Erect葉面積Leafarea/cm2小葉Small(<20)中葉Medium(20～40)大葉Large(40～60)特大葉Extralarge(60～80)超特大葉Superextralarge(≥80)葉色Leafcolour黃綠色Yellowgreen淺綠色Lightgreen綠色Mediumgreen深綠色Darkgreen紫綠色Purplegreen葉脈對數7～89～1011～1213～14Numberofveinpairs葉身Leafcrosssection內折Convex平Flat稍背卷Concave葉尖Leafapexshape急尖Acute漸尖Attenuate鈍尖Blunt圓尖Obtuse柱頭分裂數Number345ofstylesplittings子房室數345Loculenumber葉形Leafshape披針形Lanceolate長橢圓形Oblong橢圓形Elliptic近圓形Nearround

1.2.3 統計分析

將數據匯集以后進行數據的標準化轉換，采用SPSS 15.0統計軟件對10個形態性狀的遺傳多樣性和主成分進行分析。形態性狀的遺傳多樣性指數采用Shannon-weaver指數H，計算公式為：多樣性指數H=-∑(Pj)×ln(Pj)，其中Pj為某性狀第j個代碼出現的頻率[10]。

2 結果與分析

2.1 貴州古茶樹種質資源10個形態性狀的頻率分布

表3顯示，10個形態性狀觀測值上的頻率分布，按照前面數據的標準化，葉面積和葉色等性狀指標分為5個等級，葉形、葉脈對數和葉尖等性狀指標分為4個等級，樹型、樹姿、葉身、柱頭分裂數、子房室數等性狀指標分為3個等級。144個古茶樹種質資源的樹型主要分布在等級3(灌木型)上，等級2(小喬木型)分布較少；樹姿主要分布在等級1(開展)和等級2(半開展)上，等級3(直立)分布較少；葉面積主要分布在等級2(葉面積20～40 cm2)上，等級1(葉面積<20 cm2)和5(葉面積≥80 cm2)的分布較少，分別為7%和4%，即材料中超特大葉類型和小葉類型較少；葉形和葉色在等級3上分布最多，達59%以上，葉形在等級1(披針形)上分布最少，僅為1%，即材料中披針形葉片分布較少，橢圓形、綠色葉片類型的分布較多；葉脈對數主要集中分布在等級2上，也就是9～10對葉脈的材料較多；葉身主要分布在等級3上，即葉身稍背卷的材料較多；葉尖基本均勻分布在4個等級上；子房室數和柱頭分裂數主要分布在1、3等級上，等級2也就是4個子房室數和4個柱頭分裂數的材料分布較少。

2.2 貴州古茶樹種質資源10個形態性狀的變異

對144份貴州古茶樹種質資源的10個主要形態性狀進行統計分析，結果表明(表4)，10個形態性狀變異系數除樹姿外，其他9個性狀變異系數均達35%以上，其中葉面積變異系數達100%以上，變異系數的大小依次為葉面積、柱頭分裂數、子房室數、葉尖、樹型、葉色、葉脈對數、葉身、葉形、樹姿。10個形態性狀多樣性指數均達到0.85以上，葉面積的多樣性指數最高，達1.74，葉形多樣性指數最低，為0.87。

2.3 貴州古茶樹種質資源10個形態性狀的主成分分析

由表5可見，前4個成分的累計貢獻率僅達到85.97%，表明前4個主成分基本反映了10個指標的信息。PC1、PC2、PC3和PC4的貢獻率分別為48.63%、15.87%、11.17%和10.30%。

原始變量和前4個主成分之間的相關性見表6。PC1主要代表樹型、樹姿、葉面積、葉尖和柱頭分裂數；PC2主要代表葉形、葉身；PC3主要代表葉脈對數、子房室數；PC4主要代表葉色。

表3 十個形態性狀的頻率分布

Table3Frequency distribution of morphological characteristics for tea varieties

%

表4 十個形態性狀的統計參數和遺傳多樣性指數

Table4Statistic parameters and diversity index of 10 morphological characteristics of tea germplasms

性狀Trait平均值Mean最小值Min最大值Max變異系數CV/%多樣性指數H樹型Planttype2.111344.530.99樹姿Growthhabit2.111321.861.02葉面積Leafarea/cm233.9311.64100.08109.581.74葉形Leafshape1.721436.710.87葉脈對數Numberofveinpairs10.1271439.431.33葉身Leafcrosssection2.201339.051.06葉尖Leafapexshape2.541444.571.36子房室數Loculenumber1.931346.140.91柱頭分裂數Numberofstylesplittings1.931346.140.91葉色Leafcolour3.201540.750.92

表5 十個形態性狀主成分的特征向量及貢獻率

Table5Eigen vectors and percentages of accumulated contribution of principal components

主成分Principalcomponent特征值Eigenvalue貢獻率Contributionrate/%累計百分率Cumulativepercentage/%PC14.8648.6348.63PC21.5815.8764.50PC31.1111.1775.67PC41.0310.3085.97

貴州古茶樹種質資源主成分得分見表7。PC1較高的正值表明古茶樹種質資源的樹姿趨向直立，葉面積、柱頭分裂數都較大，G3、G11、G20、G23、G88、G90、G91、G92、G109、G34、G35、G101、G102、G103、G39、G45、G53、G54、G55、G57、G68、G69、G121、G130、G139等材料屬于此類。PC1的較低的負值表明古茶樹種質資源的樹型趨向于灌木，葉尖趨向圓尖，G28、G74、G79、G80、G81、G82、G83、G85、G86、G94、G37、G38、G43、G129、G112、G113、G66等材料屬于此類。高的PC2正值表明古茶樹種質資源葉身趨向稍背卷，G15、G27、G100、G35、G42、G114、G47、G54、G129、G138等材料屬于此類；低的PC2負值表明葉形趨向于近圓形，G33、G79、G89、G95、G96、G36、G111、G71等材料屬于此類；PC3較高的正值表明古茶樹種質資源具有較多的子房室數，如材料G14、G59、G62、G132等；低的PC3負值表明古茶樹種質資源具有較多的葉脈對數，如G1、G17、G19、G67、G141等材料。

2.4 五個分布區古茶樹種質資源葉片形態性狀變異

由表8可見，黔西南分布區的古茶樹種質資源的形態遺傳多樣性與其他分布區相比較廣泛，除了樹姿和葉形遺傳多樣性指數分別為0.93和0.87外，其他各性狀的遺傳多樣性指數均在1.0以上。形態遺傳多樣性指數中，樹型、葉尖和子房室數遺傳多樣性指數黔西南分布區最高，其次是黔南分布區、黔北分布區、黔中分布區分布區、黔東南分布區；樹姿遺傳多樣性指數是黔西南分布區最高，其次是黔南分布區、黔東南分布區、黔北分布區和黔中分布區；葉面積的多樣性指數以黔西南分布區最高為1.30，黔北分布區、黔中分布區、黔東南分布區次之，黔東南分布區最低為0.72；葉形遺傳多樣性指數除了黔中分布區最低為0.45，其他分布區在0.72～0.87，屬于中等遺傳變異；葉脈對數的遺傳多樣性指數黔南分布區最高，其次是黔西南分布區、黔北分布區、黔東南分布區、黔中分布區；葉身和花柱分裂數的遺傳多樣性指數黔西南分布區最高，其次是黔南分布區、黔北分布區、黔東南分布區，最低是黔中分布區；黔西南分布區、黔東南分布區和黔南分布區葉色的變異程度相對一致，黔北分布區和黔中分布區相對較低。

表6 貴州古茶樹種質資源性狀變量因子負荷量

Table6Factor loadings for morphological characteristics of wild tea germplasms in Guizhou

變量Variable因子負荷量FactorloadingsPC1PC2PC3PC4樹型Planttype-0.7220.332-0.108-0.217樹姿Growthhabit0.511-0.390-0.009-0.064葉面積Leafarea0.6910.083-0.023-0.360葉形Leafshape-0.328-0.5560.365-0.073葉脈對數Numberofveinpairs0.2490.336-0.5530.199葉身Leafcrosssection0.0140.525-0.475-0.224葉尖Leafapexshape-0.5880.2110.277-0.191子房室數Loculenumber0.1690.2820.667-0.066柱頭分裂數Numberofstylesplittings0.5380.2530.3930.251葉色Leafcolour-0.2740.136-0.0790.806

表7 貴州古茶樹種質資源主因子分析

Table7Factor scores for wild tea germplasms in Guizhou

種質Germplasm因子值FactorscorePC1PC2PC3PC4種質Germplasm因子值FactorscorePC1PC2PC3PC4G11.4320.681-1.598-0.022G361.280-2.1520.6141.335G20.779-0.750-0.753-0.403G37-1.569-0.598-0.6930.050G32.398-0.2440.9760.698G38-1.5730.417-1.250-0.157G40.3831.0821.378-1.840G391.8570.6190.6020.435G50.8291.1870.8020.278G40-1.4240.1000.3740.535G60.7820.143-1.0540.515G41-1.3390.226-0.0560.444G70.5250.727-1.1880.405G420.8301.798-0.1440.372G80.279-1.0810.9060.617G43-1.6590.6360.331-0.556G9-0.1411.032-0.107-0.174G440.669-0.7150.6031.179G101.3860.285-1.204-0.487G452.3540.653-1.229-1.476G111.859-0.809-0.116-0.861G46-0.3841.322-0.2400.141G121.0160.1761.1800.197G471.2902.243-0.3161.146G130.9160.794-1.4110.823G481.3570.718-0.723-0.341G140.2860.9161.7080.616G49-1.3390.226-0.0560.444G150.0211.582-1.2090.324G50-1.154-0.8851.030-0.118G161.312-0.0931.4210.204G51-1.154-0.869-0.521-1.778G171.146-0.638-1.536-2.389G52-0.5380.544-0.6050.960G180.6771.3040.192-1.833G53-0.3451.001-1.112-1.033G19-0.3780.812-1.7770.231G540.2571.9670.861-0.790G202.316-0.0601.219-1.863G55-0.6491.152-0.231-0.071G21-0.1700.9860.629-2.174G56-1.3430.4280.590-0.082G22-0.3270.8190.781-0.116G572.272-0.767-0.928-0.193G231.8851.2600.725-1.013G58-1.2670.0901.237-1.922G240.3790.9440.216-0.391G591.536-0.8271.857-0.321G251.3930.715-0.2700.312G601.1190.2301.3701.454G26-0.9421.2000.475-0.067G610.5250.024-1.3690.800G27-1.0171.5370.0110.082G62-1.777-1.3933.6460.615G28-1.896-0.920-0.428-0.167G63-0.4800.4741.8530.782G29-0.5542.2270.5680.153G64-0.859-0.172-1.466-0.320G30-0.1790.9301.395-0.467G65-0.8860.2560.1271.613G31-1.216-0.229-1.449-0.041G66-1.896-0.920-0.428-0.167G32-1.190-0.2471.4550.236G670.2400.020-2.072-1.868G33-1.269-1.6360.2970.875G682.063-1.0740.3060.036G341.866-0.853-0.2900.101G691.829-0.8910.074-0.354G352.1381.775-0.4391.540G70-1.3390.226-0.0560.444

續表7

不同分布區古茶樹種質資源的形態變異存在差異，其中黔西南分布區種質資源的樹型、樹姿、葉面積、葉身、葉尖、子房室數、花柱分裂數、葉色等變異系數最大，黔南分布區種質資源的葉形和葉脈對數變異系數最大(表9)。樹型變異系數以黔西南分布區最大，為53.36，黔東南分布區樹型變異最??；樹姿在5個地區變異幅度均較??；葉面積的變異系數各地區的差異較大，變異系數以黔西南分布區最大，為110.11%，黔東南地區的葉面積變異系數最小，為44.23%；葉形變異系數黔南分布區最高，為52.84%，黔東南分布區最低，為26.87%；葉身、葉尖、子房室數和花柱分裂數的變異系數以黔西南分布區最高，分別為58.79%、64.76%、73.12%和79.37%，黔東南地區最低，分別為27.66%、25.33%、25.86%、25.18%；葉色變異系數以黔西南分布區為最大，達62.05%，黔北分布區最小，為25.02%。5個群體10個形態性狀的平均變異系數從大到小的排序為：黔西南分布區、黔南分布區、黔北分布區、黔中分布區、黔東南地區。黔西南分布區的古茶樹種質資源是變異系數最大的群體，說明黔西南分布區古茶樹種質資源的形態多樣性較豐富，黔東南地區的形態多樣性程度較低。

表8 五個分布區古茶樹種質資源形態性狀的多樣性指數

Table8Diversity index of morphological characteristics of wild tea germplasm in five distributed areas

性狀Trait黔西南SouthwesternGuizhou黔東南SoutheasternGuizhou黔南SouthernGuizhou黔北NorthernGuizhou黔中CentralGuizhou樹型Planttype1.100.560.850.690.60樹姿Growthhabit0.930.650.770.500.45葉面積Leafarea1.300.721.021.131.12葉形Leafshape0.870.720.870.840.45葉脈對數Numberofveinpairs1.240.891.291.020.87葉身Leafcrosssection1.080.830.921.060.69葉尖Leafapexshape1.380.601.371.091.01子房室數Loculenumber1.090.610.820.800.69柱頭分裂數Numberofstylesplittings1.080.670.850.840.66葉色Leafcolour1.080.960.900.510.68

表9 五個分布區古茶樹種質資源形態性狀的變異系數

Table9Coefficient of variation of morphological characteristics of wild tea germplasm in five distributed areas

性狀Trait黔西南SouthwesternGuizhou黔東南SoutheasternGuizhou黔南SouthernGuizhou黔北NorthernGuizhou黔中CentralGuizhou樹型Planttype53.3619.7434.6641.5823.71樹姿Growthhabit28.6224.969.4517.4422.25葉面積Leafarea110.1144.2379.6646.3346.25葉形Leafshape50.0726.8752.8449.2536.35葉脈對數Numberofveinpairs52.8635.5265.0453.0556.70葉身Leafcrosssection58.7927.6651.7242.0448.04葉尖Leafapexshape64.7625.3346.5351.4051.23子房室數Loculenumber73.1225.8665.1053.4845.67柱頭分裂數Numberofstylesplittings79.3725.1855.9649.9946.77葉色Leafcolour62.0529.5459.0825.0247.32平均值Mean63.3128.4952.0042.9642.43

2.5 貴州古茶樹種質資源10個形態性狀的聚類分析

對貴州古茶樹種質資源10個形態指標的調查測定值標準化后，進行聚類分析(圖1)。結果表明，在歐氏距離5.60處供試材料明顯分為3大類型；第Ⅰ類包括：G40、G47、G48、G49、G67、G68、G69、G70、G71、G72、G91、G92、G98、G103、G109、G116、G118、G119、G120、G121、G123、G131、G133、G134、G136、G137、G139共27個材料，該類材料來自于黔東南地區的雷山，黔中分布區的貴定、都勻、安順西秀、貴陽花溪，黔西南分布區的興仁、晴隆、普安、安龍，黔北分布區的道真、務川、正安；第Ⅱ類包括G57、G64、G122、G124、G125、G127、G128、G129、G130、G138共10個材料，該類材料大部分來自黔西南分布區的晴隆，部分來自黔中分布區的貴定、花溪區和都勻市；第Ⅲ類包括其余的 107份材料，該類材料來自于表4中除安龍仙鶴平自然保護區、雷山方祥鄉和西江、普安江西坡、務川涪洋等以外的28個分布地。從形態性狀來看，各個分布區的古茶樹沒有明顯的地域特征。

3 討論

3.1 貴州古茶樹種質資源10個形態性狀的頻率分布

孫雪梅等[11]對云南古茶樹的形態性狀研究發現，云南古茶樹的形態性狀多以葉面積大、葉面平或稍隆起、葉色為綠色、柱頭4、5裂為主。本研究對貴州古茶樹種質資源研究的結果表明，灌木型和喬木型樹型茶樹較多，樹姿直立的較少；中葉類型較多，超特大葉類型和小葉類型較少；葉形多以稍背卷、葉色以綠色為主；材料中披針形葉片分布較少，橢圓形葉片和綠色葉片分布較多；葉脈對數主要以9～10對的較多；葉身稍背卷、子房3室和5室、花柱3裂和5裂的材料居多。這些表明貴州古茶樹種質資源與云南古茶樹種質資源具有一定的地域差異性，貴州獨特的氣候特征孕育了其獨特的資源類型和多樣性。

圖1 一百四十四份古茶樹種質資源形態性狀聚類圖

3.2 貴州古茶樹種質資源10個形態性狀的變異

古茶樹資源是變異最為廣泛的一類群體[12-13]。眾多學者對茶樹的研究表明[3，14-16]，古茶樹資源的變異較為豐富。本研究結果表明，貴州古茶樹種質資源表現出顯著的形態多樣性，在所調查的性狀中，葉面積最小值為11.64 cm2，最大值超過100 cm2，差距超過85 cm2。

性狀的變異系數是性狀遺傳多樣性的數量化體現。變異系數越大，則說明所試材料遺傳多樣性越高[2-3]。本研究中10個形態性狀變異系數除樹姿外，其他9個性狀均達到35%以上，其中葉面積變異系數達100%以上，說明葉面積較其他性狀變異性大，這可能與古茶樹的立地生態環境存在較大關系；其次是花柱分裂數、子房室數、葉尖等變異也較大，這些性狀在分類學研究中處于較為重要的地位，且能夠穩定遺傳[4，17]，進一步說明貴州古茶樹的遺傳變異較為廣泛。另外，遺傳多樣性指數也是反映遺傳多樣性的指標，多樣性指數越高，說明該物種的遺傳多樣性水平越高[1，18-19]。本研究結果顯示，10個形態性狀多樣性指數均達到0.85以上，表明貴州古茶樹種質資源的10個形態性狀均存在較為顯著的遺傳變異。

3.3 貴州古茶樹種質資源10個形態性狀的聚類

形態性狀的聚類是遺傳因素與環境因子共同作用的結果，在一定程度上反映了種質的遺傳多樣性[20]，本研究在歐氏距離5.60處把貴州古茶樹種質資源明顯分為3大類型，Ⅰ類包括27個材料，該類材料來自于14個分布區，Ⅱ類包括10個材料，該類材料大部分來自晴隆，Ⅲ類包括其余的107份材料，該類材料來自28個分布區；3大類型中僅Ⅱ類材料有明顯的區域特征，Ⅰ類和Ⅲ類材料均沒有明顯的地域特征，這可能是貴州多樣性的立體生態氣候，每一個小區域范圍內均形成了非常廣泛的變異，也可能由于調查的性狀較少、環境不統一產生的誤差，這需要進一步驗證聚類的結果，來證明基于形態性狀評價的遺傳多樣性分析結果是否可靠[8，21]。

3.4 貴州古茶樹種質資源形態多樣性與分布的關系

各分布區由于生態環境、傳播的時間不同，其多樣性會存在差異[22]，本研究結果顯示，同一性狀在5個分布區內的變異幅度有差異，總體來看，黔西南分布區的古茶樹種質資源的形態遺傳多樣性比其他地區廣泛，除了樹姿和葉形遺傳多樣性指數分別為0.93和0.87外，其他各性狀的遺傳多樣性指數均在 1.0以上，其次是黔南分布區、黔北分布區，黔中分布區、黔東南地區。變異系數及其平均值也驗證了5個地區的變異幅度是黔西南分布區>黔南分布區>黔北分布區>黔中分布區>黔東南地區，這可能與黔西南分布區是茶樹的起源地有關，排在第二位的地區是黔南分布區，其與黔西南分布區相隔較近，變異最小的區域是黔東南地區，與黔西南分布區距離相對較遠，這可能是區域的多樣性與起源地的遠近有關[17]。