氣腫疽NanA基因真核表達質粒的構建與鑒定

馬玉騰， 羅永仁， 姜永越， 于成東， 張 皓， 金 鑫*

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133000；2.琿春邊境經濟合作區綜合服務站，吉林 琿春 133315；3.圖們市農業農村局畜牧管理總站，吉林 圖們 133000；4.敦化市民政局，吉林 敦化 133700)

氣腫疽(Clostridium chauvoei) 是一種主要侵襲于反芻動物的急熱性、敗血性傳染病，形狀為呈梭狀或湯勺狀的革蘭氏染色陽性桿菌[1]，動物感染后主要表現為暴發性肌壞死，通常會在短時間內死亡，由于死亡率極高，為畜牧業生產帶來了重大損失[2-3]。其致病因子為氣腫疽梭菌，在全球范圍內廣泛傳播，發病迅速，死亡率高[4-5]。該病的傳染源主要是病畜，傳遞途徑是土壤。當動物采食或口鼻接觸土壤時，芽孢能夠通過呼吸道或消化道進入組織，同時體內的厭氧條件能夠促進芽孢萌發、繁殖和外毒素的產生[6-7]。動物采食被這種土壤污染的飼料和飲水，經口腔和咽喉創傷侵入組織，也可由松弛或微傷的胃腸粘膜侵入血流而感染全身[8]。一直以來，該病被認為只感染反芻動物，但2007年以來卻出現了該病引發人氣性壞疽和結腸炎而死亡的2例報告[9]，在過去10年中該病迅速成為全球學者的研究熱點。

疫苗的使用是疾病免疫的重要手段，而氣腫疽缺乏經濟有效的治療方法，因此氣腫疽疫苗的研發就尤為重要。傳統疫苗產量小，保護性差，因此核酸疫苗、蛋白質亞單位疫苗等疫苗的研發和推廣具有廣闊的前景[10-11]。在氣腫疽梭菌眾多毒力因子中，氣腫疽梭菌NanA基因具有重要研究價值。本試驗構建了氣腫疽NanA基因的真核表達質粒，以探索真核表達質粒作為核酸疫苗的可能性，為氣腫疽核酸疫苗的研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株及試劑

pMD18-T Simple Vector購于TaKaRa寶生物工程有限公司，pVAX1載體由延邊大學預防獸醫實驗室保存備用，鼠抗氣腫疽梭菌NanA蛋白由延邊大學預防實驗室制備；延邊株氣腫疽梭菌由延邊地區病牛病料采集，分離鑒定并純化后于延邊大學動物醫學系預防實驗室保存[12]；限制性內切酶、Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、T4 DNA連接酶，購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒，均購自OMEGA有限公司；其他試劑均為國產級分析純。

1.2 引物設計與合成

根據NCBI上氣腫疽梭菌JF4135菌株NanA基因序列(GenBank號：FM213082.1)，通過Primer Premier 5.0設計了1對特異性引物用于氣腫疽梭菌真核表達質粒的構建。上游引物添加BamHI 酶切位點及Kozak序列(GCCACCATGGAA)，下游引物添加XhoI酶切位點及終止密碼子，該引物由上海生工生物工程股份有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.3 延邊株氣腫疽梭菌DNA的提取與NanA基因的擴增

使用酚—氯仿抽提法提取延邊株氣腫疽梭菌DNA并分別以F1、F2為引物擴增NanA基因。

PCR反應體系：延邊株氣腫疽梭菌DNA 2.0 μL、dNTP2.0 μL、10×ExTaqBuffer2.5 μL、F1/F2 1.0 μL、ExTaq0.25 μL、dd H2O 16.25 μL，總體系為25 μL。

PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s、61 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min 30 s，35個循環；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀觀察擴增結果。

1.4 氣腫疽梭菌NanA基因的克隆與鑒定

將經PCR擴增的目的片段NanA基因與pMD18-T Simple Vector混合，4 ℃過夜進行連接，將連接產物加入到Trans 5α感受態細胞中混合進行轉化，提取重組質粒pMD 18-T-NanA，以重組質粒pMD 18-T-NanA為模板，利用上述引物進行鑒定。

1.5 重組質粒pVAX1-NanA的構建及鑒定

將pMD 18-T-NanA和pVAX1菌種分別接種于Amp+抗性和Kan+抗性的液體LB中，37 ℃，200 r/min震蕩培養12～16 h。對pMD 18-T-NanA及pVAX1質粒進行提取，將提取質粒用BamHⅠ、XhoⅠ進行雙酶切。將上述純化回收得到的NanA目的基因片段與真核表達質粒pVAX1片段連接轉化至Trans 5α感受態細胞中，提取重組質粒pVAX1-NanA并進行鑒定。將PCR和雙酶切鑒定均為陽性的重組pMD 18-T-NanA質粒送往上海生工生物工程有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 NanA基因的擴增

以F1、F2為引物，純化的氣腫疽梭菌DNA為模板，經PCR擴增得到NanA目的基因片段，大小為1 950 bp，與預期大小相同(圖1)。

M：DL 2 000 DNA Marker；1：水對照；2：NanA基因的PCR擴增產物

2.2 重組質粒pMD 18-T-NanA的PCR及雙酶切鑒定

以F1、F2為引物， pMD 18-T-NanA質粒為模板，進行PCR鑒定，擴增得到1 950 bp大小的目的片段，PCR鑒定結果見圖2。

M：DL 5 000 DNA Marker；1～2：pMD 18-T-NanA PCR鑒定產物

將PCR初步鑒定為陽性的pMD 18-T-NanA質粒，用BamHⅠ、XhoⅠ進行雙酶切鑒定[13-14]，得到了大小分別為2 692 bp和1 950 bp的2條目的片段，表明獲得了大小相符的重組質粒pMD 18-T-NanA，雙酶切的鑒定結果見圖3。

M: DL 5 000 DNA Marker；1～4：pMD 18-T-NanA雙酶切鑒定產物

2.3 重組質粒pVAX1-NanA的PCR及雙酶切鑒定

以F1、F2為引物，以pVAX1-NanA質粒為模板進行PCR鑒定，擴增得到1 950 bp大小的目的片段，PCR鑒定結果見圖4。

M：DL2 000 DNA Marker；1：pVAX1-NanA PCR鑒定產物

將PCR初步鑒定為陽性的重組質粒pVAX1-NanA，用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切鑒定，得到了分別為2 999 bp和1 950 bp大小的2條目的片段，雙酶切的鑒定結果見圖5。

M：DL5 000 DNA Marker；1-5：pVAX1-NanA質粒雙酶切鑒定產物

2.4 NanA基因核苷酸同源性比對

同源性比對分析結果表明：氣腫疽梭菌延邊株NanA基因與NCBI公布的JF4135(GenBank登錄號FM213082.1)菌株序列相比共有3處點核苷酸突變，分別于NanA基因第198位由T突變為C、第778位由A突變為G、第1261位由A突變為G。比對顯示核苷酸序列的同源性均為99.8%(圖6)。

3 討論與結論

氣腫疽在全球范圍內流行，在發達國家和發展中國家分布較廣泛，動物感染后主要表現為暴發性肌壞死，通常會在短時間內死亡，由于死亡率極高，使得該病成為畜牧業經濟損失的重要原因[14-15]。氣腫疽梭菌病原體一般通過芽胞狀態侵入肌體, 在具有一定腐敗物的無氧腸腺內進行出芽繁殖, 可經淋巴與血液循環進行散播, 并在肌肉與肝組織內長期潛伏, 肌體肌肉群受傷或出現變化后, 就為病原體的繁育提供較合適的條件[16]。我國最早的氣腫疽疫苗以帶有病原體的組織液為材料制作活性疫苗，但活性疫苗可能無法提供對抗該病的最佳免疫反應即細胞免疫，目前國內使用最廣泛的是氣腫疽滅活疫苗，但很多臨床報告和報道指出該病的發生仍然普遍存在[17]。

氣腫疽其主要毒力基因為細胞毒素CctA、唾液酸酶NanA和透明質酸酶NagI、透明質酸酶NagH等。唾液酸酶又稱為神經氨酸酶，能夠水解寡糖、糖醛酸苷、糖蛋白和糖脂中的末端唾液酸殘基和甘氨酸殘基，從而影響細胞內基質并能夠破壞宿主免疫調節的通路[18]。由于其通過裂解唾液酸而在發病過程中起重要的作用，被認定為一種重要的毒力因子[19-20]。神經氨酸酶由氣腫疽梭菌NanA基因編碼，基因序列全長為2 519 bp，其分子質量為81 kDa，編碼772個氨基酸，其主要功能區在第193～771個氨基酸之間。中央的高變區對于神經氨酸酶的真核疫苗構建是至關重要的，因此該試驗擴增的部分選取了該段的1 950 bp片段。將克隆后測序得到的氣腫疽梭菌NanA基因核苷酸序列與NCBI中發布的JF4135菌株(GenBank登錄號：FM213082.1)序列進行同源性比對，并發現了3處點突變。分別于NanA基因第198位由T突變為C、第778位由A突變為G、第1261位由A突變為G。其核苷酸序列的同源性均為99.8%。該試驗采用pVAX1作為真核表達載體，該載體在腫瘤疾病、循環系統疾病、神經系統疾病、傳染性疾病等的防治方面皆有應用。段雪巖、張永佳以pVAX1為載體，分別構建了真核表達質粒pVAX1-CctA和pVAX1-FliA并在Vero細胞中表達[21-22]，結合該研究結果，綜合分析真核表達質粒pVAX1-CctA和pVAX1-FliA的免疫效果，未來可進一步進行氣腫疽梭菌其他基因真核表達的探究。由于CctA基因能夠參與溶血和細胞毒性作用，FliA基因能夠促進細菌移動從而促進感染過程，NagI能夠影響細胞內基質和組織的正常生理機制，破壞肌肉周圍疏松結締組織，NanA基因能夠影響細胞內基質并破壞宿主免疫調節的通路。針對不同毒力基因的特性與作用，利用多種基因共同誘導個體免疫有較好的研究前景，目前國內已有針對于多種傳染病的多價苗，能夠使個體得到完全的免疫保護作用。

該試驗以氣腫疽NanA基因為基礎，構建了pVAX1-NanA真核表達質粒并進行了鑒定。為氣腫疽梭菌NanA基因的進一步探究提供了依據，為氣腫疽核酸疫苗的研究奠定了基礎。

圖6 NanA基因核苷酸同源性比對