藥用植物內生菌的多樣性及其活性代謝產物功能研究進展

黃 磊 高燕燕 許才萬 曾亞軍*

(1 貴州省林業科學研究院 貴陽 550005；2 貴州大學生命科學學院 貴陽 550025)

近年來，受國內外研究者的持續關注，植物內生菌已成為多個領域研究中的熱點，它存在于植物的健康組織內并與宿主互惠共生、協同進化，是一類形態種類各異的微生物類群。然而由于研究者的研究角度不同，對植物內生菌定義的概念也有所不同。國際上對植物內生菌的界定，尚有不同的意見，De Bary于1866年的定義是：生活在植物體組織內的所有生物體，包括內生真菌、內生細菌和放線菌等微生物，用于區別生活在植物組織表面的表生物(Epiphyte)[1]，Bacon于1988年、Petrini于1991年將其定義為：只要來自外表健康的植物體內的真菌或細菌即內生菌[2～3]，國際植物病理學會于1998年對其定義：在植物體內完成其生活史的部分或全部,但又不引起任何病癥的微生物[4]，這次的定義已經著重關注內生菌在宿主體內的生活史。目前，業界普遍認為植物內生菌(Endophytes)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物不同組織和器官的內生真菌或細菌，被感染的宿主植物不表現出外在癥狀[5]。

植物內生菌在植物生命過程中有著著重要的作用，自Vogl于1898年成功從黑麥草(Loliumtumelentum)的種子中分離得到第一株內生真菌以來[6]，已有越來越多的科研工作者從不同植物中分離得到不同種類的植物內生菌。多年來，不同研究領域的眾多研究成果既豐富了內生菌種類，也加深了我們對內生菌的認識。植物內生菌作為一種重要的微生物資源，是新型天然活性物質的重要來源之一，不但可以產生萜類、黃酮類、內酯類、酚類、多肽類等與宿主植物相類似的生物活性物質[7～8]；而且對植物生長發育、次生代謝、應對生物脅迫等方面也具有重要作用[9]。目前已有數百種植物內生菌的相關研究，本文主要回顧國內外部分藥用植物內生菌的多樣性及其活性代謝產物的應用研究。

1 植物內生菌的多樣性

1.1 內生菌在植物中分布的多樣性

植物內生菌在植物中的分布具有多樣性，它分布于大部分植物組織中，尤以植物表皮下的組織中居多，近幾十年來，已從不同植物的莖、種子、胚珠、胚根、葉及其它植物儲藏器官內分離得到大量內生菌，從針葉植物、草本植物、栽培植物、蕨類植物的樹皮、枝葉、根、原球莖中均成功分離得到內生菌[10～11]，可見植物內生菌的分布部位趨于多樣化。柴曉蕾等[12]以海南特有藥用植物華石斛野生植株為材料，從其根、莖、葉中分離獲得不同種屬內生菌，發現葉中分離的菌株數最多，有些類群具有一定的組織偏好性。

一般而言，在植物生長的不同階段，其內生菌種類也具有差異，因此分離內生菌時可根據試驗目的選擇不同生長時期的植物。如蘭科具有較高的觀賞和藥用價值，雖然從成年植物根、莖、葉中能夠分離得到多種內生菌，但從中分離得到的內生菌常常不能促進種子萌發，許多科研人員正嘗試從原球莖中分離促進種子萌發的內生菌。

1.2 植物內生菌種類的多樣性

植物內生菌種類繁多，并在各種陸生、水生低等植物和高等植物中廣泛分布，種類主要包括內生真菌、細菌和放線菌[13～14]。研究表明，植物內生菌種類和分布在不同地域、不同宿主植物、不同組織部位中具有較大差異。篩選分離植物內生菌步驟基本分為：消毒、清洗、接種、培養、分離。其中，消毒可以考慮使用醫用酒精、雙氧水、適當濃度次氯酸鈉等表面消毒劑對其組織進行消毒；隨后用無菌水沖洗組織表面；消毒徹底后接種于平板中；根據不同的內生菌種類選擇適宜條件進行培養；根據條件按不同菌落進行分離。

1.2.1 植物內生細菌存在多樣性

內生細菌種類具有多樣性，分離普遍采用牛肉膏蛋白胨培養基。自20世紀中葉起，國外就已經在多種植物中分離得到不同種屬的內生細菌。我國在植物內生菌領域研究雖然起步較晚，但也有研究者從番茄、棉花、富貴竹、辣椒、哈密瓜、馬尾松、煙草等不同植物中分離得到多種內生細菌，包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)及短小桿菌屬(Cutrobacterium)等不同菌屬，其中芽孢桿菌屬的菌株在多種植物中均有發現[15]。研究人員統計發現，植物內生細菌在根部及種子中的含量相對高，在莖和葉中相對較少。

曾慶桂等[16]對珍貴藥用蕨類植物蛇足石杉(Huperzia serrate)內生菌進行了研究，篩選得到一株能夠拮抗小麥赤霉等植物病害真菌的內生細菌，結合形態學、生理生化以及16S rDNA分子鑒定，初步鑒定為屬伯克霍爾德屬，與常用的生防菌洋蔥伯克霍爾德菌親緣關系較遠，將其命名為Burkholderiasp.H-6。方曉梅等[17]采用不同培養基從蜘蛛抱蛋屬植物中分離得到156株內生細菌，結合16S rRNA進行進化樹分析顯示分屬于3門10目22科29屬，且23.7%的細菌具有抑菌活性。

1.2.2 植物內生真菌存在多樣性

內生真菌種類具有多樣性，分離多采用馬鈴薯固體培養基。大多數植物內生真菌屬于子囊菌(Ascomycetes)、盤菌綱(Discomyetes)和腔菌綱(Loculoascomyete)的部分屬種以及一些近源菌。目前已報道的藥用植物內生真菌主要包括鐮刀菌屬、交鏈菌屬、青霉屬、根霉屬、芽枝霉屬、毛殼菌屬等，其種類十分豐富。據不完全統計，已在80多個屬的幾百種禾本科植物中發現了內生真菌[18]。

植物內生真菌能夠產生酚、萜類、黃酮類等代謝產物，表現為抗腫瘤、抗氧化等不同生物活性。Min Q等[19]從銀杏中分離出的兩種內生真菌能夠產生酚類和黃酮類化合物，通過形態學分析判斷這兩株真菌都屬于曲霉屬，進一步采用分子手段對ITS1-5.8SITS2區域的分析鑒定了這兩株菌分別為Aspergillusnidulans和Aspergillusoryzae。華梅等[7]采用組織塊分離法從白木香(Aquilariasinensis(Lour.) Gilg.)莖稈及葉片中分離獲得對常見致病細菌具有明顯抑制活性的10株內生真菌，其中A. rasikravindrii，Diaporthesp.,P. amygdali,Phomopsissp.,P. macrospinosa這5株是首次從該物種中分離得到。將傳統的微生物鑒定方法與分子生物學手段相結合，能夠大大提高微生物鑒定的可靠性，部分未知的新種也能夠被成功鑒定，為生物資源的多樣性補充新的種類。

1.2.3 植物內生放線菌存在多樣性

內生放線菌種類具有多樣性，分離多采用丙酸鈉、琥珀酸鈉等培養基。植物內生放線菌中研究較多的是非弗蘭克氏菌屬的內生固氮放線菌，其余絕大多數為鏈霉菌屬(Streptomyces)，其次是小雙胞菌屬(Microbispora)、小單孢菌屬(Micromonospora)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、鏈孢囊菌屬(Streptosporangium)。Uvidello F.Casitillo等[20]從巴塔哥尼亞南部的假山毛櫸和其他植物中分離出的內生放線菌經16S rRNA序列分析鑒定，發現這些放線菌與GenBank中報道的其他放線菌具有明顯差異，這證明了植物體內存在大量的不同的內生放線菌。

2 植物內生菌活性代謝產物及其功能

2.1 內生菌活性代謝產物種類

植物內生菌活性代謝產物種類豐富，主要有萜類、生物堿、皂苷類、芳香類、多肽類等，其中很多代謝產物對人類疾病有很好的療效，另外內生菌在植物資源保護的開發與應用也具有重要作用，尤其有助于蘭科等珍稀瀕危物種的保護與開發利用。

表1 文獻已報道的內生菌部分活性代謝產物

2.2 內生菌活性代謝產物的應用

內生菌活性代謝產物具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗蟲等活性，在醫藥、農藥、育種等領域有巨大的實用價值和廣闊的應用前景。

2.2.1 抗腫瘤類活性物質

藥用植物內生菌的活性代謝產物種類繁多，具有抗腫瘤作用主要包含萜類化合物(紫杉醇、紫杉烷等)、生物堿類化合物(長春新堿、細胞松弛素等)、苯丙素類化合物、黃酮類化合物等多種活性物質。紫杉醇屬于萜類化合物，以極低含量存在于不同紫杉醇屬植物樹皮和樹葉中，作為天然抗癌藥物之一，對卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、直腸癌等均有療效。方美娟等[21]通過X線單晶衍射、薄層色譜掃描(TLC)和核磁共振等方法確認南方紅豆杉、榧樹和杉木內生菌的代謝產物中含有BFA活性成分，并具有良好的抗腫瘤效果。李俊峰等[22]采用乙酸乙酯提取檢測鐵皮石斛內生菌TG2代謝產物，經MTT法檢測發現其代謝產物對腫瘤具有良好抑制效果。

長春堿(Vinblastine)為生物堿，最初從夾竹桃科植物長春花中提取，對治療白血病有明顯作用?，F已發現從長春花組織中分離出的內生菌也能產生長春堿及其衍生物。張玲琪等[23]通過薄層色譜掃描法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)證明長春花的內生真菌尖鐮孢(Fusariumoxysporum)可以產生該類物質，大大減少了使用局限性。直接從植物種提取活性物質，不僅量少且成本高，若能直接從內生菌中提取與宿主具有相似活性的物質，能夠大大提高實用價值減少研發成本。

2.2.2 抗菌類活性物質

植物內生菌的活性代謝產物功能多樣化，對人類感染的細菌和真菌具有拮抗作用，從天然產物中獲得抗菌物質一直以來都是研究熱點。早期由于技術局限，大多數時候只能通過傳統方法分離得到一些代謝產物，進行簡單的結構分析及理化性質檢測。目前已能夠采用先進的分子生物學技術對內生菌產生的活性物質進行結構分析，為更深入的揭示物質結構及功能分析提供基礎。王偉等[24]從核桃的根、莖、葉、果中分離出的內生真菌能夠產生多種具有拮抗活性和化感作用的次生代謝產物，可以作為上述活性物質的篩選材料。另外，一些新的抗菌素也已從植物內生菌中篩選分離出，如抗菌素Fistupyrone、三萜糖苷類抗菌素等。

2.2.3 抗氧化類物質

抗氧化作用也是部分植物內生菌的重要生物活性之一，如杜仲內生真菌Chaetomellasp.產生的黃酮類物質，植物類彎胞屬內生真菌產生的苯并吡喃以及九里香正青霉屬內生真菌的生物堿類物質Spiroquinazoline alkaloid等都具有明顯的抗氧化的作用[25]。

2.2.4 抗病毒類活性物質

樊兵，吳云峰[26～27]等從獨活、紅藻、天竺葵等植物中分離出的部分內生菌對煙草花葉病毒具有較好的抑制作用。由于病毒是農作物、經濟作物的主要病害，用化學藥物噴施防治會給生態環境造成較大危害，科研人員已發現部分內生菌代謝產物具有抗病毒活性，所以開發更多的微生物代謝產物來防治植物病毒害是一種有效途徑。

2.2.5 促進植物生長發育

植株感染內生菌的影響可以在其生長發育方面表現出來，內生菌對植物的幼苗生長、種子萌發具有較好的促進作用[28～29]。主要在種子萌發、分蘗生長、幼苗存活、植株的高重和生長勢、生物累積等多方面出現差異性[30]。植物內生菌對其生長發育的影響主要通過以下四方面作用：

①產生植物生長素、赤霉素以及細胞分裂素等代謝產物促進植物生長。

②從周圍環境中吸收或真菌菌絲消化釋放C、N、P等營養物質滿足植物生長需要，直接促進植物的生長。

③通過與病原菌競爭營養、空間，或直接產生一些拮抗物質抑制病原菌生長，間接促進植物生長[31]。如膠膜菌屬、假單胞菌屬、蠟核菌屬等都能產生吲哚乙酸或赤霉素，還有部分內生菌不僅能產生吲哚乙酸，而且還能產生細胞分裂素(如草生歐文氏菌)，這些物質都能有效促進植物的生長[32]。

④通過改變根部周圍的環境來緩解非生物壓力，如分泌胞外多糖來改變土壤結構，改變生長環境的pH值 從而增加植物根部對環境的適應性，促進植物生長[33]。史應武等[34]發現從甜菜根部分離的1株內生菌能顯著增加甜菜鮮重、葉綠素含量及含糖率，有明顯的促生、增糖作用。

2.2.6 固氮作用

Chen等[35]用來自棉花的內生細菌回接棉花，可以減輕人工接種感染的棉花枯萎癥狀?？蒲腥藛T很早就提出了豆科植物-根瘤菌共生固氮體系，而內生菌與非豆科植物的固氮作用是在Dobereiner等[36]于1975年從甘蔗分離出內生固氮螺菌、并提出聯合固氮概念后才開始引起關注。

2.2.7 增強植物抗逆性

植物感染內生菌與否，對植物的抗逆性表現不同，內生菌可以增強植株對逆境的適應性。例如：

①在非生物脅迫方面，感染內生菌的植物對環境脅迫如干旱、鹽堿具有更強的抗性。鹽生植物濱麥[Leymusmollis(Trin.) Hara]能夠與黃色鐮刀菌共生，而鐮刀菌能夠協助宿主抵抗高鹽環境，使濱麥具有耐高鹽環境的特性[37～38]。Cui JL等[39]篩選出的內生菌在低海拔環境下能夠保證紅景天正常發育并提高其天苷和酪醇的產量。

②在生物脅迫方面，感染內生菌的植株可阻止其他昆蟲和食草動物的采食、抗病毒蟲害?？蒲腥藛T從植物中分離出的內生菌制成菌劑，注入同種植物或不同種類植物中，能夠很好的抵抗病蟲害。

2.2.8 作為生防因子應用

植物內生菌可以作為生防因子，由此思路可以開發出一些植物生防菌劑。

3 結論及展望

近年來，醫學、中藥學、生態學、微生物學、植物病理學的專家學者對植物內生菌的相關研究已越來越關注。其活性代謝產物種類繁多、結構新穎、作用方式多樣，是一條尋找更多新的生物活性物質的有效途徑；同時也為天然藥物的開發和應用提供了便利。由于藥用植物內生菌產生的活性代謝產物具有不同的藥用功能，可以考慮結合基因工程、蛋白質工程、生物化學與分子生物學等技術手段培養可以產特異性活性代謝產物的菌株，大量生產并制備具有治療效果的微生物代謝產物，這樣可以極大的提高內生菌的利用利率，降低生產成本，但是如何找到適宜的技術體系是個難題。

由于植物種類多種多樣，存在于其組織內的內生菌自然也極其豐富，這是一個珍貴和極具開發潛力的微生物資源寶庫。但植物內生菌在植物體內分布存在種屬特異性、組織偏好性、地區差異性等多方面因素，因此對這一天然微生物資源的開發和利用尚有很多不足之處，目前已開發的資源還較少，合理開發利用植物內生菌資源，尋找新的活性物質，在今后的研究中將更受關注。當然，在植物內生菌資源的開發利用方面還有很大的提升空間，如何精準、簡單、高效的分離內生菌是一個亟待解決的問題。一般情況下，植物內生菌次級代謝產物含量較少且分離純化困難，有時難以完成結果鑒定和活性測定的所有流程，因此，尋找可靠、有效的方法提高獲得內生菌次級代謝產物含量是目前迫切需要解決的問題之一。

此外，由于大多數植物都需要與內生菌共生，但在共生過程中，內生菌究竟發揮什么作用、以何種方式發揮作用，一直是困擾學術界的大問題，這就是宿主-微生物之間的互作關系。更好的了解宿主-微生物間的共生機制，深入研究植物內生菌與宿主之間的互作關系必然引起越來越多科研人員的興趣，從而成為今后的熱點問題。