化感水稻內生真菌發酵產物的抑菌活性評價及其對水稻保護性酶活性的影響

張 琛 陳思博 胡本進 吳晨源 張 瑛 滕 斌

(1安徽農業大學生命科學學院,安徽合肥 230036；2安徽省農業科學院水稻研究所,安徽合肥 230031；3安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所,安徽合肥 230031)

化學農藥的施用在保證農業生產順利進行的同時,也帶來了環境污染、害蟲抗藥性、生態平衡破壞和食品安全等重大問題[1]。如何在不破壞生態環境的條件下,保證糧食產量穩定和質量安全,是一個直接關系著民生和農業與環境可持續發展的重大問題。因此,有關環境友好、高效安全的生物農藥研發和生產受到前所未有的關注,其中以微生物活體及其代謝產物為制劑的生物農藥已成為十分活躍的研究領域[2-3]。作為一個重要的微生物資源,植物內生真菌可以產生多種具有抗生活性的次級代謝產物,主要分為醌類、內酯類、萜烯類等易揮發的小分子弱極性物質,以及極性大分子如抗菌肽等抗生性代謝產物[4-6]。莊禮珂等[7]發現蜈蚣草內生菌具有顯著的拮抗植物病原菌的效果；楊俊譽等[8]從水稻植株上分離得到內生細菌,發現其對水稻病原菌有抑制作用。這些物質不僅能刺激植物生長發育,還能通過干擾抑制病原真菌的生長或者直接殺滅抑制病原微生物,增強寄主植物對生物脅迫與非生物脅迫的抗性[9]。

某些水稻品種具有強化感作用,能分泌合成酚酸類、萜類、甾類化及糖甙化合物等化感物質,來應對其他生物的脅迫,其內生真菌在與水稻長期共生的過程中,為了適應化感水稻的內在環境,在正常的生理代謝過程中往往會形成一些新的化合物[10]。這些物質有可能對水稻生理代謝產生各種作用和影響,造成水稻代謝物水平的改變。袁志林等[11]研究發現水稻接種內生真菌后,能提高水稻抗氧化酶的活性；陳頤輝等[12]發現化感水稻某些內生真菌發酵產物不僅能促進普通水稻品種生長,而且對稗草有抑制作用,推測該內生真菌發酵產物可能是通過抑制稗草脂肪酶活性和提高水稻的抗氧化能力實現其功能的。這種內生真菌與植物的互作,引起小分子代謝產物和大分子相關酶活性的變化,改變了化感物質的數量和種類,且這些物質往往也是生防藥物新的開發資源。

苯丙氨酸解氨酶[13](phenylalaninammo-nialyase,PAL)是植物體內木質素、植保素及酚類化合物的合成代謝的關鍵酶。超氧化物歧化酶[14](superoxide dismutase,SOD)和過氧化物酶[15](peroxidase,POD)作為細胞內主要的抗氧化酶,當細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高時,會產生相應的應急響應,使植物免受活性氧的損傷。此外,POD還關系到植物體內木質素、酚類物質的合成代謝。這些保護性酶活性的變化不僅可以作為植物抗逆性的評價指標,還能夠有效地反映外界環境條件(包括生物因素和非生物因素)對植物生理代謝水平造成的影響。

目前,國內外對于植物內生真菌的研究主要集中在促生、代謝物鑒定及抗病研究的起步階段[16],有關化感水稻內生真菌與病原菌拮抗作用,以及對水稻保護性酶系統的影響方面的研究鮮有報道。本研究以化感水稻6173為研究材料,分析其內生真菌對水稻病原真菌的拮抗作用及相關抗菌機制,以期篩選出優良的內生真菌菌株,在此基礎上進一步研究了內生真菌發酵物的熱穩定性及對非化感水稻93067相關保護性酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試內生真菌菌株分離自強化感水稻6173[17-18]且已經過rDNA-ITS系統發育分類鑒定,由安徽省農業科學院水稻研究所提供,編號分別為曲霉屬(Aspergillus)的 REF-01、REF-05、REF-07、REF-09、REF-10,紅酵母屬(Rhodotorula)的REF-02,木霉屬(Trichoderma)的 REF-03,鐮刀菌屬(Fusarium)的REF-04、REF-06,青霉屬(Penicillium)的 REF-08、REF-11,以及麥角屬(Claviceps)的REF-12。

供試水稻材料為安徽省農業科學院水稻研究所提供的非化感水稻品種93067。指示菌株:紋枯病菌(Thanatephoruscucmeris)、惡苗病菌(Fusarium moniliforme Sheld)和稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae),由安徽省農業科學院植物保護與農產品質量安全研究所提供。

PDA固體培養基:去皮土豆 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂2 g,自然pH值,去離子水1 000 mL。PD液體培養基:去皮土豆 200 g、葡萄糖20 g,自然pH值,去離子水1 000 mL。

1.2 培養方法

菌株固體培養:將供試菌各菌株接種于PDA固體培養基上,28℃恒溫培養5 d。

液體搖瓶發酵:于500 mL錐形瓶(裝液量為200 mL)中,接種量為5%,28℃恒溫培養7 d。

1.3 水稻內生真菌抗性菌株的初篩

采用平板對峙法[19],在培養好的惡苗病、紋枯病、稻瘟病病原菌各菌落用打孔器取樣,直徑為5 mm,接種于PDA平皿中央,在其四周接種同樣大小的3塊內生真菌菌餅,28℃恒溫培養,連續觀察對峙結果。同時作空白對照(只接種病原菌),每組均設3次重復。抑菌率的計算公式如下:

抑制率=[對照組菌落直徑(mm)-處理組菌落直徑(mm)]/[對照組菌落直徑(mm)-5 mm]×100%。

1.4 水稻內生真菌抗性菌株的復篩

1.4.1 內生真菌抑菌代謝產物提取 內生真菌液體搖瓶培養結束后,發酵液經離心(4 000 r·min-1,5 min)得上清液。將上清液分別用乙酸乙酯、正丁醇按照1∶1(v/v)比例萃取[20],再通過R-205旋轉蒸發儀(上海中勝生物技術有限公司)旋轉蒸發,除去萃取液中的乙酸乙酯、正丁醇,得到乙酸乙酯和正丁醇的粗提物。將提取物用含濃度為0.2%吐溫-40的無菌水超聲振蕩溶解并稀釋至濃度為0.5 mg·mL-1,備用。

1.4.2 內生真菌代謝產物抗菌活性檢測 吸取150μL紋枯病菌菌懸液于PDA平板上,涂布后靜置片刻,在其上均勻放入3個經過滅菌的牛津杯[21](內徑 6 mm,高 10 mm),分別取 150μL 0.5 mg·mL-1的乙酸乙酯粗提物溶液和正丁醇粗提物溶液加入牛津杯中。以含有濃度為0.2%吐溫-40的無菌水為對照,每處理3次重復,28℃恒溫培養72 h,分別測量乙酸乙酯粗提物抑菌圈和正丁醇粗提物抑菌圈直徑大小。抑菌效果依據抑菌圈的大小來判斷,篩選出目標內生真菌菌株。

1.5 乙酸乙酯粗提物中抗菌成分的熱穩定性試驗

1.5.1 處理溫度對乙酸乙酯粗提物抑菌活性的影響 參照張艷軍等[22]的方法。根據1.4.1制備濃度為0.5 mg·mL-1的乙酸乙酯粗提物溶液,分別置于 40、50、60、70、80、90℃下處理30 min,指示菌株為紋枯病菌株,采用牛津杯法測定不同溫度處理后的乙酸乙酯提取物的抑菌活性。以未經加熱處理(正常室溫)的提取物為對照,測定其抑菌圈大小,每處理設3次重復。

1.5.2 處理時間對乙酸乙酯粗提物抑菌活性的影響 將濃度為0.5 mg·mL-1的乙酸乙酯粗提物溶液置于70℃水浴鍋中分別保溫處理2、4、6、8 h,以紋枯病菌為指示菌,采用牛津杯法測定處理后提取物的抑菌活性,以未經加熱處理(正常室溫)的提取物為對照,測定其抑菌圈大小。每處理設3次重復。

1.6 內生真菌發酵液對水稻幼苗3種保護性酶活性的影響

1.6.1 水稻培養和處理方法 將浸種后的水稻品種93067種子浸入內生真菌發酵液中處理12 h,然后置于人工氣候光照培養箱中,25℃恒溫培養,間隔噴施3次內生真菌發酵液?？瞻讓φ战M以無菌水代替發酵液噴施處理。

1.6.2 病原菌接種 依據1.3中平板對峙試驗結論和1.4牛津杯擴散法復篩的試驗結果,內生真菌對紋枯病菌的拮抗效果最好,并且菌株REF-04代謝產物的抑菌效果最好,因此待水稻幼苗長至三葉期后,制備紋枯病菌病原菌孢子懸液,以噴霧法接種病原菌孢子懸液。試驗設4個處理組,處理組1:噴施無菌清水,不噴霧接種紋枯病菌孢子懸液,標記為CK；處理組2:噴施無菌清水并接種紋枯病菌孢子懸液,標記為CK+T；處理組3:噴施菌株REF-04發酵液2 h后接種紋枯病菌孢子懸液,標記為REF+T；處理組4:噴施菌株REF-04發酵液,不接種紋枯病菌孢子懸液,標記為REF。

1.6.3 酶活性測定 病原菌接種處理結束后24、48、72、96 h,剪取水稻上部葉片,取樣稱重。參照陳展宇等[23]的方法,測定SOD和POD活性,并參照張小芳等[24]的方法測定PAL活性。每處理組重復3次。

1.7 數據統計

試驗數據采用SPSS 18.0軟件進行方差分析檢驗差異顯著性,應用Microsoft Office Excel 2003繪圖。

2 結果與分析

2.1 拮抗內生真菌的初篩

由表1可知,12株內生真菌表現出不同的抑菌效果,其中內生真菌 REF-03、REF-04、REF-11菌株對3種病原菌均有拮抗效果,菌株REF-02和REF-10對3種病原菌完全沒有抑菌效果,其余7株內生真菌僅對1～2種病原菌存在拮抗作用；菌株REF-04的抑菌作用最好,其對紋枯病菌抑制率達到了50.63%,對惡苗病菌和稻瘟病菌抑菌率分別達到了46.3%和43.21%。此外,內生真菌對紋枯病菌的拮抗效果最好,有6種內生真菌對紋枯病菌不僅有抑制作用,而且抑菌率較高。

表1 內生真菌對植物病原菌的抑制率Table1 Inhibition rate of endophytic fungi to the plant pathogenic fungi /%

2.2 拮抗內生真菌的復篩

根據初篩結果,選取拮抗作用較強、抑菌效率較高的 6 株內生真菌(REF-03、REF-04、REF-07、REF-08、REF-09、REF-11)進行液體發酵培養,以紋枯病菌為指示菌,采用牛津杯擴散法進行復篩,用乙酸乙酯和正丁醇分別提取代謝物進行抗菌活性檢測。

由圖1可知,REF-04發酵液乙酸乙酯粗提物的抑菌作用最為明顯,其抑菌圈直徑為18.6 mm,菌株REF-11、REF-07次之,菌株REF-08抑菌作用最弱。由圖2可知,發酵液正丁醇粗提物抑菌效果與乙酸乙酯粗提物基本一致,但與乙酸乙酯粗提物的抑菌活性相比,正丁醇粗提物抑菌活性相對較弱。由于乙酸乙酯的極性較正丁醇小,乙酸乙酯對于疏水性強的代謝物親和性更好,說明這些內生真菌的代謝物中抗菌活性成分可能以弱極性的小分子化合物為主,使用乙酸乙酯更有利于代謝產物中抗菌成分的提取。

結合平板對峙試驗結論,根據牛津杯擴散法復篩所得結果認為,菌株REF-04代謝產物的抑菌效果最好,顯著優于與其他菌株。下一步試驗選擇菌株REF-04為目標菌,進行抗菌活性物質的穩定性和對水稻幼苗3種酶活性影響的試驗。

2.3 處理溫度對REF-04菌株發酵液乙酸乙酯粗提物抗菌活性的影響

圖1 內生真菌發酵液乙酸乙酯粗提物的抑菌活性Fig.1 Antifungal activity of ethyl acetate extracts from the metabolites of endophytic fungi

圖2 內生真菌發酵液正丁醇粗提物的抑菌活性Fig.2 Antifungal activity of n-butyl alcohol extracts from the metabolites of endophytic fungi

由圖3可知,40℃處理與對照(CK)乙酸乙酯粗提物的抑菌圈直徑大小基本相近,REF-04菌株發酵液乙酸乙酯粗提物的抑菌活性隨著處理溫度的升高呈下降趨勢。其中,40～70℃處理下,REF-04菌株發酵液乙酸乙酯粗提物的抑菌圈直徑大小變化不顯著,即其抑菌活性變化不顯著；80、90℃處理下,REF-04菌株發酵液乙酸乙酯粗提物的抑菌活性下降顯著,但80℃處理30 min后,REF-04菌株發酵液乙酸乙酯粗提物仍具有相當于對照77.8%的抑菌活性。表明REF-04菌株抗菌活性組分有較好的熱穩定性。

2.4 處理時間對REF-04菌株發酵液乙酸乙酯抗菌粗提物抗菌活性的影響

由圖4可知,在70℃水浴處理下,隨著處理時間的延長,各處理組REF-04菌株發酵液乙酸乙酯粗提物的抑菌活性逐漸下降；與對照(CK)相比,各處理時間下的REF-04菌株發酵液乙酸乙酯粗提物的抑菌活性均顯著下降。處理時間為4、6、8 h時,各處理組乙酸乙酯粗提物抑菌活性差異不顯著,其中處理時間為6、8 h時的乙酸乙酯粗提物的抑菌圈直徑分別為12.5、12.1 mm,仍具有相當于對照68.3%和65.7%的抑菌活性。表明REF-04菌株發酵液粗提物抗菌活性組分具有較強的高溫耐受性。

圖3 處理溫度對REF-04菌株發酵液乙酸乙酯粗提物抑菌活性的影響Fig.3 Effects of treatment temperature on the antibacterial activity of ethyl acetate crude extract from fermentation liquid of the REF-04 strain

圖4 處理時間對REF-04菌株發酵液乙酸乙酯粗提物抑菌活性的影響Fig.4 Effects of treatment time on the antibacterial activity of ethyl acetate crude extract from fermentation liquid of the REF-04 strain

2.5 內生真菌REF-04菌株發酵液對水稻93067幼苗保護性酶活性的影響

由圖5-A可知,除空白對照組(CK)外,其他處理組水稻幼苗PAL活性隨著處理時間的延長呈先升高而后降低的趨勢,其中在處理72 h后,不同處理組間的水稻幼苗PAL活性表現差異顯著,噴施發酵液和接種病原菌組(REF+T)水稻幼苗PAL活性最高,只施加發酵液組(REF)的水稻幼苗PAL活性次之。上述結果表明,無論是否接種病原菌,REF-04菌株發酵液均能促進水稻幼苗PAL活性的提高。

圖5 REF-04發酵液對水稻93067幼苗保護性酶PAL(A)、SOD(B)和 POD(C)活性的影響Fig.5 Effects of the fermentation liquor from REF-04 on activities of protective enzymes PAL(A)，SOD(B)and POD(C)in the seedling of rice accession 93067

由圖5-B可知,REF+T組的水稻植株在處理初期其幼苗SOD活性升高幅度明顯,處理48 h時其幼苗SOD活性達到最大,且顯著高于其他處理組,繼續延長處理時間,水稻幼苗SOD活性開始下降,但在處理96 h時水稻幼苗SOD活水平仍顯著高于CK；REF組在處理48～72 h時,在一定程度上也促使了水稻葉片SOD活性提高。此外,只接種病原菌組(CK+T)的水稻新葉在處理24～72 h時,其SOD活性逐漸升高,這與水稻植株對病原菌的入侵,引起植株本身的抗逆反應有關。綜上表明,添加REF-04發酵液處理能提高水稻幼苗SOD活性,誘發抗逆反應,有利于保護植物免受病原菌進一步侵染。

由圖5-C可知,處理24 h時,各處理組水稻幼苗POD活性差異不大,但在處理48 h后,REF+T、REF、CK+T組的水稻幼苗POD活性均顯著升高,一直維持高酶活水平至處理72 h,且均顯著高于CK。此外,處理72 h時,REF+T組水稻幼苗POD活性顯著高于其他處理組,達到最大值。綜上表明,REF-04菌株發酵液處理后,在水稻幼苗受到病原菌侵染時,可促進葉片細胞POD活性持續增加。

3 討論

植物內生真菌作為一個龐大而特殊的真菌類群,在長期互惠共生過程中,不僅與植物之間形成復雜緊密的微生態關系,而且會產生豐富多樣的代謝產物。而內生真菌在控制植物病原方面體現出的生物學作用主要有以下幾方面:分泌生長素等激素物質,促進植物的生長發育,增強植物的抗逆性；通過影響植物的生理生化代謝水平,提高植物對病原菌以及不良環境因素的抵抗力；產生有機酸、環肽、生物堿等多種次生代謝產物,這些物質大多是一些非極性化合物,具有促生、抗菌、防治蟲害等生物活性[4-7]。張曉蓉等[25]研究發現深色有隔內生真菌能夠促進番茄植株的生長,同時還能激發番茄葉片SOD、POD等抗氧化酶的高效表達,從而提高植物對尖孢鐮刀菌病害的抗性。陳良立等[26]發現交讓木內生真菌發酵液乙酸乙酯提取物具有良好的抑菌活性；蘇經遷等[27]發現茶樹內生真菌發酵液乙酸乙酯提取物對植物病原真菌有明顯的抑制作用。本研究中,從化感水稻中分離獲得12株內生真菌,在對3種病原真菌抑菌活性檢測試驗中發現,大部分的內生真菌對水稻幼苗病原菌均有不同程度的抑制作用,其中REF-04菌株抑菌譜廣,其發酵液粗提物抑菌活性較高,其中以REF-04發酵液乙酸乙酯粗提物對紋枯病菌抑制效果最好,且其抗菌活性組分有較好的熱穩定性,說明該內生真菌菌株活性代謝產物可能大部分以弱極性的化合物組成,且具有較好的耐熱性。

PAL與植物體內苯丙烷類等物質代謝合成有關,這些物質涉及到植物的次生代謝和抗逆性。對于大多數生物來說,SOD扮演著重要角色,在細胞內主要負責清除 O2·-,將其分解為 H2O2和 O2[14,28]。 本試驗中,REF-04菌株發酵液及病原真菌的入侵能促進SOD活性提高,原因可能是:一,外來因素引起細胞的應急響應,如呼吸爆發引起胞內O2·-濃度的升高[29]；二,REF-04菌株發酵液對水稻幼苗SOD合成水平提高有促進作用,在上述兩方面因素的影響下,水稻SOD活性迅速升高,進而提高了水稻的抗逆能力。POD是植物體內重要的防御類氧化酶,不僅可以清除細胞內的H2O2,還能產生氧化酚等具有毒性的物質,可致死入侵的微生物,此外,植物體內POD活性的變化可以反映植物體內的抗病害代謝情況[15,30]。SOD在清除O2·-過程中,其歧化產物之一就是 H2O2,即SOD活性在對O2·-應激響應的同時,其活性的升高會導致產生較多的H2O2,間接促使細胞POD活性提高,本研究中,在處理48 h后,REF+T、REF、CK+T組的水稻幼苗POD活性均顯著升高,表明在SOD活性升高后,伴隨著POD活性的升高,說明在SOD和POD的共同作用下,O2·-和H2O2才能最終被分解為無毒的H2O和O2,降低Fenton反應[31]的發生概率,從而降低細胞內OH·的濃度,避免細胞遭受更大的傷害。本研究結果表明,SOD和POD在植物受到外界不良因素的影響時,可通過提高酶活性來保證細胞免受ROS的傷害,并且還會產生一定的協同性,共同應對不良環境。

然而,本試驗僅探討了內生真菌對普通水稻品種部分保護性酶活性的影響,對于植物體內防御系統與內生真菌代謝產物拮抗作用及代謝途徑未做研究,下一步將研究內生真菌對化感水稻與非化感水稻間保護酶作用及代謝途徑差異,以期揭示植物體內防御系統與內生真菌代謝產物拮抗作用的相關性。

4 結論

本研究利用來自化感水稻6173中分離得到的12株內生真菌菌株進行抑菌活性篩選,獲得對病原真菌具有較好拮抗效果的REF-04菌株,且該抗菌乙酸乙酯提取物具有較強的熱穩定性。此外,內生真菌REF-04發酵液可促使水稻幼苗PAL、SOD和POD活性的升高,有助于增強植物自身的防御功能。上述研究結果為闡明化感水稻6173內生真菌代謝產物的抑菌機制奠定了一定的理論基礎,同時也表明水稻內生真菌可作為一種新的植物益生菌資源,在生物農藥和農業種植方面具有一定的應用價值和開發前景。