紅光預照射對紫花苜蓿幼苗UV-B抗性的影響

王丹 王茹丹 姜靜 王靜 李景原 王太霞

摘要：為探討紅光預照射對植物UV-B抗性的影響，以紫花苜蓿為材料，以日光燈為對照，設置UV-B、RL-UV、RL-DRL-UV 3種處理。結果表明，與對照相比，UV-B輻照對紫花苜蓿的光合特性和光合色素都有一定的抑制作用，并使紫外吸收物質含量增加，抗氧化酶（SOD、CAT）活性升高;在UV-B輻照之前增加紅光（RL）預輻照處理，紫花苜蓿的光合特性和光合色素含量均有所升高，紫外吸收物質的含量降低，抗氧化酶的活性升高，說明紅光預輻射能夠緩解UV-B輻照對紫花苜蓿造成的損傷，增強其對UV-B輻照的抗性;而進一步增加遠紅光的輻射處理后，紅光對苜蓿幼苗的保護作用消失。

關鍵詞：紫花苜蓿;UV-B輻射;光合特性;抗氧化;SOD活性;CAT活性

中圖分類號： Q945.78;S541+.101 ?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0179-04

收稿日期：2018-04-04

基金項目：國家自然科學基金（編號：31270225、U1504316）;河南省教育廳項目（編號：15A180015）;河南省高校重點項目（編號：16A180045）;河南師范大學青年科學基金（編號：2014QK19、2015QK16）。

作者簡介：王 丹（1981—），女，河南南陽人，博士，講師，主要從事植物發育及分子生物學研究。

通信作者：王太霞，博士，教授，主要從事藥用植物學研究。

太陽光是地球能量的主要來源，其中紫外線（ultraviolet）根據波長的不同可以分為UV-A（315～400 nm），UV-B（280～315 nm）和UV-C（100～280 nm）[1]。UV-A很少被空氣中的臭氧層吸收，但是輻射作用非常小，一般無殺傷力;UV-B大部分可以被臭氧層吸收，有約10%會到達地面，有研究表明它可以誘導植物產生一系列生理反應，影響植物的生長代謝[1]。而UV-C盡管對生物的輻射傷害非常大，但是卻被臭氧層吸收而無法到達地面。近年來，環境污染導致臭氧層遭受到了嚴重的破壞，使得到達地球表面的紫外輻射有所增強，因此，探究植物對UV-B輻射的響應機制，尋求增強植物UV-B抗性的新途徑已經成為一個研究熱點。

UV-B輻射可以誘導植物體內多種保護物質的產生，例如抗氧化酶、伴侶蛋白、類胡蘿卜素和黃酮類等低分子抗氧化物，這些保護物質可以幫助植物抵抗UV-B輻射造成的傷害[2-4]。近年來人們發現植物對UV-B的防御系統不僅能被UV輻射所激活，也可以被低劑量的處于藍光和紅光波段的可見光所激活[5-6]。Beggs等對玉米的研究發現，持續的紅光照射能大大增強由UV-B所誘導的花青素合成[7]。這是因為光敏色素能夠調節花青素合成途徑中的2個關鍵酶——苯丙氨酸解氨酶（PAL）[8]以及查爾酮合成酶（CHS）的活性[9]。范雅等利用紅色LED燈處理綠豆，發現相較于自然光組，紅色LED燈處理綠豆可以提高光合效率[10]。人們推測，紅光對植物具有保護功能，使其免受UV-B輻射傷害，可能是紅光誘導了光敏色素的產生，從而激發了受光敏色素直接調節的酶活性，提高了生理生化代謝機能，促進植物初生代謝水平[11]。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）別稱紫苜蓿，由于其適應性廣、產草量高，且富含蛋白質、維生素和礦物質等營養物質，被譽為“牧草之王”。我國苜蓿種植面積約3.77×106 hm2，居各類人工草地之首[12]。因此，研究紫花苜蓿對環境的適應機制具有重要的農業價值。近年來，我國臭氧總量一直在下降，作為苜蓿的重要產區，如青藏高原，一方面其對全球氣候變化敏感，其上空臭氧消耗更嚴重，全年維持低值[13];另一方面，其氣候稀薄，地勢高，懸浮顆粒物少，到達地球表面的UV-B輻射較高[14-16]。因此，研究紅光預照射對紫花苜蓿幼苗UV-B抗性的影響，旨在為探究紫花苜蓿 UV-B 逆境適應變化過程中的調控機制，也為提高苜蓿的產量和營養品質提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與光源

本試驗材料為紫花苜蓿，品種為金皇后，試驗所用光源分為UV-B（308 nm，0.35 W/m2）、紅光（RL，λmax=664 nm，100 W/m2）、遠紅光（DRL，λmax=730 nm，1.5 W/m2），光照強度為2 800 lx。試驗時間為2017年3—7月，試驗地點為河南師范大學生命科學學院植物組實驗培養間。

1.2 試驗設計

以室內正常生長4周時間的紫花苜蓿幼苗為試驗材料，將其分為4組，進行不同的光照處理：以日光燈輻照作對照（CK），UV-B組紫外輻射處理2 h;RL-UV組先進行10 min紅光預輻射，再紫外處理2 h;RL-DRL-UV組先進行 10 min 紅光預輻射，再進行10 min遠紅光預輻射，然后紫外處理2 h。處理完畢后，將苜蓿置于黑暗環境中0.5 h后測定各項指標。不同光照處理的紫花苜蓿見圖1。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 光合作用參數的測定 光合作用速率、氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率參數選用LI-6400XT光合儀（LI-COR）在實驗室隨機選取5株紫花苜蓿直接活體測定。 測定時間為15：00—17：00。

1.3.2 葉綠素和類胡蘿卜素含量測定 使用分光光度法[17]，紫外吸收物質含量測定采用1%鹽酸-甲醇法;超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑法;過氧化氫酶（CAT）活性測定采用過氧化氫法[18]。

1.4 數據處理

試驗所有指標均重復測定3次，光合特性指標重復5次。使用Microsoft Excel 2010和GraphPad Prism 6軟件進行數據錄入、計算以及圖表繪制。用SPSS 14.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理下紫花苜蓿的光合特性參數

由表1可知，與對照相比，UV-B、RL-UV、RL-DRL-UV 3組輻照處理中，紫花苜蓿的光合速率均出現了極顯著下降，分別是0.53、2.95、0.37 μmol/（m2·s），較對照分別下降了93.09%、61.54%、95.18%，，光合速率排序依次為CK>RL-UV>UV-B>RL-DRL-UV。與對照相比，UV-B、RL-UV、RL-DRL-UV 3組輻照處理中，紫花苜蓿的氣孔導度均出現了極顯著下降，分別是54.94、47.06、69.66 mol/（m2·s），較對照分別下降了 31.48%、41.31%、13.12%，氣孔導度排序依次為CK>RL-UV>UV-B>RL-DRL-UV。與對照相比，UV-B、RL-UV、RL-DRL-UV 3組輻照處理中，紫花苜蓿的胞間CO2濃度均出現了極顯著上升，分別是366.53、376.52、273.16 μmol/mol，較對照分別上升了75.19%、7996%、30.56%，胞間CO2濃度排序依次為RL-UV>UV-B>RL-DRL-UV>CK。與對照相比，UV-B、RL-UV、RL-DRL-UV 3組輻照處理中，紫花苜蓿的蒸騰速率均出現了極顯著下降，分別是1.44、1.86、1.28 mmol/（m2·s），蒸騰速率排序依次為CK>RL-UV>UV-B>RL-DRL-UV。這說明UV-B輻照會導致苜蓿光合特性降低，經過紅光預輻照處理可以減緩UV-B對苜蓿的光合傷害，增加苜蓿對UV-B輻照的抗性，而遠紅光輻照處理可以抵消掉紅光的作用。

2.2 不同處理下紫花苜蓿光合色素的含量對比

由圖2可知，與對照相比，UV-B、RL-DRL-UV 2組輻照處理中，紫花苜蓿的葉綠素a含量分別下降了18.83%、12.68%，差異均達到極顯著水平（P<0.01）;葉綠素b含量分別下降了26.21%、15.51%，差異均達到極顯著水平（P<0.01）;葉綠素a與葉綠素b的總含量分別下降了21.17%、13.43%，差異均達到極顯著水平（P<0.01）。RL-UV處理后，與對照相比，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素a與葉綠素b總含量分別增加了4.5%、16.9%、8.47%，差異達極顯著水平（P<0.01）。說明紅光預照射后可以緩解由于UV-B輻照造成的葉綠素含量下降，遠紅光處理后，這種保護作用消失。

由圖3可知，與對照相比，UV-B、RL-UV、RL-DRL-UV 3組輻照處理中，紫花苜蓿的類胡蘿卜素含量均出現了極顯著下降，分別下降了6.38%、5.68%、5.92%。類胡蘿卜素含量排序依次為CK>RL-UV>RL-DRL-UV>UV-B，說明紅光可以在一定程度上緩解UV-B對苜蓿幼苗中類胡蘿卜素含量的影響。

2.3 不同處理下紫花苜蓿紫外吸收物質的含量對比

由圖4可以看出，與對照相比，UV-B、RL-UV組的總酚含量都極顯著增加，均為0.21 mg/g，均增加了5.2%;RL-DRL-UV組的總酚含量與對照相比極顯著降低，為 0.19 mg/g，下降了5.5%?？偡雍颗判蛞来螢閁V-B=RL-UV>CK>RL-DRL-UV。這說明UV-B可以提高總酚含量，紅光預處理可以緩解總酚含量的上升。

由圖5可以看出，與對照相比，UV-B、RL-UV組的類黃酮含量都極顯著增加，分別增加了6.66%，6.11%;RL-DRL-UV組的類黃酮含量與對照相比下降了5.43%，差異達到極顯著水平（P<0.01）。類黃酮含量排序依次為UV-B>RL-UV>CK>RL-DRL-UV。這說明UV-B輻照處理可以提高苜蓿幼苗中的類黃酮含量，紅光預處理可以抑制類黃酮含量的上升。

2.4 不同處理對紫花苜蓿SOD、CAT活性的影響

由圖6可知，與對照相比，UV-B、RL-UV組的SOD活性都極顯著增加，分別增加了56.12%，73.71%;RL-DRL-UV組的SOD活性與對照相比僅升高了25.85%。紫花苜蓿SOD的活性排序依次為RL-UV>UV-B>RL-DRL-UV>CK。這說明UV-B可以提高SOD活性，紅光預處理可以增加SOD活性的上升，遠紅光可以抑制紅光對SOD活性的影響。

由圖7可知，與對照相比，UV-B、RL-UV組的CAT活性都極顯著增加，分別增加了142.86%，350.00%;RL-DRL-UV組的CAT活性與對照相比僅升高了21.43%。紫花苜蓿CAT活性排序依次為RL-UV>UV-B>RL-DRL-UV>CK。這說明 UV-B可以提高CAT活性，紅光預處理可以加快CAT活性的上升，遠紅光處理可以抑制紅光對CAT活性的影響。

3 討論

3.1 紅光預照射對苜蓿幼苗光合特性、光合色素的影響

植物的光合作用是其與環境長期進化的結果，能夠適應環境，對植物生長發育具有十分重要的作用。光合色素在光合作用中具有捕捉、傳遞、利用光能的特點，與光合作用有著緊密關系。本研究中，與對照相比UV-B輻射導致紫花苜蓿光合特性和光合色素含量顯著下降，而短期紅光預輻射的光合速率，葉綠素、類胡蘿卜素含量，總酚和類黃酮含量均介于對照組和UV-B處理組。這表明紅光預輻射對植物具有一定的保護作用，能夠減少UV-B輻射對紫花苜蓿的傷害。Biswal等在研究UV-B對豇豆子葉中光合作用機制活性的影響時，發現了短期紅光（λmax=612 nm）對植物的保護效應，并假定是由于誘導了PhyB機制的形成：使用紅光預輻射處理，則PhyB活性增大，進而提高植物抗UV-B輻射脅迫的能力[19]。本研究中，紅光預輻照能夠抑制苜蓿幼苗的光合特性和光合色素的下降，增強植物對UV-B輻射的抗性可能是由于光敏色素B參與維持葉片老化期間葉綠素水平和葉綠體結構的完整。

3.2 紅光預照射對UV-B輻射下紫花苜蓿紫外吸收物質含量的影響

UV-B吸收物質通常是指在生物合成生命非必需物質并儲存次生代謝產物過程中合成的部分非光合色素，它們可以保護葉片內部的細胞免受UV-B輻射的傷害。苯酚、類黃酮和花青素具有較強的UV-B吸收能力，增加其含量可以保護植物免受光損傷[20]。唐麗等發現，UV-B對植物生長有顯著影響，尤其是抗氧化劑的影響，UV-B的輻射提高了植物體內類黃酮、總酚、花青素的含量[21-22]，這與本研究結果一致?？赡苁窃赨V-B脅迫下，幼苗生成許多的紫外吸收物質，這樣不僅可以減少進到體內的UV-B的輻射凈通量，而且也可以清除體內更多的多余自由基。朱新軍發現，紅光、激光分別與UV-B復合作用處理大豆，紫外吸收物質較單獨UV-B處理低，而且發現單獨紅光、激光處理會使紫外吸收物質增加，猜測可能是由于激光能提高紫外吸收物合成酶的活性，從而增強植物防護能力[11]。本研究發現，UV-B輻射處理能夠顯著誘導紫花苜蓿體內總酚、類黃酮和花青素的合成，這與唐麗等的結果[21]一致，而在進行紅光預輻射后紫外吸收物質的含量有所下降，若繼續增加遠紅光的預輻射，則會顯著降低紫外吸收物質的合成。這說明，紅光可以減弱由UV-B輻照所引起的類黃酮物質含量的升高，也就是說紅光在一定程度上激發了苜蓿的自我保護機制，從而抑制了 UV-B 對苜蓿的影響。筆者猜測，紅光一方面通過控制類黃酮的生成量同時參加ROS清除過程減輕UV-B對苜蓿的損害;另一方面紅光會提高UV-B吸收物合成酶的活性。

3.3 紅光預照射對UV-B輻射下紫花苜蓿氧化酶活性的影響

植物在受到UV-B輻射后，會產生大量有毒害作用的活性氧和自由基，而植物體內存在著抗氧化酶系統，這些抗氧化酶的協同作用使自由基保持在低水平，避免膜損傷，從而達到保護細胞的目的[23]。本研究發現，UV-B輻射處理后，苜蓿葉中光合速率、氣孔導度、蒸騰速率的減少伴隨著SOD和CAT活性的增加，這與前人研究結果一致;用紅光預輻射葉片后再照射UV-B，其SOD和CAT的活性比單獨照射UV-B時更強，若在紅光的預輻射后再增加遠紅光處理，則會部分消除紅光對SOD和CAT活性的有益影響。有研究證實，在UV-B輻照的初始階段，可能誘導SOD和CAT活性有所增加[24]。研究表明，在用增強UV-B處理芒果葉片時發現，在一定時間段內會導致成年葉片SOD、CAT、POD活性升高，并引起維生素C和還原型谷胱甘肽（GSH）的積累[25]。但是，Hui等發現高強度的UV-B輻射顯著降低葉綠素熒光參數、葉綠素和類胡蘿卜素含量和抗氧化酶活性[26]，這可能是由于強度過高，對細胞膜造成了傷害。朱新軍預先用紅光處理，然后UV-B輻射，發現植物SOD活性沒有顯著性差異[11]。但是有研究者發現，底物特別是酚類物質的強化合成，可以通過UV輻射和紅光輻射來提高過氧化物酶活性[27]。也有研究發現植物體內的抗氧化酶在紅光的照射下會被激活，但是該機制在許多方面還不清楚[5]。

有研究在萵苣種子萌發時，發現紅光輻射后對種子萌發具有促進作用，隨后遠紅光輻射處理后抑制萵苣種子萌發，造成對紅光效應的逆轉，為紅光-遠紅光逆轉效應，推測可能是存在一個能發生光逆轉的光受體，或者相互拮抗的光受體[28-30]。有研究發現紅光可以顯著抑制黃綠豆下胚軸切割段的伸長，而遠紅光部分反轉紅光[31]。也有研究報道PhyB能夠在遠紅光輻照下顯著地促進擬南芥的黃化，這剛好與紅光輻射后的效果相反[32]。本研究發現，紅光能夠對苜蓿的UV-B輻射起到一定的保護作用，遠紅光輻射后這種保護作用消失，再次印證了紅光-遠紅光逆轉效應。

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