抗幽門螺桿菌便餐粉配方優化及其體外抑菌研究

邱俊杰， 孫禮進， 張忠寶， 李 浩， 張 智

(四川輕化工大學a.生物工程學院;b.化學工程學院, 四川 自貢 643000)

引 言

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是胃炎、胃潰瘍、胃癌等多種疾病的致病因子。Hp感染率極高，在全球感染率超過50%以上，在不同的國家和地區，感染率也大不相同，在發達國家感染率為30%～50%，而發展中國家感染率高達80%以上，并且感染人群偏向低齡化[1]。幽門螺桿菌感染已于2015年被定性為傳染性疾病[2]。臨床上治療Hp的感染，多采用抗生素多聯療法，但維持時間短，而且長期用藥容易造成腸道菌群混亂和耐藥性的增加，從而導致治療Hp的感染更加困難[3-4]。

Hp的感染與其結構有著極大的關系[5-6]，目前已經熟知的致病因子主要有鞭毛、黏附素、脲酶、空泡毒素、中性粒細胞激活蛋白(Neutrophil-activating protein，NAP)等。鞭毛主要為Hp提供動力，使其可以快速穿過胃酸，到達中性的粘液層；尿素酶通過將尿素分解形成氨和二氧化碳，在菌體周圍形成氨云保護層，從而可以抵御胃酸對菌體的損傷，并有利于菌體定植胃黏膜上；當Hp到達胃黏膜時，黏附素將與胃黏膜上皮細胞的受體緊密結合，繼而損傷上皮細胞；空泡毒素可以使靶細胞發生空泡化，細胞骨架重排，細胞死亡等形態學的改變。這些致病因子的發現有利于對Hp治療提供新的靶點，如Hp血型抗原結合粘附素(Blood group antigen binding adhesion，BabA2)、尿素酶B亞單位(urease B subunit，UreB)和鞭毛蛋白A亞單位(Flagellin A subunit，FlaA)等作為疫苗的應用已被建立。

卵黃抗體(Yolk antibody，IgY)是鳥類在受到某種抗原刺激時，在血液中形成特異性抗體，并將這些抗體轉移到卵黃中，其本質是卵黃免疫球蛋白。特異性IgY通過直接與病原菌的靶點相結合，改變其整體結構，從而達到抑制作用，此外在消化酶的作用下，一部分IgY被分解成小肽(Fab)，被機體吸收進入血液后，可與血液中的病原體黏附素結合，從而使其失去致病性。國內外研究者已經對IgY的優越性特性有了清楚的認識，已被廣泛應用于食品，疾病預防，免疫檢測等多個領域[7-9]。

但IgY存在于卵黃液中，單純的提取IgY，耗時耗力，成本高，而且造成大量蛋白質資源的損失，甚至會污染環境。此外，雞蛋在貯存過程中，由于受外界濕度，溫度以及貯存方式等的影響，容易發生腐敗變質[10]。

基于此，本文將高免蛋液(BabA2、UreB和FlaA免疫產蛋雞制備)制備成高免蛋粉，與其他配料混合，開發一種具有抗幽門螺桿菌功能的便餐粉，不僅對治療和預防Hp的感染具有重要的社會價值，還能形成新的經濟增長點。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺 (3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine, TMB)單組份顯色液(碧云天生物科技公司)，HRP標記的山羊抗雞抗體(美國Sigma公司)，新生胎牛血清(Invitrogen公司)，高免雞蛋(四川輕化工大學生物制藥教研室實驗室制備)，Hp液體培養基、Hp選擇性添加劑(青島海博生物技術有限公司)，其他化學試劑均為分析純。

YQX-II型微需氧培養箱(美國Gene Science)，DHp-9160B型電熱恒溫培養箱(上?，槴\實驗設備有限公司)，YC-3000型噴霧冷凍干燥機(上海雅程儀器設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 高免蛋粉制備

收集高免雞蛋，清水洗凈蛋殼，去蛋清留蛋黃，稱重放入65 ℃烘箱殺菌40 min，冷卻至室溫備用。按照YC-3000噴霧冷凍干燥機說明書進行物料器的安裝，打開通風循環通道，關閉出水孔，保持密閉狀態，將制冷機的循環泵打開循環10 min后開始制冷，待物料器內的溫度降至-35 ℃，安裝進料設備，設定蠕動速度為25 r/min，保持物料溫度為-15 ℃以下，結束進料后，打開冷井閥門，關閉風機，關閉物料器兩側閥門，打開真空機及真空閥門，至物料器內真空度小于150 Pa，冷井溫度達-40 ℃，開始加熱，設定溫度為50 ℃，工作數小時后，關閉加熱，物料溫度在時間段內不再上升時關機取料，蛋黃粉稱重。

1.2.2 便餐粉制作工藝

將燕麥米、糯米通過膨化工藝熟化；葛根洗凈，加入適量水，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121 ℃熟化20 min后立即取出，將其放置于100 ℃烘箱中烘干后，放入粉碎機中將其粉碎，過100目篩網，即得葛根粉。將燕麥粉、糯米粉，葛根粉，紫薯粉，脫脂奶粉，麥芽粉按照一定的比例混合均勻，在以上配方的基礎上，添加木糖醇，麥芽糊精和高免蛋粉，即得便餐粉，參考馬永軒[11]等方法，通過單因素和正交實驗優化配方改善便餐粉的品質。

1.2.3 便餐粉品質指標的測定

(1) 休止角的測定：將潔凈玻璃放置于水平實驗臺上，將潔凈的漏斗放置于鐵架臺上，垂直懸空，下端距離玻璃面3 cm，準確稱取便餐粉3 g，緩慢倒入玻璃漏斗，讓其自然滑落，測定堆積物的直徑和高度，各測量3次取平均值，按照tanθ=2×h/d求其休止角。

(2) 堆積密度的測定：準確稱量便餐粉20 g，緩慢倒入100 mL潔凈量筒中，測定體積，重復三次求其平均值，按照質量/體積即得堆積密度。

(3) 結塊率的測定：準確稱量便餐粉30 g，加入65 ℃的溫水，攪拌至無干粉存在，靜置冷卻至室溫，用20目篩進行過濾，濾渣用水洗凈，吹風機吹干后，將干結物塊與篩網共同稱重，總質量減去篩網質量即為結塊率，重復三次。

(4) 管道流動性的測定：準確稱量便餐粉30 g，加入65 ℃的溫水 105 mL，攪拌至無干粉存在，靜置冷卻至室溫，緩慢倒入鼻飼管中，記錄5 min流出的總體積，計算出流動速率(單位時間流出的體積mL/min)，重復3次。

(5) 管道掛壁的測定：準確稱量便餐粉30 g，加入65 ℃的溫水105 mL，攪拌至無干粉存在，靜置冷卻至室溫，緩慢倒入鼻飼管中，待其全部流出后，帶鼻飼管稱重，總質量減去鼻飼管質量即為管道掛壁重量，重復3次。

1.2.4 單因素試驗設計

參照1.2.3的方法，分別測定木糖醇、麥芽糊精和高免蛋粉添加量對便餐粉休止角、堆積密度、結塊率、管道流動性和掛壁量的影響。

1.2.5 正交實驗設計

在單因素試驗的基礎上，以木糖醇、麥芽糊精和高免蛋粉的添加量為因素，通過SPSS17.0軟件設計L9(33)正交表，見表1，測定每組配方的休止角、堆積密度、結塊率、管道流動量以及掛壁量，并將每組配方沖調后隨機邀請人員進行品嘗打分，評分標準見表2，對配方進行優選。

表1 正交因素水平表

表2 評分標準

1.2.6 便餐粉效價穩定性測定

優選出最佳配方后，將便餐粉用全自動包裝機包裝后，分別放入-20 ℃、4 ℃、37 ℃、65 ℃，通過間接Elisa法測定便餐粉和高免蛋粉的OD450值，具體如下：用pH=9.6的磷酸鹽緩沖液將UreB蛋白稀釋至10 ug/mL作為包被液，加入96孔板，每孔100 μL，4 ℃靜置12 h，PBST洗滌，每次3 min，重復三次；加入5%脫脂奶粉于37 ℃封閉1.5 h，PBST洗滌同上；將便餐粉和高免蛋粉稀釋2500倍后加入96孔板，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌同上；加入二抗(HRP標記的山羊抗雞抗體)，每孔100 μL，37 ℃反應1 h，PBST洗滌同上；加入TMB單組份顯色液，每孔100 μL于暗處顯色5 min；最后加入1 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀450 nm測定吸光度，P/N>2.1為陽性(見公式1)。

P/N=(A待測樣品-A空白對照)/

(A待測陰性對照樣品-A空白對照)

(1)

1.2.7 便餐粉體外抑菌實驗

Hp的培養：按照Hp固體培養基的配方滅菌后，冷卻至50 ℃左右，加入1/100的Hp選擇性添加劑(含1 mg/mL頭孢磺啶，0.5 mg/mL兩性霉素，1 mg/mL萬古霉素，2 mg/mL甲氧芐啶)，7%的胎牛血清，于超凈工作臺凝固30 min，取-80 ℃保存的Hp菌種50 μL涂布于培養基上，于微需氧培養箱(85%N2，10%O2，5%CO2)中培養5～7天，挑取單菌落于Hp液體培養基中，37 ℃微需氧培養5～7天，調整Hp菌液濃度為108CFU/mL，備用。

將便餐粉溶于Hp滅菌液體培養基中，0.22 μm濾膜過濾除菌，將其與等體積濃度為108CFU/mL Hp菌液混合，調整便餐粉的濃度分別為20 mg/mL、40 mg/mL和60 mg/mL，最后均加入1/100的Hp選擇性添加劑，7%的胎牛血清，放入37 ℃微需氧條件培養。每隔12 h在超凈工作臺收集樣品200 μL，600 nm測定吸光度。

1.2.8 統計學方法

2 結 果

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 麥芽糊精對便餐粉品質指標的影響

(1) 麥芽糊精添加量為20%和25%的休止角顯著低于10%、15%和30%(44.38±0.14°、43.85±0.16° vs 47.15±0.25°、47.56±0.21°、45.66±0.23°，P<0.05)，如圖1所示。

注：圖中小寫字母表示0.05水平下的差異顯著性，下同
圖1 麥芽糊精添加量對便餐粉休止角的影響

(2) 隨著麥芽糊精添加量的增大，便餐粉的各組堆積密度之間無顯著性差異，如圖2所示。

圖2 麥芽糊精添加量對便餐粉堆積密度的影響

(3) 隨著麥芽糊精添加量的增加，便餐粉的結塊率從26.70%±1.10%降低到15.26%±0.88%各組之間呈顯著性差異(P<0.05)，如圖3所示。

圖3 麥芽糊精添加量對便餐粉結塊率的影響

(4) 隨著麥芽糊精添加量的增大，便餐粉的流量從(13.03±0.05) mL/min升高到(18.65±0.04) mL/min，如圖4所示。

圖4 麥芽糊精添加量對便餐粉流動性的影響

(5) 麥芽糊精添加量從10%增加到15%時，掛壁量從(2.78±0.52) g增加到(2.99±0.67) g當添加量超過20%時，掛壁量無顯著性差異，如圖5所示。

圖5 麥芽糊精添加量對便餐粉掛壁的影響

2.1.2 高免蛋粉對便餐粉品質指標的影響

(1) 高免蛋粉添加量從5%增加到20%時，休止角由46.32±0.42°增加到48.66±0.55°(P<0.05)，添加量大于20%時，粉體休止角無顯著性差異，如圖6所示。

圖6 高免蛋粉添加量對便餐粉休止角的影響

(2) 隨著高免蛋粉添加量從10%增加到15%，堆積密度由(0.43±0.04) g/mL降低為(0.35±0.03) g/mL(P<0.05)，添加量超過15%時，各組堆積密度之間無顯著性差異，如圖7所示。

圖7 高免蛋粉添加量對便餐粉堆積密度的影響

(3) 隨著高免蛋粉添加量的增加，結塊率由19.34%±0.54%增加到26.53%±0.44%，15%的與20%的結塊率呈現顯著性差異(20.71%±0.52% vs 24.34%±0.56%，P<0.05)，添加量超過20%時，各組結塊率無顯著性差異，如圖8所示。

圖8 高免蛋粉添加量對便餐粉結塊率的影響

(4) 高免蛋粉添加量為10%時，流量為(16.57±0.19) mL/min，顯著高于5%、15%、20%和25%的流量(P<0.05)，如圖9所示。

圖9 高免蛋粉添加量對便餐粉流動性的影響

(5) 高免蛋粉添加量低于15%時，各組掛壁量無顯著性差異，20%的掛壁量顯著高于15%((2.75±0.19) g vs (2.24±0.14) g，P<0.05)，添加量超過20%時，各組掛壁量無顯著性差異，如圖10所示。

圖10 高免蛋粉添加量對便餐粉掛壁的影響

2.1.3 木糖醇對便餐粉品質指標的影響

(1) 隨著木糖醇的增加，休止角46.43±1.23°降低至40.01±1.09°，各組之間呈顯著性差異(P<0.05)，如圖11所示。

圖11 木糖醇添加量對便餐粉休止角的影響

(2) 隨著木糖醇添加量的增加，各組堆積密度并無顯著性差異，如圖12所示。

圖12 木糖醇添加量對便餐粉堆積密度的影響

(3) 木糖醇添加量為10%時，結塊率最小為6.70%±0.06%，與1%、5%、15%和20%添加量呈顯著性差異(P<0.05)，如圖13所示。

圖13 木糖醇添加量對便餐粉結塊率的影響

(4) 木糖醇添加量為10%和15%的流量顯著高于1%、5%和20%的流量((19.74±1.15) mL/min、(18.46±1.22) mL/min vs (10.44±0.88) mL/min、(12.51±0.88) mL/min、(12.33±0.83) mL/min，P<0.05)，如圖14所示。

圖14 木糖醇添加量對便餐粉流動性的影響

(5) 隨著木糖醇添加量的增加，各組掛壁量之間無顯著性差異，如圖15所示。

圖15 木糖醇添加量對便餐粉掛壁的影響

2.2 正交實驗結果

三個因素對便餐粉綜合得分的影響順序為：高免蛋粉>麥芽糊精>木糖醇，最佳組合為A2B2C1，即麥芽糊精添加量為20%，高免蛋粉添加量為15%，木糖醇添加量為10%，見表3。

表3 正交實驗結果

各組的品質指標的測定，見表4。通過SPSS17.0軟件分析評分與五個指標之間的相關性，休止角，結塊率與評分呈顯著性負相關(P<0.05)，流動性與評分呈極顯著性負相關(P<0.01)，見表5。

表4 各組品質指標測定

表5 得分與指標之間的相關性

*：相關性顯著(P<0.05)；**：相關性極顯著(P<0.01)

2.3 便餐粉效價穩定性檢測

連續測定4個月同一批次的高免蛋粉及便餐粉OD450值，如圖16與圖17所示。高免蛋粉和便餐粉在4 ℃和37 ℃時的各組OD450值無顯著性差異，在65 ℃時的OD450值均顯著低于4 ℃和37 ℃(P<0.05)。經P/N計算，高免蛋粉在65 ℃條件下2個月后效價已成陰性(P/N<2.1)，而便餐粉效價在4個月檢測期內均為陽性(P/N>2.1)。

圖16 溫度對高免蛋粉效價影響

圖17 溫度對便餐粉效價的影響

2.4 便餐粉體外抑菌

隨著便餐粉濃度的增加，同一時刻的OD600值逐漸降低(P<0.05)，當便餐粉濃度達60 mg/mL時，在72 h內，各組的OD600值無顯著性差異，如圖18所示。

圖18 便餐粉體外抑菌結果

3 討 論

目前高免蛋液干燥的方法主要是熱風噴霧干燥，許多研究者利用此干燥方法獲得的高免蛋粉可以代替抗生素治療某些疾病[12]，但在此過程中，高溫會影響IgY的活性。在本研究中，采用噴霧冷凍干燥生產的高免蛋粉，在常溫下4個月內保持高效價，并且所得的產物為粉末狀，復水性好，乳化性強(未發表數據)。說明噴霧冷凍干燥更適合高免蛋液的工業化生產，與其他研究者得出結論一致[13-14]。

通過膨化技術獲得的膨化粉稠度高，更有利于便餐粉口感的調節，但遇水容易形成糊化層，不易溶解，形成結塊[11]。市場上的粉劑產品多采用添加食品添加劑的方法加快粉劑溶解，眾所周知，食品添加劑的副作用眾多。因此本研究通過調整配方的添加量優化便餐粉的沖調性和溶解性，單因素實驗發現麥芽糊精和木糖醇可以降低便餐粉結塊率，可能是破壞了糊化層的形成，高免蛋粉由于油脂含量高結合膨化粉糊化層的形成，導致結塊率提高。通過正交實驗得出高免蛋粉，木糖醇和麥芽糊精對便餐粉品質的影響程度，并且得出了休止角、結塊率、流動性與綜合得分的相關性，為便餐粉的進一步優化奠定了基礎，同時也為其他粉劑產品的研發提供了新的思路。

通過持續監測高免蛋粉和便餐粉的OD450值，我們發現，高免蛋粉與便餐粉在低溫環境下，效價可維持更長時間，所以此便餐粉適于低溫保存，并且在65 ℃的條件下，便餐粉的效價可維持4個月以上，而高免蛋粉僅能維持2個月左右，推測便餐粉中的配料對IgY存在保護作用，體外抑菌實驗表明便餐粉可抑制Hp的生長，并且當濃度達到60 mg/mL時，即可在時間段內達到完全抑制的效果。說明了制備出的便餐粉具有治療Hp感染的潛能。