17β雌二醇調控MALAT-1抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移

王 娟，劉青青，馮余寬

(1.四川省第四人民醫院婦科，四川 成都 610016；2.四川大學華西第二醫院婦產科，四川 成都 610041)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，死亡率居婦科腫瘤首位[1，2]。雌激素受體與乳腺癌、子宮內膜癌等多種女性惡性腫瘤的發生、發展和預后有關[3]。與乳腺癌不同，雌激素與卵巢癌的關系仍然存在爭議[4]。近年研究發現，雌激素及其受體在卵巢癌中的異常表達與卵巢癌患者的發病機制、預后及對化療反應有關，但其與卵巢癌預后的關系始終存在爭議[5，6]。大規模的深度基因測序顯示，一些沒有蛋白編碼能力的長鏈RNA影響細胞的增殖、凋亡和細胞周期，從而對腫瘤等疾病中有巨大的調控作用[7，8]。其中MALAT-1被證實在非小細胞肺癌，卵巢癌，結直腸癌和肝癌等多種惡性腫瘤中高表達，其表達水平與腫瘤進展呈正相關。多項研究顯示MALAT-1能影響上皮性卵巢癌細胞的增殖、遷移、細胞周期和凋亡[7]。而MALAT-1下游基因和雌激素調控通路靶基因有重疊[9，10]。本課題擬在以往病理檢測的研究外，利用細胞模型檢測雌激素及雌激素受體對卵巢癌的影響，并初步探討雌激素和MALAT-1的相互關系。

1 材料與方法

1.1 材料本實驗時間為2018年9月至2019年3月。人卵巢癌癌細胞系A2780和OVCAR3購自ATCC細胞庫，胎牛血清購自BI公司，青鏈霉素購自Roche公司，強力霉素購自Sigma公司。長鏈聚合酶鏈反應試劑盒購自Roche公司，NheI和HindIII限制性酶購自Takara公司，RNA提取及反轉錄試劑購自Qiagen公司。劃痕實驗試劑盒購自Cell Biolabs公司。軟瓊脂購自Beckton Dickinson GmbH公司。細胞增殖檢測試劑盒購自Promega公司。引物序列在成都擎科公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 人卵巢癌癌細胞系A2780和OVCAR3在1640-F-12培養基中添加10%胎牛血清、100 U /ml青霉素、100 lg/ml鏈霉素，培養環境為37 ℃、5%CO2。細胞均購自ATCC細胞庫。在RPMI 1640中培養，添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 lg/ml鏈霉素，培養環境為37 ℃、5%CO2。

1.2.2雌激素受體表達載體的克隆和轉染 使用長鏈聚合酶鏈反應(Expand Long Ranged NTPack，Roche Diagnostics)擴增人雌激素受體的編碼序列(1788bp)。NheI限制性酶位點包含在PCR引物1(5’-GCCGGCTAGGCATGCCATGACCTCCACCA-3’)中，HindIII限制性酶位點包含在引物2(5’-CCTTAACCGACCGTGGAACCC-3’)中。反應步驟如下：①預變性95 ℃、5 min；②35次循環：變性95 ℃、30 s，退火58 ℃、30 s，延伸72 ℃、3 min；③最終延伸72 ℃、10 min。PCR產物進行凝膠電泳，從凝膠中切出正確大小的條帶。用NheI和HindIII消化PCR產物，插入pcDNA3.1(Life Tech.)的克隆位點。

1.2.3短發夾RNA結構的設計與克隆 在DSIR(Designer of Small Interfering RNA)上設計了以人MALAT-1為靶點的短發夾pinRNA(shRNA)序列和作為陰性對照的亂序序列。并亞克隆到psilencer 4.1-cmv-neovector中。核苷酸序列如下：shRNA-F(5’-GGAAGATAGAAACAAGATATATCTTGTTTCT ATCTTCC -3’)；shRNA-R(5’-GGAAGATAGAAACAAGATATATCTTGTTTCTATCTTCC -3’)；陰性對照shScramble-F(5’-AGATCCGTATAGTGTACCTTATAAGGTACACTATACGGATCT -3’)；shScramble-R(5’-AGATCCGTATAGTGTACCTTATAAGGTACACTATA CGGATCT -3’)。將載體導入MB231細胞后，將新霉素(1 mg/ml，Sigma-Aldrich)加入培養基中，獲得穩定表達shRNA的細胞克隆。

1.2.4定量mRNA分析 采用qiagen rneasy小型試劑盒提取總RNA。每個樣本總RNA的1 lg用莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄系統(Life Tech)和隨機六聚體引物進行逆轉錄。人PSF基因的引物為：人(NR002819)Forward(5’-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG -3’)；Reverse(5’-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA -3’)。在Applied Biosystems 7500快速實時PCR系統(Applied Biosystems)上進行定量PCR反應。利用熔融曲線分析了PCR產物的特異性。在進行聚合酶鏈反應時，每個樣本都被復制。采用GAPDH作為內部對照。

1.2.5劃痕試驗(Cell Biolabs) 劃痕試驗用于分析野生型A2780、E2處理的A2780和MALAT1敲除的細胞的遷移水平。根據制造商的說明，每孔加入2×105個細胞。移除插入物(0 h)后，采集傷痕區域的圖像。24小時后記錄傷痕閉合情況。采集圖像使用配備了數碼相機(Leica DFC300FX)的相差顯微鏡(Leica Microsystems)，并使用Adobe Photoshop CS3軟件對采集到的圖像進行分析。

1.2.6軟瓊脂細胞集落成形試驗 35 mm組織培養皿每個加入3 ml培養基(MEM；Invitrogen)和10%FBS、0.33%bd Difco瓊脂(Beckton Dickinson GmbH，海德堡，德國)分別制成軟瓊脂，再分別加入約5×103個野生型A2780、E2處理的A2780和MALAT1敲除的細胞，在37 ℃、5%CO2以及高濕度條件下培養。21天后進行細胞集落計數。

1.2.7細胞增殖測定 平底6孔培養皿的每個孔加入含有10% FBS的MEM，并分別培養野生型MB231、E2處理的MB231和MALAT1敲除的細胞，環境為37 ℃、5% CO2。根據制造商的說明，將Celtiter 96(Promega Corporation，Madison，WI)添加到每個孔中。為了測定細胞活力，每24小時使用550 BioRad平板閱讀器(Bio-Rad，Hertfordshire，UK)測量490 nm處的吸光度。每個樣品在分析中重復三次，并分別獨立重復兩次。100 lL DMEM用作空白對照。

1.3 統計學方法使用SPSS 10.0軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，比較采用t檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高濃度雌激素(E2)抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移為了檢測E2對卵巢癌細胞增殖和腫瘤克隆形成的影響，1 nM和100 nM濃度的E2分別被加入A2780和OVCAR3細胞系中，培養7天后，發現低濃度1 nM E2對細胞的增殖沒有影響，但當E2濃度增加到100 nM后，兩種細胞的增殖都受到了抑制(圖1a)。隨后檢測了高濃度E2對其他常見女性腫瘤的影響，實驗顯示高濃度E2對宮頸癌和肺癌細胞增殖沒有影響(圖1b)。隨后我們利用軟瓊脂克隆成形實驗檢測高濃度E2對卵巢癌細胞克隆形成的影響，發現100 nM的E2能抑制腫瘤克隆形成 (圖1c)。劃痕實驗被用來檢測高濃度E2對細胞遷移的影響，100 nM的E2處理A2780、OVCAR3細胞24 h后進行劃痕，劃痕后24 h拍照觀察發現，未被E2處理的A2780細胞劃痕面積大大縮小，而E2處理的A2780細胞劃痕幾乎沒有變化(圖1d)。OVCAR3細胞劃痕面積有減少，但沒有A2780細胞明顯，未在圖中展示。

圖1 雌激素對卵巢癌細胞增殖和遷移的作用 a.A2780和OVCAR3細胞接受不同濃度雌激素處理后的生長曲線；b.宮頸癌細胞Hela和肺癌細胞A549細接100 nM濃度刺激處理后增殖變化；c.A2780和OVCAR3細胞接受100 nM濃度處理后單細胞克隆成形；d.A2780接受100 nM濃度處理后劃痕恢復情況。

2.2 雌激素以ERα依賴的方式下調MALAT-1抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移MALAT-1在卵巢癌中高表達，而MALAT-1下調抑制細胞遷移和侵襲[5，6]。Malat-1特異性的shRNA被轉染進A2780細胞，發現與100 nM雌激素處理相似，A2780細胞的增殖下降(圖2a)，遷移也下降(圖2b)，熒光定量PCR的結果顯示，在雌激素處理后，A2780細胞中MALAT-1的表達水平降低(圖2c)。

雌激素有多個受體，為了找出雌激素對MALAT-1的調控方式，ERα和ERβ特異性的shRNA被分別轉染入A2780細胞，并用強力霉素篩選獲得穩定缺失ERα雌激素受體表達的A2780-αKD細胞和穩定缺失ERβ雌激素受體表達的A2780-βKD細胞(圖2D)。對2780，A2780-αKD 和A2780-βKD細胞用100 nM雌激素處理24 h后檢測MALAT-1表達，發現只有A2780-βKD細胞中其表達水平未受影響(圖2E)。

2.3 雌激素在轉錄水平調控MALAT-1的表達為了探索雌激素調控MALAT-1的可能的機制，100 ng/ml的放線菌素D和E2被分別加入A2780細胞，24 h后檢測MALAT-1 RNA水平，發現MALAT-1的表達都下調了(圖3a)，推測雌激素是在轉錄調控MALAT-1，因為MALAT-1的半衰期沒有縮短。為檢測雌激素對MALAT-1的調控是否是可逆，在雌激素處理24 h后，更換培養基，檢測RNA水平發現恢復到處理前(圖3b)，劃痕實驗也顯示，在去除雌激素后，A2780細胞的遷移能力也恢復了(圖3c)。綜上所述，雌激素在轉錄水平調控MALAT-1表達，其對MALAT-1的轉錄調控是可逆的。

3 討論

過去四十年，應用激素治療上皮卵巢癌并無重大進展，各種研究結論不盡相同[11，12]，直到最近，通過確定與預后相關的標志物對上皮性卵巢癌激素治療的人群進行研究，才為雌激素替代治療提供了新的依據，將雌激素受體作為治療靶點[5，13，14]，因此雌激素替代治療對卵巢癌的治療十分重要[4]。盡管雌激素受體的陽性表達率在上皮性卵巢癌中占到了67%[15]，但是針對雌激素的治療目前取得的進展很少，雌激素及其受體的治療效果和治療價值也沒有系統性研究[4]。此外，由于研究的樣本量較小，卵巢癌病理類型的不同，卵巢癌細胞激素受體表達情況的復雜性和評估效果的生物標志物的不統一，目前并無一致的定論[11]。因此，本課題從細胞模型入手，發現雌激素對卵巢癌細胞具有劑量效應，在低劑量下，不能抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移，在高劑量下，能抑制卵巢癌細胞的增殖和遷移。這種劑量效應提示了在雌激素替代治療中，要加強對患者體內雌激素表達水平的檢測，及時根據患者體內雌激素表達的水平調整雌激素補給量。

圖2 雌激素通過雌激素受體ERα下調MALAT-1 a.A2780細胞下調MALAT-1后細胞增殖曲線，其中Scramble為非特異性shRNA，和PBS均為陰性對照；b.A2780細胞下調MALAT-1后劃痕恢復情況；c.100 nM雌激素處理A2780 24 h后MALAT-1的表達水平，其中18 s rRNA為不相干對照；d.在A2780、A2780-αKD和A2780-βKD中檢測ERα和ERβ的表達水平；e.在A2780、A2780-αKD和A2780-βKD中檢測MALAT-1的表達水平。

圖3 雌激素可逆性的調控MALAT-1的轉錄 a.放線菌素D(ACD)處理后，MALAT-1的表達水平；b.雌激素去除后MALAT-1的表達水平；c.雌激素去除后，A2780細胞的劃痕恢復情況

目前的研究顯示MALAT-1在促進腫瘤轉移中發揮重要作用，其下游基因涉及細胞粘附、細胞遷移和侵襲、能量代謝、細胞周期和細胞增殖多個不同的層次[8]，但目前對MALAT-1的上游調控元件的研究幾乎沒有。MALAT-1在腫瘤進程中上調的機制目前還不清楚，對影響MALAT-1上調的因素目前也沒什么相關報道。本課題的研究結果提示高濃度17β通過ERα下調MALAT-1，ERα是MALAT-1上游調控元件之一，為卵巢癌及其他受MALAT-1上調而發生轉移的腫瘤提供了新的治療靶位點和新的干預手段。

此外，這種作用是依賴雌激素受體ERα的，提示ERα可作為一個潛在的指標用于檢測卵巢癌的預后和復發。其中，當ERβ受體被敲除后，雌激素處理使得MALAT-1的下調更多，可能是雌激素受體間存在競爭性關系，當ERβ被敲除后，ERα受體發揮的調控作用獲得加強，MALAT-1的轉錄被抑制得更多?？傊?，在后續的研究中，我們將收集卵巢癌樣本，對卵巢癌進行更仔細的病理劃分，探索ERα作為卵巢癌預后的生物標志物的可行性。