胚乳突變體在水稻淀粉合成調控研究中的作用

應逸寧 龐悅涵 包勁松

(浙江大學原子核農業科學研究所/浙江省及農業農村部核農學重點實驗室,浙江杭州 310058)

水稻(Oryza sativaL.)是世界上最重要的農作物之一,全球大約有一半的人口以其為主食,同時水稻也是我國播種面積最大的糧食作物之一[1]。近30年來,中國水稻生產經過高產育種、超高產育種、超級稻育種和綠色超級稻育種等計劃的實施,水稻產量不斷提高,其中,超級稻的產量在 2015年已達到了 6 892.5 kg·hm-2的水平[2]。目前,在我國水稻生產中,產量已經不是最主要的限制因素。隨著市場經濟的發展和人民生活水平的提高,稻米品質改良正逐漸成為水稻育種工作的重點。

淀粉是水稻胚乳中最主要的儲藏物質,約占水稻胚乳干重的80%,在含水量為14%的精米中,淀粉含量約為76.7%～78.4%[3]。同時,淀粉特性決定了水稻多方面的品質,尤其是蒸煮和食用品質[4]。水稻的蒸煮與食用品質通常用直鏈淀粉含量(amylose content,AC)、糊化溫度(gelatinization temperature,GT)、膠稠度(gel consistency,GC)這3個理化指標來衡量[5]。因此,水稻淀粉結構、生物合成等方面的深入研究對水稻品質改良具有重要意義。

長期以來,水稻科研工作者盡力發現和分離有價值的自然突變和人工突變材料。一方面,突變體具有某些特殊性狀,增加了水稻產量、品質性狀的遺傳多樣性,可滿足更大人群食用和工業生產的需求,同時也是育種的良好材料。另一方面,隨著水稻全基因組測序工作的完成,水稻突變體已廣泛應用于水稻功能基因組學研究,以鑒定調控水稻農藝、產量、品質性狀的突變基因,克隆相關基因,并研究基因的功能[6]。水稻淀粉生物合成途徑中的相關基因,都找到了相應的突變體,通過尋找基因區段序列變異及解析基因的功能有力地促進了水稻淀粉合成分子生物學研究的進展。

1 水稻淀粉結構

淀粉是一種多聚葡萄糖,由α-(1→4)連接的線性葡聚糖和α-(1→6)連接的分支組成,根據結構可分為近線性的直鏈淀粉(amylose)和高度分支的支鏈淀粉(amylopectin)[7]。直鏈淀粉是由葡萄糖α-1,4糖苷鍵連接而成的多聚糖,并帶有一定卷曲的螺旋結構。支鏈淀粉是由葡萄糖經α-1,6糖苷鍵連接而成的多聚糖。在支鏈淀粉的分支簇狀結構中,A鏈沒有分支,聚合度(degree of polymerization,DP)較小,一般為 6～12,其還原端通過α-1,6糖苷鍵連接到B鏈上；B鏈含有若干分支,可細分為 3種:B1(12＜DP＜25)、B2(25＜DP＜36)、B3(DP＞36)；C鏈位于簇的中心,是支鏈淀粉分子中唯一具有還原端的鏈,DP一般大于60。

在淀粉顆粒中,直鏈淀粉分子不能形成結晶,而是和支鏈淀粉徑向排列成具有結晶區和無定型區交替層的結構。晶形區是平面結構,而無定形區是非平面結構,因而可以形成超螺旋式三維結構。在這個三維結構中,雙螺旋葡聚糖鏈密集地平行排列,并且與淀粉顆粒表面垂直[8]。不同物種來源的淀粉顆粒在形態大小之間存在很大差異。水稻淀粉顆粒由多個單淀粉粒組成的復合淀粉粒形式存在于胚乳細胞中,一般具有多邊形、不規則的形態[9]。

2 水稻淀粉生物合成

水稻淀粉合成包括瞬時淀粉合成和儲藏淀粉合成兩種形式。瞬時淀粉在白天積累,晚上降解為植物組織提供能量,主要合成場所在葉綠體；而儲藏淀粉能不斷合成和積累,可作為種子發芽時的營養物質,主要合成場所在造粉體[10]。近期,Tetlow等[11]對禾本科植物胚乳中的儲藏淀粉生物合成過程做了詳細的綜述,包括禾本科不同物種的進化關系、胚乳的發育、胚乳碳源的供給、淀粉生物合成的過程及淀粉顆粒的形成等。

水稻淀粉合成起始于由光合組織合成的葡萄糖轉化而來的蔗糖。蔗糖被運送到胚乳中,在蔗糖合成酶(sucrose synthase,SuS)催化下水解形成果糖和尿苷二磷酸-葡萄糖(uridine diphosphate-glucose,UDPG),UDPG繼而形成葡萄糖1-磷酸(glucose 1-phosphate,G1P),或由蔗糖水解為己糖進入胚乳細胞質,經變構酶、己糖激酶等作用轉化成G1P。隨后G1P在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase,AGPase)的催化下形成ADP-葡萄糖(ADP-glucose,ADPG)。ADPG再由Brittle1基因編碼的內包膜蛋白作用下進入造粉體中。此外,G1P可通過假定的G1P轉運蛋白直接進入造粉體,然后在AGPase催化下合成ADPG。ADPG經顆粒淀粉合成酶(granulated starch synthase,GBSS)催化合成直鏈淀粉；可溶性淀粉合成酶(soluble starch synthase,SSs)負責延長α-(1→4)連接的葡聚糖鏈,而后由淀粉分支酶(branching enzyme,BEs)引入α-(1→6)連接的分支點,再由淀粉去分支酶(branching enzyme,DBEs)脫去不合適的分支(圖1),最后合成支鏈淀粉。淀粉合成過程中,這么多酶不可能單獨作用,而更可能通過協同作用,共同完成支鏈淀粉合成[10]。除了以上幾種酶外,淀粉磷酸化酶(starch phosphorylase,SP)和歧化酶(dismutase,DPE)也參與淀粉合成。SP催化一個可逆反應,從合成方向,將GlP上的葡萄糖殘基轉移到α-1,4葡聚糖鏈的非還原端并產生Pi。DPE與質體型SP(Pho1)形成蛋白復合體,參與淀粉合成[12]。此外,SP與其他淀粉生物合成酶也存在相互作用,例如,SSIIa與SSIIIa存在的相互作用就是通過SP進行的[13]。上述參與淀粉合成的酶可進一步細分為不同的組織特異性亞型,在某些情況下,還有不同的亞細胞區域化[14]。K?tting等[15]對已知淀粉合成通路的調節機制進行了綜述,包括可逆淀粉磷酸化,氧化還原調節和由蛋白磷酸化啟動的蛋白質復合體。但是,目前對具體調控機制的細節所知甚少,更多細節還有待研究,如C2位置葡萄糖殘基的磷酸化機制等[11]。

3 胚乳突變體在水稻淀粉合成分子生物學研究中的作用

近年來,利用水稻淀粉突變體開展淀粉合成相關研究取得了一些進展。水稻淀粉突變體主要有糯性突變體(waxy,wx)、高直鏈淀粉突變體(amylose-extender,ae)、堊白突變體(chalk,chalky,或chalkiness)、粉質突變體(floury,flo)、暗色突變體(dull,du)、糖質突變體(sugary,su)和皺縮突變體(shruken,sh)等。與相應野生型相比,以上突變體淀粉特性發生了一系列變化(表1),主要體現在 AC、淀粉粘滯性譜(rapid visco ananlyzer profile,RVA譜)、熱學特性(用差示掃描量熱儀測定)、支鏈鏈長分布上。通過突變基因的克隆及功能研究,逐步明確了它們在淀粉合成及調控中作用(圖1、表1),說明胚乳突變體在淀粉合成分子生物學機理研究中起著不可替代的重要作用。

3.1 糯性突變體

糯性突變體(糯米)是最早被研究的突變體,其淀粉主要含有支鏈淀粉,僅有極少的直鏈淀粉。由于直鏈淀粉的形成受到影響,糯米的淀粉特性發生很大變化,使其滿足更多的應用需求。1988年Okagaki等[54]克隆了Wx基因。Wx基因位于第6染色體,編碼顆粒淀粉合成酶(granule-bound starch synthaseⅠ,GBSSI),是控制直鏈淀粉合成的主效基因,直接影響水稻胚乳和花粉中直鏈淀粉的含量,非糯性基因(Wx)對糯性基因(wx)表現為不完全顯性,存在較為明顯的劑量效應。在非糯品種中,Wx基因分化為Wxa和Wxb兩種等位基因,其中,野生稻全為Wxa,秈稻以Wxa為主,直鏈淀粉含量較高；粳稻基本為Wxb,直鏈淀粉含量較低,這表明Wxb基因可能是由Wxa基因馴化而來的[55-56]。與Wxa相比,Wxb的變異是由第一內含子剪接位點處G-T變異造成的,突變降低了pre-mRNA的剪接效率,減少了GBSSI的翻譯,進而使直鏈淀粉含量降低[57-58]。近年來,在一些地方品種中又鑒定了多個調控直鏈淀粉合成的復等位基因,如Wxin、Wxop、Wxhp、Wxmq和Wxmp等,朱霽暉等[59]對這些復等位基因進行了詳細的綜述。

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3.2 高直鏈淀粉突變體

ae突變體的米粒變小,表面有堊白且皺縮,直鏈淀粉含量顯著提高,碘藍值升高。高淀粉是發酵專用品種和淀粉糖工業專用品種的共同特點,有助于提高產物得率。因此,高直鏈淀粉突變稻米不僅是重要的工業生產和釀酒專用原料,也適宜制作米粉罐頭和貯藏糕點[60]。ae突變基因位于第2染色體,編碼淀粉分支酶IIb(branching enzyme IIb,BEIIb),BEIIb具有轉移短鏈的功能。此外,ae突變體不僅BEIIb活性下降,淀粉合成酶Ⅰ(starch synthaseⅠ,SSI)的活性也顯著下降[19]。

3.3 堊白胚乳突變體

堊白是指稻米胚乳中白色不透明的部分,是由于水稻籽粒灌漿不充分,胚乳中的淀粉體和蛋白質體充實不良引起的,以腹白最為常見,心白次之,背白最少。堊白不僅降低了稻米外觀品質,也降低了碾米品質及蒸煮食味品質[61],但堊白突變體可用于釀造工業。

研究表明,稻米堊白性狀屬于復雜的數量性狀,受多基因控制。截至目前共定位到85個與堊白相關的數量性狀位點(quantitative trait locus,QTL),其中有13個與堊白大小有關,21個與堊白度相關的,51個控制堊白率[62]?？刂扑咀蚜装椎闹餍TLchalk5已被克隆,該基因編碼一個液泡氫離子轉運焦磷酸酶,具有無機焦磷酸水解活性和質子轉運活性,通過調控細胞質中氫離子的平衡來間接影響淀粉合成,從而對水稻籽粒堊白的形成和精米率等品質性狀產生影響[63]。Wang等[64]采用γ輻照處理獲得了gif1突變體,其灌漿速度減慢,堊白程度很高,淀粉顆粒發育不正常且顆粒包裹松散。gif1突變體基因G1F1位于第4染色體,編碼一種細胞壁轉化酶,其通過調控籽粒灌漿初期的碳源分流來影響儲藏物質的累積速度。Wang等[65]發現gpa1突變體比野生型更加白且粉質化,掃描電鏡顯示突變體胚乳中復合淀粉顆粒呈圓形且包裹松散。該突變體積累過多57 kDa谷蛋白前體,難以向蛋白體Ⅱ(PBII)運輸,使造粉體的形成受到干擾。gpa1突變基因OsRab5a位于第 12染色體,編碼一個 GTP酶(GTPase),參與胚乳細胞液泡中蛋白質的轉運。此外,Wang等[66]還對堊白突變體gpa4進行了研究,該突變體囊泡蛋白轉運缺陷,胚乳包含圓形且松散包裹的復合淀粉顆粒,千粒重顯著降低,積累過量57 kDa的谷蛋白前體,且成熟谷蛋白40 kDa酸性和20 kDa基本亞基降低,囊泡定位前體增加。該突變基因是位于3號染色體上的GPA4,編碼一個保守的膜蛋白GOT1B,在水稻胚乳發育中具有雙重作用,參與醇溶谷蛋白和α-球蛋白的RNA定位到皮層內質網,以及將醇溶谷蛋白和α-球蛋白從內質網輸出到高爾基體的過程[67]。

Han等[21]發現T3612突變體灌漿速率降低,胚乳呈粉質狀,淀粉顆粒呈圓形且包裹松散,該突變基因是位于第11染色體的PDIL1-1,編碼了一個類二硫鍵異構酶PDIL1-1,該蛋白的缺失對胚乳內質網中淀粉體的合成造成了脅迫,從而導致淀粉累積減少并表現出堊白,這說明PDIL1-1對淀粉合成發揮著重要作用。Matsushima等[68]發現ssg4突變體堊白增多,種子稍變小,淀粉粒變大,種子淀粉含量降低,但淀粉的結構特性沒有明顯變化；在淀粉積累的其他組織,如花粉粒、根冠及幼嫩果皮,淀粉粒也變大。ssg4突變基因是位于第1染色體的SSG4,編碼一個定位于造粉體的未知功能新蛋白,會影響淀粉粒的大小,可能直接參與質體的發育。Li等[23]發現osbt1突變體呈現心白胚乳,其粒重顯著低于野生型。AC降低,復合淀粉顆粒的形成和發育存在明顯缺陷,胚乳中存在許多分散的單粒淀粉,造粉體發育異常。osbt1突變體中淀粉合成相關基因的表達也發生了改變。OsBT1編碼一個假定的ADP葡萄糖轉運蛋白,該蛋白定位在造粉體被膜中。OsBT1在淀粉合成和復合淀粉顆粒的形成中起著重要作用。Wang等[24]發現osbzip58突變體呈現腹白,堊白部分淀粉顆粒排列松散,AC降低,支鏈淀粉短鏈增多,中長鏈減少。突變基因位于第7染色體,編碼一個含有堿性亮氨酸拉鏈結構域的蛋白OsbZIP58。該蛋白作為轉錄調控因子,能與6個淀粉合成相關基因(SBE1、OsBEIIb、OsSSIIa、Wx、OsAGPL3 和OsISA2)的啟動子特異性結合,調節這些基因的表達,控制淀粉的生物合成。Fu等[25]通過T-DNA插入法得到rsr1突變體,表現為心白胚乳,種子變大,AC增加,支鏈淀粉結構改變,形成圓形且松散堆積的淀粉顆粒,導致GT降低。該突變體缺失基因RSR1位于第5染色體上,編碼一個AP2/EREBP家族轉錄因子,負向調控儲藏淀粉合成類基因 (OsAGPL1、OsISA1、OsISA2、OsPUL、OsSSIIa、OsSSIIIa和OsBEIIb)的表達。

3.4 粉質胚乳突變體

粉質突變體是堊白的極端表型[69],其胚乳淀粉粒結合松散,胚乳內部表現為粉末狀,而不是正常的透明狀。目前己報道的粉質突變體有9個(flo1～8、flo13)。Satoh等[26]于1981年利用化學誘變劑N-甲基-N-亞硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea,MNU)誘發產生了突變體flo1,其粒型基本不變,具有類似waxy突變的白胚乳,但能被I2-KI溶液染色成深藍色,該突變基因位于第5染色體上[27]。flo2突變體的整個胚乳表現為粉質,電鏡觀察顯示胚乳中淀粉粒比野生型小,排列松散[28]。FLO2位于第4染色體上[29],在發育中的種子和葉片中均表達,并且隨著胚乳的發育,表達量增加,其編碼一個包含三角四肽重復基序(tetratricopeptide repeat,TPR)的蛋白FLO2。該蛋白通過調控蛋白-蛋白互作,使胚乳蛋白和淀粉合成相關基因的表達量下降。在flo2突變體中,淀粉合成相關酶如 AGPase、GBSS、SS和BEIIb等活性下降,從而影響胚乳儲藏物質的積累,對種子大小和淀粉品質方面起著關鍵性的調節作用[28,30]。flo3除了表現為白色胚乳外,胚乳中16 kDa球蛋白含量降低,突變基因位于第4染色體上[70]。flo4突變體是通過T-DNA插入法得到的,出現心白粉狀胚乳但胚乳外部正常,電鏡觀察到在粉質胚乳部分,淀粉粒排列松散。突變原因是T-DNA插入到一個編碼丙酮酸磷酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase,PPDK)的基因OsPPDKB第五個內含子中導致該基因失去功能。突變植株中沒有OsPPDKB轉錄產物,在發育胚乳和葉片中由于沒有OsPPDKB蛋白而導致胚乳最終呈現粉質性狀[31]。Chastain等[71]分析了水稻發育中的種子PPDK含量和翻譯后調節,提出了C3植物的PPDK在磷酸烯醇丙酮酸(PEP)向丙酮酸形成反應的生物合成過程中發揮作用,且在水稻種子發育過程中而非種子發育成熟后發揮功能。flo5也是T-DNA插入突變體,種子中間部分為粉質性狀,外層無變化,中間粉質部分的掃描電鏡觀察顯示,淀粉顆粒更小更圓,并且淀粉顆粒很少是透明的。FLO5位于第8染色體,編碼SSIIIa,該蛋白主要負責合成支鏈淀粉中的長鏈,在開花后5～15 d表達量最大[32-33]。此外,SSIIa/SSIIIa的雙抑制株系并未表現出加性特征,表明在淀粉合成過程中SSIIa和SSIIIa基因間存在相互作用。酵母雙雜交試驗證實這個相互作用可能是通過淀粉磷酸化發生的,這些結果表明SSIIa和SSIIIa在水稻籽粒淀粉合成中發揮著不同的但又有相互重疊的作用[13]。flo6是在組織培養過程中獲得的突變體,灌漿率降低,胚乳變小且不透明,胚乳中淀粉含量明顯減少,淀粉粒減小且雜亂分布,復合淀粉粒的結構不正常,同時還觀察到3種不正常的淀粉體。flo6突變基因位于第3染色體上,編碼含有CBM48結構域的蛋白,FLO6通過C-端的CBM48結構域能夠與淀粉結合,通過N-端的結構域能夠與ISA1結合,表明在淀粉合成中,它可能在ISA1和淀粉間起到橋梁的作用,參與淀粉合成及復合淀粉粒形成[34]。flo7突變體胚乳不透明,籽粒外圍表現為白色粉質狀,而里層為半透明狀,胚乳外圍淀粉粒排列松散,顆粒形狀不規則。FLO7編碼綠色植物特有的一種蛋白,屬于DUF1338超家族,蛋白N-端具有作用到造粉體的信號,FLO7在造粉體發育和外圍胚乳淀粉合成等過程中發揮重要的調控作用[35-36,72]。誘變劑MNU誘發的flo8呈現粉質胚乳,粒長和粒寬沒有明顯變化,胚乳內淀粉粒排列松散,淀粉粒小而圓。該突變是由于單核苷酸替換且一個8 bp序列插入到UDP-葡萄糖焦磷酸化酶1(Ugp1)基因中導致的?；蚧パa驗證籽粒外觀恢復正常,表明FLO8編碼UDP-葡萄糖焦磷酸化酶1,從而影響胚乳淀粉合成和淀粉粒結構[38]。近期,Hu等[39]利用化學誘變劑甲磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)誘發得到了突變體flo13,該突變體胚胎致死,種子不能萌發,胚乳粉質不透明。突變體淀粉粒組分發育異常,導致淀粉生物合成受阻,谷粒厚度和千粒重明顯降低。突變基因是位于第2染色體上的OsNDUFA9,編碼線粒體的復合物Ⅰ亞基,該蛋白的突變導致線粒體呼吸鏈受損,從而影響胚乳正常發育。

3.5 暗色胚乳突變體

暗色突變體胚乳呈暗白色,AC均降低,介于野生型與糯性突變體之間[73]。目前發現了至少13個控制AC降低的基因位點,這些基因中,除了Wxmq與Wx等位[74],其他均為Wx的非等位基因。由于AC是影響稻米蒸煮和食用品質的主要因素,這些基因的研究對水稻品質改良非常重要。Satoh等[26]于1981年通過MNU處理受精卵得到了一系列暗色突變體,Yano等[73]將突變體du1-5的突變基因定位于染色體,du1-5均為與Wx非等位的隱性基因。du1基因位于第7染色體,編碼一個新蛋白Prp1(pre-mRNA processing),該蛋白類似于SR蛋白(serine/arginine-rich proteins)的剪接因子,通過與Wxbpre-mRNA可能的剪接增強子結合,并在Wxb的2個隱蔽剪接位點處形成穩定的復合體,從而引導Wxbpre-mRNA的剪接。du1突變體由于未能形成正常的剪接因子,使Wxbpre-mRNA的正常剪接過程受到一定的影響,導致突變體AC的降低,但對剪接后的轉錄調控無影響[40,75]。du2突變體對胚乳Wxb轉錄產物的剪切效果與du1相似,但du1使花粉中WxbmRNA較胚乳下降更多,而du2反之,說明du1和du2基因位點編碼組織特異性的剪切調控因子,從而對pre-mRNA進行選擇性剪切[40]。du3突變體AC為7%,明顯低于野生型,但高于du1。du3定位于第2染色體的長臂上,編碼一個CBP20(cap-binding protein 20 KD subunit)的同源蛋白,該蛋白定位在細胞核中,是帽子結合復合體(cap-binding complex,CBC)的一個組成部分,參與pre-mRNA剪切和外運過程。du3中Wxb基因pre-mRNA的剪切效率較du1低[43]。du4突變體基因定位于第4染色體[73],du4和du5突變體產生的分子機制和功能變化還處于研究中。Koh等[76]通過MNU誘變得到了3個突變體,突變基因分別為du6(du6a)、du7(du6b)、Du8(Du7t),前兩者為隱性基因,后者為顯性基因。通過EMS誘變得到的2個突變體以及MNU誘變得到1個突變體,突變基因分別定位于第6、第9、第6染色體[27]。來自γ輻照NM391突變系的暗胚乳突變體基因暫定命名為du12(t),定位在第6染色體長臂末端的840 bp區間內[77]。以上7個突變體的突變基因及其功能仍在研究中。

3.6 糖質胚乳突變體

Yano等[44]用MNU處理水稻受精卵細胞,篩選獲得了兩種皺縮的突變體(wrinkled),一種胚乳半透明且堅硬,命名為糖質突變體；另一種胚乳不透明且易碎,命名為皺縮突變體(見3.7)。雖然它們的外觀及碾米品質不佳,但具有特殊的性質,可用于開發新用途。

糖質突變體胚乳中積累大量可溶性碳水化合物(植物糖原)而不是淀粉。sug1的突變基因是位于第8染色體上的異淀粉酶1基因(ISA1)[20,78],該基因表達量影響α-葡聚糖分支以及支鏈淀粉、植物糖原的生物合成[45]。sug2突變體中普魯蘭酶基因(PUL)表達量大大降低,但基因分析表明,sug2并不位于PUL所在的第4染色體上,說明sug2基因產物可能參與PUL的調控從而影響淀粉的生物合成[20]。Lee等[46]通過MUN誘變得到了一個輕微的糖質突變體sug-h(最初稱為sug2[47]),其表型為sug1和野生型的中間型,輕微皺縮,具有半透明的琥珀色,積累可溶性糖類且AC也增加[47]。研究發現,sug-h的表型由2個隱性互補基因控制,一個是異淀粉酶1基因(OsISA1),另一個是淀粉分支酶IIa基因(OsBEIIa),OsBEIIa的突變可以恢復部分由OsISA1突變引起的皺縮[46]。Nakagami等[48]通過MUN誘變產生了另一個sug2突變體,也在胚乳中積累水溶性α-葡聚糖,但該突變體不僅可溶性葡聚糖結構特征與sug1不同,還保留了DBEs的全部活性,同時也保留SSs、BEs活性。這表明sug2突變基因在胚乳發育早期對支鏈淀粉分支結構的形成起到重要作用,但該基因目前尚未被克隆。趙華等[49-50]以中花11為材料,通過γ輻照得到了一個糖質突變體,暫命名為Sug-11,在灌漿初期的可溶性糖和蔗糖含量與野生型差異不明顯,在灌漿中后期逐步趨于明顯,AC和直鏈淀粉碘藍值顯著下降,淀粉的理化特性也有所變化。淀粉合成代謝幾個關鍵酶的動態變化揭示了Sug-11籽粒中淀粉積累減少、糖分含量增加主要是由籽粒灌漿中后期的PUL轉錄表達水平和DBE活性大幅下降引起的。此外,其AGPase活性在籽粒灌漿前期的顯著下降與籽粒灌漿不良和千粒重下降等現象也存在一定的聯系。

3.7 皺縮胚乳突變體

皺縮突變體胚乳中蔗糖含量增加而淀粉含量減少,AGPase活性與野生型相比大大降低[20]。無義突變體shr1種子干癟、胚乳不透明、淀粉減少,錯義突變體shr1a種子嚴重萎縮但胚乳透明,兩者都導致種子重量降低。其突變基因位于第1染色體,編碼AGPase的一個大亞基,L2。AGPase活性測定發現,shr1的AGPase活性為野生型的40%,shr1a的AGPase活性則為野生型的60%。此外,AGPase受到效應子3-磷酸甘油酸 (3-phosphoglycerate,3-PGA)和無機磷的變構調控,但純化重組酶的動力學分析表明,這些AGPase突變體的催化活性和變構調控都嚴重受損。這些數據表明,L2亞基對AGPase異源四聚體酶的催化活性和變構調控特性起著重要作用[51]。shr2的皺縮程度比shr1更大,其突變基因位于第 8染色體上,編碼AGPase的一個小亞基,S2b。shr2的AGPase活性更低,只有野生型的5%[51]。Satoh等[53]發現Pho1突變體呈皺縮、干癟狀,粒重降低,總淀粉含量大大降低,淀粉顆粒結構發生改變。突變基因編碼質體型淀粉磷酸化酶(Pho1),表明Pho1對淀粉生物合成具有一定的作用。此外,Pho1突變體表型受溫度影響,低溫(20℃)條件下種子呈干癟狀,高溫(30℃)條件下成熟種子大多是飽滿的,說明Pho1是在低溫下促進淀粉生物合成的,高溫下存在其他因子能夠補充Pho1的功能。

4 結論與展望

近年來,水稻全基因組測序工作的完成和現代生物技術的飛速發展為水稻胚乳淀粉突變體的研究提供了廣闊的前景。根據這些突變體的突變基因類型,可大致分為3類。第一類突變體的突變基因編碼淀粉合成相關酶,如Wx(GBSSI)、ae(BEIIb)、flo5(SSIIIa)、sug1(ISA1)、shr1(AGPase,L2)、shr2(AGPase,S2b)等。這些關鍵酶的基因已經被克隆,功能已基本明確。此外,通過構建不同淀粉合成相關酶的雙突變體組合研究揭示了多種酶協同其他蛋白共同行使生物學功能,如通過對ssIIa/ssIIIa雙突變體的研究發現了SSIIa與SSIIIa能通過SP起作用,兩者行使不同但重疊的功能。目前已證實水稻淀粉生物合成酶通過蛋白質-蛋白質相互作用形成多種具有活性的多酶復合體[79],但多酶復合體形成的具體調控機制尚不明確。第二類突變體的突變基因編碼淀粉合成基因的調控因子,如osbzip58編碼一個含有堿性亮氨酸拉鏈結構域的轉錄調控因子,能與6個淀粉合成相關基因的啟動子特異性結合；RSR1編碼一個AP2/EREBP家族轉錄因子,負向調控儲藏淀粉合成類基因的表達；flo2編碼一種具有TPR結構的蛋白,調節淀粉合成相關基因的表達；du1-3編碼剪接因子,對Wxbpre-mRNA進行剪接等(表1、圖1)。這些突變基因有些還未被克隆,有些雖已被克隆,但調控的分子機理尚不十分清楚。此外,這些調控因子之間是否存在互相聯系還有待進一步研究。第三類突變體的突變基因的編碼產物通過調節物質轉運以及其他生理過程來間接影響淀粉的生物合成,如G1F1編碼一種細胞壁轉化酶,其通過調控籽粒灌漿初期的碳源分流來影響儲藏物質的累積速度；OsRab5a編碼一個GTP酶,參與胚乳細胞液泡中蛋白質的轉運；OsNDUFA9編碼線粒體的復合物Ⅰ亞基,該蛋白受損影響胚乳正常發育。第二和第三類突變體仍有待挖掘和深入研究。水稻胚乳淀粉的合成與調控是一個非常復雜又精細的過程,通過對現有突變體的研究,已經有了一定程度的了解,但距離完全闡明還很遠。

水稻胚乳淀粉突變體研究不僅具有理論意義,也具有培育優質及特殊功能品種的實踐意義。突變體的利用可加快改良原有種質資源和培育新種質資源,現已成為作物改良的有效手段之一[80]。目前獲得水稻淀粉突變體的誘變方法主要有物理誘變(γ射線)、化學誘變(MNU、EMS)和插入誘變(T-DNA插入)(表1)。將傳統誘變方法與目標突變體定向篩選技術(如TILLING技術[81])相結合能快速有效地從誘變群體中獲得鑒定結果,加快突變體的挖掘與創新,豐富現有的育種材料。此外,利用突變體研究逐步闡明的淀粉合成分子基礎與調控代謝網絡,為運用分子標記輔助選擇以及轉基因等現代分子育種技術開展稻米品質改良提供了堅實的理論基礎。將常規育種技術與現代分子育種技術有機結合,能夠加快水稻淀粉品質性狀的遺傳改良,進一步提高現有稻米的品質,以滿足人們日益增長的多樣化消費需求。