延邊黃牛和韓延牛血液外胞體中miRNA的差異表達分析

婁安鋼 楊詠潔 金太花 張睿 崔成都 于龍政 關立增

延邊黃牛和韓延牛血液外胞體中miRNA的差異表達分析

婁安鋼①楊詠潔①金太花②張睿①崔成都①于龍政①關立增①②*

（①延邊大學農學院 吉林延吉 133002 ②臨沂大學農林科學學院 山東臨沂）

為進一步探討Exosome中miRNA對延邊黃牛和韓延牛生長發育的分子調控差異。本研究從延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中分離出miRNA，通過RNASEQ測序和生物信息學技術分析了延邊黃牛及韓延牛血液Exosome中miRNA的表達特點。結果表明，在延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中獲得差異表達miRNA有524個，其中上調表達的271個，下調表達的253個，其中已知miRNA 382個，新miRNA 142個；差異表達miRNA的靶基因預測結果說明，在兩個品種牛中共預測到 52348個靶基因。GO富集分析可知，這些靶基因被富集到3473條生物學過程，394條細胞組分以及879條分子功能。KEGG分析可知，這些預測得到的miRNA的靶基因總共被注釋到326條信號通路中，其中最顯著富集的通路為mTOR信號傳導通路。其中顯著差異表達的miR-9-5p和miR-99b調控的一些靶基因都與mTOR信號通路有密切的關系。結論：血液Exosome中的miR-9-5p和miR-99b在延邊黃牛和韓延牛生長發育差異的過程中可能發揮重要的作用。將為下一步在分子水平上探討關鍵差異表miRNA影響邊黃牛和韓延牛生長發育差異的分子機制提供試驗基礎。

延邊黃牛 韓延牛 外胞體 miRNA

miRNA是一類長度約為22 nt的非編碼的小分子RNA，其可通過靶向降解mRNA 或抑制蛋白的翻譯而發揮重要的調控作用[1]。研究發現，miRNA調控著哺乳動物約60%的基因，參與細胞增殖、分化、凋亡、神經形成、腫瘤發生、發展等一系列生物學過程[2]。因此，miRNA是生物體內一類重要的基因調控因子，已經成為國內外生物學研究的熱點之一[3]。

外胞體(Exosome)是由細胞分泌的40~200nm的小囊泡[4]。Exosome在不同的生理病理過程中發揮著不同的作用，具有細胞間信息交流及物質傳遞的功能，可以調節基因表達。研究發現在所有體液中都有Exosome的存在(唾液、母乳、血液、滑液、羊水、尿液、精子和卵泡液等)，通過這些體液Exosome可到達靶細胞，發揮不同的功能[5]。自從2007年Valadi等發現肥大細胞來源的Exosome含有miRNA，并指出Exosome介導的miRNA轉移是各類細胞之間交換遺傳信息的一種機制后，關于Exosome-miRNA的研究開始不斷涌現[6]。研究表明，Exosome中含有大量的miRNA，如Melnik等從牛乳Exosome中發現了miR21、miR29a、miR-29b、miR-155、miR-103及miR-7a、b、c、f等，并證明與代謝有關系[7]。Chen等利用Solexa測序分析技術從豬乳Exosome中檢測到491種miRNA，并由生物信息學分析可知，這些 miRNA中的一些參與生物過程，例如轉錄、細胞分化和增殖，免疫和代謝[8]。但國內外關于Exosome中miRNA的研究主要集中在人與動物的免疫調節作用方面，關于其在動物中的其它生物學功能的報道則較少。而最近的資料證明，Exosome中miRNA對動物的生長調控方面發揮作用，如Melnik等研究發現牛乳Exosome中的miRNA-21可以促進犢牛的生長發育[7]。陳婷等用來源于豬Exosome的miR-PC-86和miR-PC-263處理C2C12細胞，結果顯示二者可調控C2C12 細胞上IGF-1R受體的表達，從而對豬肌細胞生長發揮調控的作用[9]。由此表明，Exosome中的一些miRNA 可能與動物生長發育有著密切的關系?；谇叭说难芯炕A，本試驗旨在以延邊黃牛和韓延牛為研究對象，通過RNA-Seq技術和生物信息學分析技術對延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中miRNA進行差異表達分析，進而為進一步深入研究miRNA對延邊黃牛生長發育調控的分子機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 延邊黃牛和韓延牛血液樣品 由吉林省龍井市某牛場提供，隨機選擇延邊黃牛和韓延牛各5頭，采取血液。

1.2 主要試劑和設備 DEPC、Trizol購自華美生物工程公司；反轉錄試劑購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇購自天津市科密歐化學試劑有限公司；RNA提取試劑盒(Exosome DNA Extraction Kits)購自美國Illu-mina公司。MDF-U4u863 -80℃冰箱購自日本SAN YO公司；MCO-18AIC三洋二氧化碳培養箱購自日本三洋有限公司；梯度PCR儀購自Eppendorf公司；核酸蛋白測定儀購自美國Thermo公司。

1.3 延邊黃牛和韓延牛血液Exosome的提取 通過頸靜脈采血方法分別對5頭延邊黃牛和5頭韓延牛采取血液后放入50ml離心管中，以3000rpm離心10min，獲得血清，然后將5頭延邊黃牛和5頭韓延牛血清樣品分別混在一起獲得延邊黃牛血清混合樣和韓延牛血清混合樣。之后分別取兩個品種牛的血清混合樣以5000rpm離心10min，取上清，以10000rpm離心30min；取上清放入超高速離心機中，以60000rpm離心3h；棄上清，用0.01 M PBS反復將沉淀吹下，用移液器將懸液吸入EP管中，再使用移液器反復吹打使其溶解，最后將懸液于超速離心管中，放入超高速離心機中，以60000rpm離心2h；棄上清，吸入離心管中，加入0.01 M PBS溶液，用移液器將沉淀反復吹打，使其完全混勻即為Exosome溶液。

1.4 延邊黃牛和韓延牛血液Exosome RNA的提取 血清Exosome中的RNA提取主要按Exosome DNA Extraction Kits試劑盒(美國Illumina公司)步驟進行。

1.5 小RNA（sRNA）的高通量測序 將上述獲得小RNA樣品使用PAGE膠分離18~50nt之間的條帶，純化回收小RNA。使用T4 RNA連接酶將獲得的片斷兩端分別與3′和5′接頭連接，然后進行反轉錄反應，然后PCR擴增，獲得cDNA文庫。將構建好的文庫使用Agilent2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System進行質量和產量的檢測。最后將獲得的cDNA文庫送往深圳華大基因組公司，通過該公司的Illumina測序平臺完成小RNA高通量測序。

2 結果與分析

2.1 總RNA的質量 提取的血液Exosome RNA未經DNase和RNase處理時，電泳條帶顯示其存在的RNA主要為5S和少量的18S，而經DNase消化后，電泳條帶顯示與未處理時相同。但經RNase處理后，樣品內的RNA完全被消化，電泳圖內未顯示有任何條帶(圖1)。結果說明，樣品中提取的RNA降解程度較低，完整性較好，無其他基因組污染，可用于后續研究。

圖1 總RNA電泳檢測 1-3：血液Exosome總RNA

圖2 延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中差異表達miRNAX軸代表比較組，Y軸是對應的小RNA數。

2.2 miRNA的鑒定 miRNA的鑒定結果表明：在延邊黃牛血液Exosome中有912條miRNA與成熟的miRNA相匹配，新發現的miRNA為115條；在韓延牛血液Exosome中有905條miRNA與成熟的miRNA相匹配，新發現的miRNA為317條。具體結果見表1。

表1 小RNA的基因組比對與miRNA鑒定結果

2.3 miRNA表達定量 為檢測延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中miRNA表達水平，進而為后續的差異分析提供數據，對兩個牛品種鑒定出的miRNA進行表達量分析。結果表明：延邊黃牛中有912個已知miRNA表達，韓延牛中有905個已知miRNA表達，其中有795個miRNA在兩個樣品中都表達。只在延邊黃牛中表達的miRNA有112個，而只在韓延牛中表達的miRNA有105個。新miRNA預測結果分析可知，在兩個品種中一共檢測到187個新miRNA，延邊黃牛中有41個新miRNA，韓延牛中有146個新miRNA，其中35個在兩個品種中都表達。只在延邊黃牛中表達的新miRNA 有6個，韓延牛中有111個。

2.4 差異表達miRNA的篩選 （1）通過比較延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中miRNA的表達量，篩選差異表達miRNA，為后續分析提供基礎。本試驗采用DEGseq進行差異miRNA的篩選。篩選的差異miRNA統計見圖2。結果表明：延邊黃牛和韓延牛之間差異表達的miRNA一共是524個，其中上調表達的miRNA為271個，下調表達的miRNA為253個。（2）本試驗對韓延牛和延邊黃牛之間的524個差異表達miRNA進行了分析，其中已知miRNA 382個，新miRNA142個。相對于延邊黃牛，在韓延牛中顯著上調的miRNA有217個，顯著下調的miRNA有253個。表2分別列出了前10個在兩個品種中顯著上調和顯著下調表達的 miRNA。

表2 在延邊黃牛與韓延牛血液Exosome 中顯著差異表達的miRNA

注：顯著性差異的標準：Log2Ratio(Y/H)>1且P<0.05；差異miRNA按照差異倍數從小到大排序；up：相對于延邊黃牛，在韓延牛中上調表達miRNA；down：為下調表達。

2.5 差異表達miRNA的靶基因預測 為了更好的研究這些差異miRNA的靶基因，本試驗采用RNAhybrid和miRanda靶基因預測軟件對獲得差異表達的524個miRNA的靶基因進行預測。結果表明：在延邊黃牛和韓延牛血液Exosome miRNA中共預測到52348個靶基因，并發現許多miRNA可以靶向多個靶基因。其中在延邊黃牛中顯著下調表達的miR-9-5p靶向的基因是最多的，共靶向 257個靶基因，其次是在延邊黃牛中顯著上調表達的miR-99b，共靶向213個靶基因。

2.6 差異表達miRNA的靶基因GO顯著性富集分析 差異表達miRNA調控的靶基因參與的生物學過程主要包括：行為過程(behavior)、生物粘附(biolo-gial adhesion)、生物相(biological phase)、生物調控(biological regulation)和細胞殺傷(cell killing)等(圖3黑色部分)；細胞組分主要包括：細胞連接(cell junction)、細胞組件(cell part)、膠原蛋白三聚體(collagen trimer)和細胞外基質(extracellar matrix)等(圖3中灰色部分)；分子功能主要涉及抗氧化活性(antioxidant activity)、結合功能(bin-ding)、催化性能(catalytic activity)和通道調控功能(channel regulation activity)等(圖3淺灰色部分)。這些靶基因被富集到3473條生物學過程，394條細胞組分以及879條分子功能。

圖3 GO功能分類

2.7 差異miRNA的靶基因Pathway顯著性富集分析 本試驗預測獲得的miRNA的靶基因總共被注釋到326條信號通路中，其中最顯著富集的通路為mTOR信號傳導通路，有635個靶基因被注釋到該通路中。在本文中只展示富集程度排名前20的pathway條目，具體結果見圖4和表3。其中發現在兩個品種牛之間顯著差異表達miR-9-5p和miR-99b調控的一些靶基因都被注釋到了mTOR信號通路。

注：RichFactor指差異小RNA的靶基因中位于該pathway條目的基因數目與所有有注釋基因中位于該pathway條目的基因總數的比值。從圖4中可以看出RichFactor越大，表示富集的程度越大。Qvalue是做過多重假設檢驗校正之后的Pvalue，取值范圍為0到1，越接近于零，表示富集越顯著。

表3 靶基因顯著富集的20條KEGG通路

3 討論與結論

3.1 有關延邊黃牛的研究 延邊黃牛是我國著名五大地方品種之一，屬于山區役肉兼用型黃牛品種，是我國畜禽品種基因庫里寶貴的財富。延邊黃牛作為東北地區的優良品種，其抗寒性好，耐粗飼，抗病性強，容易育肥，肉質嫩而細膩多汁，肌肉橫斷面呈大理石花紋狀，味道鮮美可口，肉質明顯優于其他品種的牛，不飽和脂肪酸含量明顯高于其他品種牛，風味可與韓牛等媲美，是不可多得、具有中國特色的肉牛品種[10,11]。但是，延邊黃牛存在生長周期長，出欄率低等缺點，生長效率是影響延邊黃牛養殖業發展的關鍵因素之一[12]。因此，對于怎樣提高延邊黃牛的生長效率是現在發展延邊黃牛產業的至關重要的問題之一。最近研究表明Exosome與細胞間通訊交流、免疫調節、信號傳遞、生長發育等過程有關，其組成成分復雜，如蛋白質、脂類和miRNA等[13, 14]。大量研究數據表明，來源于各種組織細胞中的miRNA可通過Exosome進入循環系統，最終到達靶器官而發揮作用[15-17]。同時一些研究者認為這種Exosome-miRNA可能是一類新的生物信使。因此，關于Exosome-miRNA 功能的研究正引起國內外研究者的關注。

3.2 關于靶基因的研究 靶基因預測是研究miRNA分子機制以及生物功能的必要步驟。在生物體中，miRNA與靶基因相互作用是基因表達調控中的一個重要環節。一個miRNA可以調控不同的靶基因，也可以多個miRNAs共同調控一個基因[18, 19]。因此，研究miRNA 與靶基因相互作用的關系對探索miRNA在生物體生長發育中的作用具有重要意義。

3.3 關于RNA-seq的測序 本試驗通過RNA-seq測序分析，在延邊黃牛和韓延牛血液Exosome中獲得差異的524個差異表達miRNA，其中上調表達的271個，下調表達的253個。在524個差異表達miRNA中共預測出52348個靶基因，并發現許多miRNA 可以靶向多個靶基因，如miR-9-5p預測到257個靶基因。一個miRNA可以調控不同的靶基因的現象與前人研究相符。

3.4 關于靶基因的功能及通路分析 （1）為了進一步分析預測到的靶基因功能以及miRNA參與的生物學過程，采用GO富集和KEGG通路分析對預測到的靶基因進行分析，獲得相關的通路。GO富集分析可知差異miRNA的靶基因被富集到3473條生物學過程，394條細胞組分以及879條分子功能。但上述靶基因在延邊黃牛和韓延牛生長發育過程中的具體機制還需要進一步研究。（2）本試驗對差異表達miRNA的靶基因進行了KEGG通路分析，結果發現這些預測得到的miRNA的靶基因總共被注釋到326條信號通路中，其中排在前兩位富集的通路是mTOR信號通路和MAPK信號通路。如有635個靶基因被注釋到mTOR信號傳導通路，有1046個靶基因被注釋到MAPK信號通路。其中顯著差異表達的miR-9-5p和miR-99b調控的一些靶基因都被注釋到了mTOR和MAPK信號通路，因此推測血液Exosome中的miR-9-5p和miR-99b在延邊黃牛和韓延牛生長發育差異的過程中可能發揮重要的作用。

因此，下一步研究工作重點將選取2個關鍵差異表達miRNA(miR-9-5p和miR-99b)研究miRNA是如何通過關鍵信號通路，特別是mTOR和MAPK信號通路調控延邊黃牛和韓延牛生長發育調控的，從而在分子水平上探討影響延邊黃牛和韓延牛生長發育差異的機制。

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（2019–07–10）

國家自然科學基金項目（31660614）

S823.9+4

A

1007-1733(2019)10-0006-05