奶酪風味形成的研究進展

李志國，宗學醒，閆清泉，王 樂，李玲玉，劉 豪，邊燕飛

（內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司，內蒙古 呼和浩特 011500）

世界上有1 000多種奶酪，法國約500 種，最早生產奶酪的意大利有300 種。奶酪的顏色、口感和香味各不相同。例如：未成熟切達奶酪風味溫和，隨著熟化風味變得強烈；成熟的切達奶酪風味曾被描述為“牛肉味”或“肉湯味”；高達奶酪為黃油味、堅果味，隨著成熟變為焦糖或奶油糖果的味道，但不強烈；小孔瑞士奶酪為奶油風味，溫和、細膩、略帶甜味[1]。本文通過闡述及歸納奶酪風味的形成過程，為奶酪風味研究提供理論參考。

1 奶酪風味研究進展

奶酪風味理論研究目前為2 個階段：第1階段，最初認為奶酪風味僅由單一的化合物或幾種化合物組合而成；第2階段，20世紀50年代的“組分平衡理論”認為，風味物質的形成是奶酪化合物組分平衡的結果[2]。奶酪風味物質產生的原因是原料乳中的風味化合物及加工處理時乳成分在酶及微生物代謝時產生的代謝物質，包括酸、醇、脂、內酯、醛、酮、酚、醚等多類有機化合物。例如：切達干酪中所含揮發性風味物質已超過100 種，最重要的有乙酸、丁酸、己酸、辛酸、硫化氫、谷氨酸、甲硫醇及羰基化合物以及非揮發性化合物，如多肽、短肽及游離氨基酸[3]。

風味研究的最新技術為H S-S P M E-G C-M SGC-O，即采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術和氣相色譜-嗅覺測量方法（gas chromatography-olfactometry，GC-O）對奶酪風味物質的化學成分進行分析[4]。

2 奶酪風味物質形成機理

奶酪風味物質的形成是一個復雜和多化學反應的過程，不僅有化學反應，還包括菌種內部的生化反應，其過程主要包括4 個經典反應：酪蛋白的酶解、脂肪脂解、乳糖的糖酵解以及檸檬酸代謝[5]。菌種可分為發酵菌種和非發酵菌種，發酵菌種中最主要的產酶菌包括乳酸乳球菌、乳酸桿菌、嗜熱鏈球菌以及明串珠菌。非發酵菌種中，瑞士奶酪中使用丙酸菌，在一些表面熟化奶酪中使用不同好氧菌，如短桿菌、葡萄糖球菌和青霉菌等。關于酶的來源，包括：牛乳中的固有酶，如血纖維蛋白溶酶和脂解酶；牛乳中的添加酶，如凝乳酶；發酵劑產生的酶；微生物產生的酶，如霉菌和表面裂縫中微生物產生的酶以及在細胞死亡或脂解后微生物中釋放的酶。

2.1 原料乳組分和凝乳酶的作用

原料乳的主要成分為水、蛋白質、脂肪、乳糖及礦物質等，其中酪蛋白含量約占總蛋白含量的80%，多組分的混合體系是影響奶酪風味的重要前體物質。凝乳酶是傳統奶酪制造中最主要的蛋白酶，主要來源于胃內產生的一種天冬氨酸蛋白酶，酶解底物主要是生牛乳中的κ-酪蛋白，對β-酪蛋白和αs1-酪蛋白也可發生作用，其易發生斷裂的肽鍵分別為Phe105-Met106、Leu192-Tys193和Phe23-Phe24，它們對底物反應專一性能力的順序為κ-酪蛋白＞β-酪蛋白＞αs1-酪蛋白。在凝乳酶作用下，κ-酪蛋白中Phe105-Met106間的肽鍵最易發生斷裂，αs1-酪蛋白中Phe23-Phe24間的肽鍵最不容易發生斷裂[6]，斷裂位置和程度不同的產物將會作為蛋白酶分解的前體物質。

2.2 蛋白質水解

蛋白質的水解較為復雜，但也是奶酪成熟中最重要的生化反應。由于牛乳中游離氨基酸含量很低，發酵劑菌種在牛乳中生長很大程度上依賴它們的蛋白質水解反應，生成多肽、短肽和氨基酸。奶酪中的蛋白質水解物來源于5 部分：牛乳中天然酶、凝乳酶、發酵劑、二級發酵劑和非發酵劑微生物[7]。

蛋白質酶解的基本機理和順序、大部分熟化奶酪中蛋白質水解的一般過程如下：首先，初始的酪蛋白水解主要是由于牛乳中天然酶類（如血纖維蛋白酶、組織蛋白酶D等）的作用，但水解程度較??；其次，奶酪制作過程中的凝乳酶作用使得酪蛋白于酶切割位點處裂解成縮氨酸、多肽等；最后，大分子、中等大小的縮氨酸（2～50 個氨基酸連接的構造物，表現出不同于蛋白質的活性和機能，一般為蛋白質的一種或蛋白質的短片）在發酵劑和非發酵劑酶的作用下降解為小分子縮氨酸和游離氨基酸[8]。

發酵劑蛋白酶和肽酶的主要作用機理如下：首先，添加的凝乳酶和天然存在于牛乳中的血纖維蛋白酶生成分子質量較大和中等的縮氨酸，其分子質量較大，對奶酪風味產生的影響較??；其次，發酵劑代謝生成的蛋白酶和肽酶作用于縮氨酸，生成短鏈縮氨酸和氨基酸。對于奶酪成熟的關鍵以及蛋白質風味的釋放，需要進一步研究發酵劑如何及何時代謝生成酶類以及酶的種類。目前已經從奶酪成熟期中分離出幾種酶類和肽酶，Detmers等[9]描述了丙氨酸菌ATCC9617的脯氨酸亞基肽酶（proline iminopeptidase，pip），分離了pip基因與核苷酸序列，并在大腸桿菌中表達該基因，將其復制到乳酸鏈球菌的染色體中，證實pip是形成瑞士型奶酪甜味的因素，在奶酪成熟過程中具有去除苦味作用。

非發酵劑酶的作用機理為表面成熟奶酪中的微生物菌群，如霉菌、微球菌和牛棒狀桿菌代謝生成的酶類由外表面向內部不斷裂解奶酪，形成風味。例如：著名的卡芒貝爾（Camembert）奶酪就是利用霉菌進行熟化處理，它的表面覆蓋著一層白色霉菌[10]。發酵過程中，白色霉菌產生的酶將蛋白質分解為氨基酸，由于這種霉菌在無氧條件下無法進行生長繁殖，因此奶酪內部沒有此類霉菌。隨著霉菌繁殖，奶酪也由外向內逐漸成熟、慢慢變軟，直到內部的組織結構變軟后即可食用。

中等大小的縮氨酸分子并不是影響奶酪風味的主要物質，盡管它們存在于一些奶酪（如瑞士奶酪）中，能夠產生肉湯風味。風味物質很多是由短鏈肽、小分子肽以及游離氨基酸形成的。其中游離氨基酸中，芳香族氨基酸和支鏈氨基酸對風味的影響較大。芳香族氨基酸是花香物質和酚香物質，Gao等[11]對乳球乳酪菌NCDO763中芳香轉氨酶的生物化學特性進行分析，發現該酶啟動了亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸的生成，它們都是奶酪風味物質。奶酪成熟過程中還有一些不良風味的產生，如奶酪中存在的苦味肽?？辔缎纬傻臋C理如下：蛋白質水解后，肽鏈中含有的疏水性氨基酸或短肽游離出來，接觸味蕾產生苦味；苦味程度與苦味氨基酸產生的苦味閾值有關，閾值越低，苦味程度越強?？辔峨暮? 個或多個疏水性氨基酸，如亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸等，這些氨基酸一般位于肽鏈末端。組氨酸的閾值為20 mg/100 mL，纈氨酸為150 mg/100 mL，色氨酸為90 mg/100 mL[12]?？辔杜c肽鏈中氨基酸的排列順序有關，在其羧基末端含有芳香族及支鏈氨基酸時，苦味增強。

2.3 氨基酸分解代謝

氨基酸的分解代謝產物較多，包括氨、胺、乙醛、苯酚、吲哚和乙醇，其物質的平衡狀態影響奶酪最終風味，現已確定多數途徑在乳酸鏈球菌中進行[13-14]。氨基酸是奶酪中不同揮發性風味物質重要的前體物質[15-16]，在脫氨酶、脫羧酶、轉氨酶和裂解酶的作用下，它們可以通過不同途徑轉化。例如：氨基酸轉氨形成α-酮酸，其脫羧轉化為乙醛，接著脫氫形成乙醇或羧酸，這類成分多數具有香味且對乳制品的整體風味有益。Cefoperazone奶酪風味由乳酸乳球菌乳脂亞種B78細胞提取物L-蛋氨酸形成，此外，來自細胞中的L-蛋氨酸酶加速了奶酪風味的形成[17]。

支鏈氨基酸和芳香氨基酸的酶解在奶酪風味形成中具有重要作用，它們是奶酪風味物質的前體，如異戊酸（前體為亮氨酸）、異丁酸（纈氨酸）、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛和2-甲基丙醛，是各種不同類型奶酪的風味化合物。支鏈氨基酸和芳香氨基酸被發酵劑乳球菌降解的第1步是轉氨，該反應由支鏈轉氨酶和芳香轉氨酶催化，且需要α-酮酸作為氨基的接受體。芳香氨基酸轉氨酶能轉化芳香氨基酸、亮氨酸和蛋氨酸，而支鏈氨基酸轉氨酶能轉化亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，也可以轉化蛋氨酸、半胱氨酸和苯丙氨酸[18]。

2.4 脂肪酸酶解

脂肪對奶酪風味的形成十分重要。牛乳脂肪是奶酪中的主要脂類，在一些奶酪品種中分解程度較高。如Italian奶酪，其中的脂肪徹底分解為氨基酸，形成風味。對于藍紋奶酪，游離脂肪酸也是第二大主要風味物質甲基酮形成的底物[19]。在Cefoperazone奶酪中添加食品級解脂酶，促進了游離脂肪酸的分解，有助于形成特殊的風味物質。當游離脂肪酸高于正常水平時，將會破壞風味的平衡，奶酪中正常的游離脂肪酸含量為0.3～100.0 mg/L[20]。奶酪中的游離脂肪酸易發生酯化作用，短鏈脂肪酸和甲硫醇生成甲硫酯，賦予奶酪特有的芳香氣味[21]。奶酪中脂肪酸組分與所使用的脂酶（包括微生物脂酶）特異性有關，不同脂酶對鏈長不同的脂肪酸高度專一性有所差別。隨著成熟期變化，不同奶酪中游離脂肪酸含量差距也很大，鮮乳中游離脂肪酸含量約為415 mg/kg，切達干酪中可達1 793 mg/kg，藍紋奶酪中為2 500 mg/kg。

奶酪脂肪酶的來源為生牛乳、凝乳酶、發酵劑和非發酵菌。生牛乳中含有專一性顯著的脂蛋白脂肪酶，可以對甘油單酯、甘油雙酯和甘油三酯的1～3位進行酶解，生成脂肪酸，其中，在1位上分解得到的為甘油三酸酯。

奶酪中游離脂肪酸的代謝步驟：脂肪酶酶解脂肪，生成游離脂肪酸；游離脂肪酸氧化為β-酮酸；β-酮酸去羰基，生成少1 個碳原子的甲基酮；甲基酮在還原劑作用下生成相應甲基醛。甲基酮的濃度和脂解程度直接相關[22]。

內酯和丁酸是游離脂肪酸的代謝產物。內酯是一種環狀酯，是醇酸通過失水進行分子間的酯酸化形成的一種環狀結構。α內酯和β內酯不穩定，在有機物的合成過程中作為中間代謝產物；δ內酯和γ內酯比較穩定，不容易發生分解。內酯具有很強的芳香氣味，雖然這些芳香物質并不是真正的奶酪風味，但與奶酪風味有一定關系[23]。丁酸是Romano和Provolone奶酪中很重要的風味物質，瑞士硬質奶酪的主要脂肪特征風味是丙酸賦予的[24]。

霉菌熟化類型奶酪中，游離脂肪酸氧化降解為甲基酮，這是藍紋奶酪中基本的風味物質。藍紋奶酪的主要特點是制備過程中使用婁地青霉，代謝中產生胞外脂肪酶，繼而產生游離脂肪酸。隨著游離脂肪酸濃度升高、環境pH值變化，婁地青霉可以將脂肪酸轉化為甲基醛，再進一步轉化為甲基酮[25]。

2.5 乳糖酵解

未成熟奶酪，如農家奶酪中，乳糖只限于形成強烈的乳酸風味。在成熟奶酪中，乳糖發酵產生的乳酸不僅有抑菌作用，還可降低奶酪中的氧化還原電位和pH值，這一條件有利于酶促反應的緩慢進行，并產生許多風味化合物。

牛乳中大約98%的乳糖于乳清中被排出，剩下一部分殘留在奶酪凝塊中，乳糖發酵時，風味物質的主要形成途徑是乳酸菌的作用，中間體丙酮酸鹽的一部分也可以在不同酶的作用下轉化成不同的風味物質，如二乙酸、3-羥基-丁酮、乙醛或乙酸，其中一部分化合物可以影響奶酪風味[26]。

發酵劑特性不同，乳糖代謝途徑也有差異。一些發酵劑將乳糖代謝成L-乳糖，半乳糖通過糖酵解途徑分解為D-乳酸和L-乳酸。通過Leloir途徑將半乳糖轉化為谷氨酸-6-磷酸，之后進行分解；葡萄糖通過磷酸酮酶途徑分解為乳酸、甲醇和

不同奶酪中乳酸含量不同，切達干酪為1.5%，瑞士奶酪為1.4%。切達干酪中的乳酸可以被發酵劑或非發酵乳酸菌氧化，通過一系列反應生成乙酸和CO2，這個反應過程與含氧量關系密切。

2.6 檸檬酸代謝

生牛乳中檸檬酸含量并不高，約為0.2%，但它在一些奶酪中的代謝分解會影響奶酪風味。牛乳中大約90%的檸檬酸可溶于水，隨著排乳清過程而排出。引起檸檬酸發酵的微生物主要是腸膜明串珠菌乳脂亞種、腸膜明串珠菌葡聚糖亞種和乳酸乳球菌乳酸亞種雙乙酰突變株，它們在牛乳中的最佳生長溫度為21 ℃[27]。檸檬酸發酵產生的風味來源于多種化合物，包括雙乙酰、丙酸、乙酸和CO2，CO2是荷蘭奶酪形成表面孔眼的主要原因。切達干酪含有質量分數大約為0.2%～0.5%的檸檬酸，它的代謝速率取決于保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌及嗜熱鏈球菌等混合發酵劑因素的影響，切達干酪中二乙酸的含量很高，且這些高含量的二乙酸可以影響奶酪風味[28]。二乙酸可以被轉化為3-羥基丁酮、2,3-丁烯基乙二醇和2-丁酮，而2-丁酮是奶酪風味物質的主要組成成分。

3 結 語

不同奶酪的風味差異較大，原料乳、菌種發酵過程及加工工藝等的不同均會影響最終風味的差別。把握分析奶酪風味成因的基本原理，將幫助研究人員更好地分析研發及質量等問題。目前，隨著氣相儀器準確性的提高，對于風味化合物的常用測定方法為HS-SPME-GCMS-GC-O。然而，尚未見有文獻對不同奶酪的風味化合物與風味種類的關系進行進一步梳理和歸納，這方面仍需要加強研究。