流感病毒NS1蛋白與宿主蛋白DOK6的相互作用研究

黃山雨，梁立濱，李俊平，王 倩，趙青青，周陳陳，趙玉輝，王廣文，李奇兵，孔凡迪，李呈軍，陳化蘭，姜 麗

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)屬于正黏病毒科，流感病毒屬。AIV 基因組由8 個分節段的單股負鏈 RNA 組成，分別是 PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M 和NS。其中NS1 由最小的片段NS 編碼，是AIV 重要的非結構蛋白。NS1 的主要作用是抑制干擾素產生，抑制宿主基因的表達。目前已經報道的與NS1 相互作用的蛋白有 PKR[1]、RIG-I[2]、 CPSF30[3]、 TRIM25[4]和 IKK[5]等，且大多均是宿主體內與抗病毒功能相關的蛋白。同時NS1具有雙鏈RNA 結合結構域，可以阻止雙鏈RNA 對模式識別受體RIG-I 的激活[6]。宿主因子停泊蛋白6(Docking protein 6，DOK6)屬于DOK 家族發現較晚的蛋白，目前對其分子功能知之甚少，尚無DOK6與流感病毒相互作用的報道。本實驗通過免疫共沉淀結合質譜分析的方式篩選出能夠與NS1 蛋白相互作用的DOK6 蛋白，旨在揭示NS1 蛋白與DOK6 蛋白的相互作用，為深入研究流感病毒在宿主體內的復制機制提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 細胞系、質粒和病毒 HEK293T 細胞、A549細胞由本實驗室保存、pCAGGS 真核表達載體由Yoshihiro Kawaoka 教授惠贈；pCAGGS-V5、pCAGGSFlag 真核表達載體由本實驗室基于pCAGGS 改造構建，雙分子熒光互補(BiFC)真核表達載體pCAGGSVN、pCAGGS-VC 由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所華榮虹副研究員惠贈[7](由pCAGGS 載體改造，分別插有熒光分子Venus 的N 端和C 端，分割點為Venus分子第173位氨基酸)，pCAGGS-Flag-NS1、pCAGGS-V5-NS1 和pHH21-WSN-NS1 由本實驗室構建，流感病毒A/WSN/1933(H1N1)由本實驗室保存。

1.2 抗體及主要試劑 鼠抗Flag 單克隆抗體(MAb)、兔抗Flag 多克隆抗體、兔抗V5 多克隆抗體、Anti-Flag M2 親和瓊脂糖珠購自Sigma 公司；兔抗 NS1 多克隆抗體購自 Genetex 公司，鼠抗β-actin MAb 購自 Santa Cruz 公司。Dylight 800 標記的山羊抗鼠IgG (H+L)、DyLight 800 標記的山羊抗兔IgG (H+L)購自KPL 公司；Alexa Fluor 488 結合的山羊抗兔 IgG、Alexa Fluor 633 結合的山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488 結合的山羊抗鼠 IgG、Alexa Fluor 633 結合的山羊抗鼠 IgG、Hoechst 33342 均購自Thermo Fisher Scientific 公司；RNA 提取試劑盒、質粒中提試劑盒、膠回收試劑盒均購自Qiagen 公司；質粒小提試劑盒、DNA 純化試劑盒均購自Axygen 公司；DMEM 培養基、Opti-MEM 培養基、F-12K 培養基、轉染試劑Lipofectamine LTX 均購自Invitrogen 公司；胎牛血清(FBS)購自Biological Industries公司；TransIT-X2 Transfection Reagent購自Mirus公司；Q5 高保真PCR 酶，各種限制性內切酶均購自NEB公司；DL5000 DNA Marker、同源重組酶均購自Vazyme公司；細胞裂解液NP40、蛋白酶抑制劑(PMSF)均購自碧云天生物公司。

1.3 重組質粒的構建與鑒定 根據DOK6 參考序列(gene ID：220164)、A/WSN/1933(H1N1)流感病毒NS1蛋白參考序列(LC333189.1)設計引物。提取A549 細胞RNA，反轉錄獲得cDNA，以其為模板，采用引物DOK6-F-pCAGGS/DOK6-R-pCAGGS，擴增DOK6 基因片段。將 pCAGGS-Flag 與 pCAGGS-V5經KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后，與上述擴增的DOK6基因片段同源重組構建pCAGGS-Flag-DOK6 與pCAGGS-V5-DOK6 真核表達質粒。利用構建的pCAGGS-Flag-DOK6 質粒為模板，采用引物DOK6-F-BiFC/DOK6-R-BiFC 擴增DOK6 基因全長片段，采用引物 DOK6-F-BiFC/DOK6-R339-BiFC PCR 擴增DOK6 的 Pleckstrin 同源結構域(Pleckstrin homology domain，PH) (aa1 ～aa113)基因片段，采用引物DOK6-F391-BiFC/DOK6-R714-BiFC PCR 擴增 DOK6的PTB 結構域(aa131～aa238)基因片段，采用引物DOK6-F-BiFC/DOK6-R714-BiFC PCR擴增DOK6結構域 PH+PTB (aa1～aa238)基因片段，采用引物DOK6-F391-BiFC/DOK6-R-BiFC PCR擴增DOK6結構域 PTB+C-Terminal (aa131 ～aa331)基因片段(圖1)。將以上擴增片段，與經SacⅠ/XhoⅠ酶切的pCAGGS-VN 與pCAGGS-VC 載體同源重組，分別構建重組質粒：pCAGGS-DOK6-VN、pCAGGS-DOK6-VC、pCAGGS-PH-VC、pCAGGS-PTB-VC、pCAGGS-(PH+PTB)-VC、pCAGGS-(PTB+C-Ter)-VC。以 pHH21-WSN-NS1 質粒為模板，采用引物NS1-F-BiFC/NS1-R-BiFC PCR 擴增NS1 全長基因片段，按照上述方法構建重組質粒pCAGGS-NS1-VN、pCAGGSNS1-VC。所有重組質粒均利用pCAGGS 上下游通用引物PCR 鑒定，并通過測序進一步鑒定。上述引物具體信息見表1。

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1.4 DOK6 與NS1 相互作用的免疫共沉淀(Co-IP)試驗 采用 Lipofectamine LTX 將 pCAGGS-Flag-NS1+pCAGGS-V5-DOK6 共轉染至6 孔板中密度為80 %的293T 細胞，同時分別轉染pCAGGS-Flag-NS1+pCAGGS 和 pCAGGS-V5-DOK6+pCAGGS 作 為對照，每種質粒各1 g。轉染48 h 后，按200 μL/孔加入NP40 (含PMSF)，裂解細胞30 min，離心，收集上清全細胞裂解液(Whole cell lysates，WCL)，取20 μL 作為對照 ，剩余的樣品加入20 μL Anti-Flag M2 親和瓊脂糖珠過夜結合。結合后瓊脂糖珠經預冷PBS 洗滌5 次，最后加30 μL 2×蛋白上樣緩沖液重懸，煮沸變性5min，作為Co-IP 樣品。WCL樣品和Co-IP 樣品經SDS-PAGE 電泳，轉印至NC膜，分別用兔抗V5 多克隆抗體(1∶1 000)和兔抗Flag多克隆抗體(1∶1 000)作為一抗，用DyLight 800 標記的山羊抗兔 IgG (H+L) (1 ∶10 000)作為二抗， 經western blot 檢測轉染蛋白表達與免疫共沉淀結果。

1.5 DOK6 與NS1 相互作用的的激光共聚焦試驗將A549 細胞傳代至激光共聚焦培養皿中，并于次日利用Mirus TransIT-X2，共轉染pCAGGS-V5-NS1+pCAGGS-Flag-DOK6 至A549 細胞，同時分別轉染質粒 pCAGGS-V5-NS1+pCAGGS 和 pCAGGS-Flag-DOK6+pCAGGS 作為對照，每種質粒各1 g。36 h后，使用4 %多聚甲醛常溫固定細胞30 min 或4 ℃過夜，PBS 洗滌，0.1%Triton X-100 常溫通透15 min，PBS 洗滌，最后使用5 %脫脂乳封閉1 h。以鼠抗Flag MAb (1∶200)和兔抗 V5 多克隆抗體(1∶200)為一抗，Alexa Fluor 488 結合的山羊抗兔 IgG (1∶500)和Alexa Fluor 633 結合的山羊抗鼠 IgG (1∶500)為二抗，DAPI 染核后經激光共聚焦顯微鏡觀察DOK6 蛋白與NS1 蛋白的亞細胞定位情況。

1.6 DOK6 與NS1 相互作用的雙分子熒光互補試驗(BiFC) 待96 孔板中的293T 細胞密度接近70 %時，分別共轉染pCAGGS-DOK6-VN+pCAGGS-NS1-VC 與 pCAGGS-DOK6-VC+pCAGGS-NS1-VN，每種質粒各轉染100 ng，同時共轉染pCAGGS-NA-VC+pCAGGS-DOK6-VN 作為陰性對照， 共轉染pCAGGS-SPCS1-VN+pCAGGS-JEV-NS2B-VC[7]作為陽性對照。36 h 后，棄培養液，加入4 %多聚甲醛4 ℃過夜固定。第2 d 棄固定液，加入 100 μL Hoechst 33342，常溫核染4 h 后，將96 孔板移至高內涵細胞篩選系統進行熒光信號的檢測。為了確認NS1 與DOK6 相互作用精確的結構域，用同樣的方法將pCAGGS-PH-VC、pCAGGS-PTB-VC、pCAGGS-(PH+PTB)-VC、 pCAGGS- (PTB+C-Ter)-VC分別與pCAGGS-NS1-VN共轉染293T細胞，共轉染pCAGGS-SPCS1-VN+pCAGGS-JEV-NS2B-VC[7]作為陽性對照。使用高內涵細胞篩選系統進行熒光信號的檢測。

2 結 果

2.1 重組質粒的鑒定結果 利用pCAGGS 載體上下游通用引物對所構建的載體pCAGGS-Flag-DOK6、pCAGGS-V5-DOK6、pCAGGS-DOK6-VN、pCAGGSDOK6-VC、 pCAGGS-NS1-VN、 pCAGGS-NS1-VC、pCAGGS-PH-VC、 pCAGGS-PTB-VC、 pCAGGS-(PH+PTB)-VC、pCAGGS-(PTB+C-Ter)-VC 分別經PCR鑒定，結果顯示，插入基因序列大小均與預期一致，從左到右分別為1 053 bp、1 071 bp、1 545 bp、1 224 bp、1 239 bp、918 bp、567 bp、552 bp、942 bp、831 bp (圖2)，進一步通過測序鑒定各基因序列完全正確。表明正確構建以上各表達載體。

2.2 DOK6 與 NS1 相互作用的 Co-IP 驗證結果將 pCAGGS-V5-DOK6+pCAGGS-Flag-NS1共轉染HEK293T 細胞，同時以pCAGGS-V5-DOK6+pCAGGS和 pCAGGS-Flag-NS1+pCAGGS 為陰性對照，利用Co-IP 檢測DOK6 蛋白與NS1 蛋白的互作。結果顯示，WCL 中，在 26 ku (NS1 蛋白)和 38 ku (DOK6)處有特異性條帶。利用抗Flag 瓊脂糖珠沉淀NS1 蛋白后用兔抗Flag 多克隆抗體和兔抗V5 多克隆抗體檢測NS1 蛋白與DOK6 蛋白結合情況，發現NS1 蛋白均能夠被良好沉淀下來，26 ku (NS1)處有條帶檢出，而且在沉淀NS1 蛋白的同時，DOK6 蛋白同時也被沉淀下來，38 ku (DOK6)處有條帶檢出，而單獨轉染pCAGGS-V5-DOK6+pCAGGS，由于體系無NS1 蛋白表達，DOK6 并沒有被沉淀下來，38 ku 處無特異性條帶； 單獨轉染pCAGGS-Flag-NS1+pCAGGS 也無該 38 ku 特異性條帶(圖3)。表明DOK6 蛋白與NS1 蛋白存在特異的相互作用。

2.3 NS1 與DOK6 細胞內共定位的驗證結果 將pCAGGS-V5-NS1+pCAGGS-Flag-DOK6 共轉染 A549細胞，利用激光共聚焦顯微鏡觀察該兩個蛋白在細胞中的共定位。結果顯示，表達的NS1 蛋白廣泛分布于整個細胞中，表達的DOK6 蛋白主要定位于細胞質中，DOK6 蛋白與NS1 蛋白在細胞質中存在共定位(圖4)。表明NS1 蛋白與DOK6 蛋白主要在細胞質中發生相互作用。

2.4 NS1 與DOK6 相互作用的BiFC 驗證 分別將pCAGGS-DOK6-VN+pCAGGS-NS1-VC 與 pCAGGSDOK6-VC+pCAGGS-NS1-VN 共轉染至293T 細胞后，采用高內涵細胞篩選系統分析熒光強度，藍色熒光為細胞核所發出，金黃色熒光為存在相互作用的兩個分子將Venus 分子的VN 和VC 片段拉近并重新組合后發出，結果顯示DOK6 蛋白與NS1 蛋白共轉染均能檢測到較強金黃色熒光(圖5)，與陽性對照亮度接近，而陰性對照未發出金黃色熒光。表明NS1 蛋白與DOK6 蛋白發生了相互結合，即通過BiFC 試驗證實了NS1 蛋白與DOK6 蛋白存在相互作用。

為了進一步確定DOK6 蛋白與NS1 蛋白互作的結構域，將 pCAGGS-DOK6-VC 及含DOK6 不同區段質粒pCAGGS-PH-VC、pCAGGS-PTB-VC、pCAGGS-(PH+PTB)-VC、 pCAGGS- (PTB+C-Ter)-VC 分 別 與pCAGGS-NS1-VN 共轉染293T 細胞，觀察熒光信號，結果可見NS1 蛋白與DOK6 蛋白的PTB 結構域(aa131～aa238)結合發出的熒光強度明顯高于其與其它區段結合發出的熒光強度(圖6)。表明NS1 蛋白與DOK6 蛋白的PTB 結構域存在明顯的相互作用。另外，結果還顯示，當PH 結構域與PTB 結構域相連時，NS1 蛋白與PTB 結構域的相互作用就會大為削弱，提示PH 結構域可能在PTB 結構域活性調節上起作用。

3 討 論

本實驗室前期工作通過以NS1 蛋白作為誘餌蛋白，利用免疫沉淀結合質譜分析技術篩選到與其互作的宿主因子DOK6。本實驗將pCAGGS-V5-NS1 和pCAGGS-Flag-DOK6 轉染293T 細胞，通過免疫共沉淀實驗驗證了NS1 蛋白與DOK6 蛋白存在相互作用，利用激光共聚焦實驗分析轉染后蛋白的表達及定位表明這兩個蛋白在細胞質中存在明顯共定位，通過BiFC 進一步證明了DOK6 蛋白的PTB 結構域與NS1 蛋白存在相互作用。實驗結果為進一步研究DOK6 蛋白與NS1 蛋白相互作用機制奠定了基礎，完善了病毒NS1 蛋白與宿主蛋白相互作用的網絡。

DOK6 屬于 DOK 家族成員，目前已經發現DOK1、DOK2、DOK3、DOK4、DOK5、DOK6 和DOK7 共7 個成員，它們均有N 端PH 結構域、中間PTB 結構域和一個多元化的C 端結構域。目前對DOK6 的研究很少，已知DOK6 能夠參與RET 通路促進早期胚胎神經細胞的發育[8]，還有學者證明了DOK6 蛋白能夠與TrK 受體成員中TrkC 發生相互作用，相互作用區域為DOK6 蛋白的PTB 結構域，該相互作用依賴酪氨酸磷酸化[9]。最近有研究表明DOK6 的下調會導致多種信號因子(包括多種MAPK通路的分子)的表達量減少[10]。本實驗通過免疫共沉淀、激光共聚焦、BiFC，發現了NS1 與DOK6 分子的PTB 結構域存在明顯的互作，結果還顯示DOK6蛋白的PH 結構域對DOK6 蛋白與NS1 的相互作用具有削弱作用，可能原因是DOK6 蛋白在未激活狀態下，其PH 結構域對PTB 結構域有遮掩作用，需要其它因子的激活使PH 結構域發生構象變化，PTB 結構域才能得以暴露并與NS1 發生相互作用。DOK6 作為一個接頭蛋白，其PTB 結構域發生酪氨酸磷酸化后能夠結合一些信號分子，研究表明PTB結構域的酪氨酸磷酸化對信號的轉導非常關鍵[9]，那么NS1 結合在該部位是否會阻礙這些下游信號的傳遞，還有待探究。雖然報道表明DOK6 可能參與MAPK 通路的激活[10]，但這個過程是否與PTB 結構域有關，目前尚無相關報道。有關DOK6 與NS1 相互作用的分子作用機制有待深入的研究。