B族黃曲霉毒素抗原合成設計及特異性、廣譜性抗體制備與特性分析

張海棠 王曉斐 職愛民 王亞楠 王自良

(1河南科技學院動物科技學院,河南新鄉 453003；2河南旭瑞食品有限公司,河南焦作 454150)

目前,在食品污染中已發現的黃曲霉毒素(aflatoxin,AF)共有20多種,其中毒性強、污染廣、含量高的是B族AF(B group aflatoxins,BGAFs)。BGAFs具有致癌性、致畸性和免疫抑制性等多種毒害作用,已成為食品AF污染檢測的主要對象[1]。BGAFs包括AFB1和AFB2兩種,兩者與食品污染的關系密切,若兩者同時存在,以 AFB1污染為主,AFB2污染伴隨AFB1,具有毒性疊加效應[2]。食品BGAFs污染最大殘留限量標準(maximum residue limits,MRLs)的規定有兩種,一是包括我國在內部分國家采用AFB1的MRLs,如我國《GB 2761-2017食品中真菌毒素限量》[3]規定,玉米及其制品≤20 μg·kg-1、稻谷及其制品≤10 μg·kg-1、小麥及其制品≤5 μg·kg-1；二是部分國家采用BGAFs總量(B1+B2)的MRLs,如歐盟≤4 μg·kg-1、日本≤10 μg·kg-1、美國 FDA≤15 μg·kg-1。目前食品BGAFs污染的分析方法主要有儀器分析和免疫分析,基中免疫分析因具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、可大批量篩檢和現場檢測等優勢,已成為不可或缺的技術手段。建立BGAFs免疫分析方法的關鍵是獲得優秀的抗體,而半抗原設計和抗原合成是制備優秀抗體的前提[4]。關于BGAFs抗原合成方法的研究國內外已有相關報道[5-6],但有關不同半抗原分子設計、抗原合成及抗體特性比較分析方面的研究尚鮮見。本研究以AFB1為反應起始原料,通過不同AFB1半抗原分子設計與抗原合成方法制備多克隆抗體(polyclonal antibody,pAb),并對其特性進行分析,篩選出最佳半抗原分子設計與抗原合成方法,以期為靈敏度高、廣譜、特異性強的BGAFs高質量單克隆抗體的制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2標準品,新加坡 Pribolab公司；陽離子化牛血清白蛋白(cationic bovine serum albumin,cBSA)、羊抗兔酶標二抗(GaRIgG-HRP),美國Sigma公司；酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)所用稀釋液為 0.01 mol·L-1pH值7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS),洗液為含 0.5 g·L-1Tween-20(PBST)的PBS；封閉液為含50 g·L-1豬血清的PBST；包被液為0.1 mol·L-1pH值9.6的碳酸鹽緩沖液(carbonate buffer solution,CBS)。試驗動物為2月齡,體重1±0.2 kg的雄性新西蘭白兔,共18只,隨機分為6組,每組3只,由新鄉醫學院實驗動物中心提供。

1.2 BGAFs人工抗原合成設計

根據AFB1分子結構上存在的活性位點(圖1),擬采用6種方法制備人工抗原AFB1-BSA(表1)。

圖1 AFB1結構式Fig.1 Molecular structure of AFB1

1.3 BGAFs人工抗原鑒定

1.3.1 UV掃描 用甲醇溶解AFB1,配制1 mg·mL-1AFB1溶液；用4∶6(v/v)的甲醇 PBS溶液分別溶解BSA和 AFB1-BSA,配制 1 mg·mL-1的 BSA 和 AFB1-BSA溶液。在波長200～500 nm下進行紫外掃描,按照公式計算AFB1與BSA的分子結合比[18]:

式中,A為吸光值,儀器讀出；ε為摩爾消光系數,是常值；C為溶液中溶質濃度；L為光程,由儀器決定。

1.3.2 SDS-PAGE鑒定 選擇濃縮膠與分離膠濃度分別為5%和12%,電壓分別為90 v和60 v,加樣量為每孔10μL,蛋白質含量為每孔10 μg。采用 CWD-9403D型紫外分析儀系統軟件(北京六一儀器廠)計算AFB1與BSA的分子結合比。

1.4 AFB1pAb制備

用6種不同方法合成的人工抗原分別免疫新西蘭白兔,每種抗原免疫1組,共6組,每組3只。免疫劑量按AFB1-BSA中BSA的量計算,每只100 μg,體積1 mL,背部皮下4～6點注射,共免疫5次,每次間隔3～4周,第5次免疫后2周耳緣靜脈采血,5 000 r·min-1離心10 min分離多抗血清,采用飽和硫酸銨鹽析法純化多抗血清,制備AFB1pAb[19]。

1.5 AFB1pAb特性分析

1.5.1 效價測定 間接ELISA[20]。第一步,包被酶標板,用CBS稀釋包被抗原AFB1-OVA,每孔100μL,37℃溫育2 h,用 PBST洗板3次；第二步,封閉酶標板,加封閉液,每孔250μL,37℃溫育1 h,洗板3次；第三步,加抗血清,加入用PBS倍比稀釋的抗血清,每孔50μL,37℃溫育15 min,洗板3次；第四步,加酶標抗體,加入工作濃度的GaMIgG-HRP,每孔50μL,37℃溫育25 min,洗板3次；第五步,加酶底物,每孔60μL,室溫下顯色15 min；第六步,終止反應,加終止液2 mol·L-1H2SO4,每孔 100μL,用酶標儀讀值,記錄結果。反應設陰性對照(negative control,NC)和PBS空白對照(black control,BC),每次檢測3個重復。酶標儀測定 A450值,以陽性/陰性(P/N)＞2.1,且 P-N＞0.2為標準,計算抗體效價。

1.5.2 敏感性鑒定 間接競爭ELISA(indirect competitive ELISA,icELISA)測定AFB1pAb對 AFB1的半數抑制濃度(50%inhibitory concentration,IC50),以此判定敏感性[21]。

1.5.3 特異性鑒定 以 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2為抑制劑,icELISA法測定各抑制劑的IC50,然后按照公式計算交叉反應率(cross reaction percentage,CR)[22]:

2 結果與分析

2.1 BGAFs人工抗原鑒定結果

2.1.1 UV鑒定結果 由圖2可知,在200～500 nm波長范圍內,BSA的特征峰位于278 nm,AFB1的特征峰位于363 nm,OAE、MOA、MA、SA、EP、EED 6 種方法合成的人工抗原AFB1-BSA均含有BSA和AFB1的特征峰,說明以上6種方法均可合成人工抗原AFB1-BSA。BSA與AFB1的分子結合比計算結果見表2。由表可知,以上6種方法合成的人工抗原AFB1-BSA,其分子結合比不同,其中,OAE和MA兩種方法效果較好。

2.1.2 SDS-PAGE鑒定結果 由圖3可知,6種人工抗原AFB1-BSA的條帶均滯后于BSA的條帶,說明AFB1-BSA的分子量大于BSA,由此可以判定AFB1-BSA合成成功。

2.2 AFB1pAb特性分析

2.2.1 效價測定 免疫結束后每組挑選1只間接ELISA效價最高的免疫兔進行比較分析,由圖4可知,6只免疫兔的間接ELISA效價均達到了1∶(1×104),表明6種方法合成的AFB1-BSA均具有良好的免疫原性,其中,以OAE組和MA組免疫效果最好,效價達到了 1∶(1.28×104)。

表1 AFB1半抗原設計與抗原合成方法Table1 The hapten design and antigens synthesis of AFB1

圖2 AFB1-BSA的UV圖Fig.2 UV spectra of AFB1-BSA

表2 6種方法所制備AFB1-BSA的分子結合比Table2 Molecular binding ratio of AFB1-BSA prepared by six methods

2.2.2 敏感性分析 由圖5可知,6只免疫兔的icELISA抑制曲線具有良好的線性關系,OAE組敏感性最好,IC50為10.32 μg·kg-1,其他各組敏感性均遜色于OAE組。

圖5 AFB1pAb對AFB1的icELISA敏感性測定Fig.5 The sensitivity measurement of AFB1pAb to AFB1by icELISA

2.2.3 特異性與廣譜性分析 由表4可知,6種方法所制備的抗體均能100%識別AFB1,其中OAE法的特異性和廣譜性最好,IC50為 10.32 μg·kg-1,與 AFB2的CR為75.21%；與 AFG1、AFG2的 CR分別為 44.13%和14.72%。其他方法制備的抗體特異性很好,均能100%識別AFB1,但其敏感性和廣譜性不如OAE法所制備的抗體。綜上表明,制備針對BGAFs敏感性高、特異性強、廣譜性好的抗體,最好的抗原合成方法是OAE法。

表3 AFB1pAb對AFB1icELISA測定曲線的回歸方程、R2值和 IC50值Table3 The regression equation， R2and IC50 of AFB1pAb to AFB1by icELISA

3 討論

3.1 BGAFs抗原合成方法設計

BGAFs中AFB1、AFB2的分子量分別為312.27和314.29,屬于小分子半抗原,無免疫原性。依據半抗原-載體效應理論,只有與大分子蛋白質載體結合成人工抗原,才能獲得針對半抗原的特異性抗體,因此,抗原合成方法至關重要[23]。由于選擇不同活性位點和引入不同連接臂長度均會對小分子的性質和結構產生較大影響,進而影響產生抗體的質量[24]。本研究根據BGAFs的分子結構特征,分別選擇1位羰基、2位活潑氫、3位羥基和醛基、3位與4位之間雙呋喃環作為活性基團,通過不同的化學反應方式,分別引入可以利用的羧基、羥基、氨甲基等活性基團,實現了與載體蛋白偶聯合成人工抗原的目的。

表4 AFB1pAb 與 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2 的交叉反應Table4 The percent cross-reactivity of AFB1pAb with AFB1、AFB2、AFG1、AFG2

3.2 BGAFs人工抗原的合成路線

目前,關于BGAFs人工抗原合成方法的研究仍停留在經驗層面,多采用試錯法,盡管建立了多種人工抗原鑒定方法,但所制備人工抗原的免疫原性如何,最終還需通過動物免疫的效果得以證實[25]。本研究在參考大量相關文獻的基礎上,以AFB1作為反應起始物,采用 OAE、MOA、MA、SA、EP 和 EED 6種方法合成人工抗原,并通過UV、SDS-PAGE進行抗原鑒定,用動物免疫進行抗體特性分析,篩選出BGAFs抗體制備最為理想的抗原合成方法是OAE法,其優點在于反應體系易于構建,反應條件溫和,操作步驟簡單,產物產率較高。但就本研究所采用的技術路線的先進性而言,分子模擬、計算機輔助等技術方面的研究與應用仍有待提高[26-27]。

3.3 BGAFs人工抗原的免疫效果分析

本研究旨在篩選出BGAFs人工抗原合成方法,為靈敏度高、特異性強、識別譜廣的BGAFs高質量抗體的制備奠定物質和技術基礎,這就要求在BGAFs抗原合成設計中,一方面要考慮抗體對AFB1的特異性和敏感性,以滿足AFB1限量標準下的檢測技術要求；另一方面要考慮抗體對AFB2的敏感性和廣譜性,以滿足BGAFs限量標準下的檢測技術要求[28]。謝琿等[29]采用MA法合成AFB1-BSA,篩選出雜交瘤細胞3B9獲得AFB1mab,該抗體特異性識別AFB1,靈敏度達到1.04 μg·kg-1,與 AFB2、AFG1、AFG2、AFM1的 CR 分別為2.2%、33.9%、1.8%和 5.12%,與 AMF2無 CR,廣譜性較差。肖智等[30]采用 SA法合成AFB1-BSA,篩選出雜交瘤細胞3A12獲得AFB1mab,該抗體特異性識別 AFB1,靈敏度達到 6.1 μg·kg-1,與 AFB2、AFG1、AFG2、AMF1的 CR 分別為 7.8%、20.2%、0.6%和3.68%,與AFM2無CR,同樣存在廣譜性差的問題。本研究通過6種不同抗原合成方法合成BGAFs人工抗原AFB1-BSA,結果表明,OAE法效果最好,所產生AFB1pAb抗體效價高,間接ELISA效價達到1∶(1.28×104)；對 AFB1敏感性好,IC50為 10.32 μg·kg-1；特異性強,可 100%識別 AFB1,與 AFB2、AFG1、AFG2、AMF1、AFM2的 CR 分別為75.21%、44.13%、14.72%、16.36%和1.44%。本研究所設計的其他5種方法存在不同程度的缺陷,因此建議除開展研究工作之外,一般不予采用。

4 結論

本研究根據AFB1的分子結構特征和已有活性位點,設計出6種BGAFs抗原合成方法,通過UV、SDSPAGE鑒定和免疫動物所產生的AFB1pAb特性分析,獲得了高效價、敏感、特異、廣譜的AFB1pAb。表明抗原合成設計是制備高質量抗體的前提,OAE法是實現BGAFs高質量抗體制備的有效途徑,這為BGAFs免疫檢測方法的建立奠定了物質和技術基礎。