鹽酸羥胺誘變黃瓜的生長及光合特征

羅琳　劉鑒　孫小程　吉雪花

摘? ? 要： 為創造高光效型的黃瓜種質資源，以‘新泰密刺黃瓜（常規種）為材料，以鹽酸羥氨為誘變劑，通過對0.5%、1.0%、2.0% 3種濃度鹽酸羥胺誘變后的黃瓜M0代和M1代生長及光合特征進行分析，探明鹽酸羥氨是否能夠提高黃瓜光合作用。結果表明，誘變后黃瓜M0代和M1代種子發芽率均隨鹽酸羥胺濃度升高而下降，但與對照差異不顯著（M0代2%處理除外）;兩代種子發芽勢均隨誘變濃度的升高而下降，且差異顯著。誘變后M0代子葉表現出黃化、葉緣上卷、黏連卷縮、缺刻非全緣、下垂、無生長點等形態變異。處理后M1代子葉的葉面積，葉綠素含量及凈光合率（Pn）均較對照有所下降，但氣孔導度（Gs）無顯著變化;M1代子葉Fv/Fm、PSII與對照差異不大，而非光化學猝滅（qN）均顯著低于對照。誘變后M1代蕾期真葉（10片真葉）的葉面積、葉綠素含量及Pn值較對照顯著升高;真葉的胞間二氧化碳濃度（Ci）、氣孔導度（Gs）表現出與Pn一致的變化趨勢，因此誘變后M1代真葉光合屬于氣孔限制;M1代真葉的PSII值與對照差異不大，Fv/Fm整體上低于對照，但有隨濃度升高而增加的趨勢，qN值隨濃度升高顯著降低。綜合子葉和真葉的光合參數變化，認為0.5%～1%范圍內的鹽酸羥胺既能較少的傷害子葉，又能較好的促進真葉的光合及生長，可以作為創造黃瓜高光效種質資源的有效誘變劑。

關鍵詞： 黃瓜; 鹽酸羥胺; 子葉; 高光效; 誘變

Abstract： In order to create new cucumber materials with high light efficiency， hydroxylamine hydrochloride （HO-NH2·HCl） with 0.5%， 1% and 2% concentrations were used to ‘Xintaimici cucumber seeds（conventional species）. Growth indicators and photosynthetic parameters were analyzed to make sure whether there were positive effect of hydroxylamine hydrochloride on cucumbers photosynthesis. The results showed that seeds germination percentage of M0 and M1 decreased with the hydroxylamine hydrochloride concentration， but there were no significant differences between low concentrations and the control; while the germination energy of M0 and M1 decreased significantly with the concentration. After the mutation， cucumbers cotyledon showed morphological variations as followings： yellow， leaf margin roll-up（down）， adhesion， leaf margin serrate and meristem disappeared. Comparing with the control， values of leaf area， chlorophyll content and the net photosynthetic rates （Pn） of M1 cotyledons decreased significantly， but there was little fluctuation of the stomatal conductance （Gs）. There were little differences of Fv/Fm and PSII in the treatments and the control of the M1 cotyledon， but qN increased with the concentration. For the M1 budding stage， the values of leaf area， chlorophyll contents and Pn were higher than that of the control， values of Ci， Gs showed similar trend with Pn， so there was stomatal limitation of the M1 budding stage. There were little differences of PSII between treatments and the control in budding stage， but qN decreased significantly with the concentration. In a word， 0.5%-1% hydroxylamine hydrochloride can not only damage cotyledons less， but also promote the photosynthetic of true leaves; so it can be an effective mutagen to create new cucumbers germplasm with higher light efficiency.

Key words：Cucumber; Hydroxylamine hydrochloride; Cotyledon; Higher light efficiency; Mutation

黃瓜是種植面積最大、產量最高的設施反季節蔬菜。設施專用品種對耐弱光和高光效性有較高的要求。光合作用是植物最基本的生命活動，葉片光合速率與作物產量密切正相關，因此促進光合速率是提高作物產量的重要途徑。對水稻、小麥、玉米、棉花[1-7]等作物的研究表明，作物不同品種間的光合速率差異顯著，且這種差異可穩定遺傳[8]，這就意味著通過品種選育提高光合速率是可能的，而篩選高光效種質資源是高光效育種的前提和基礎。

誘變能引發基因突變，在保持原有優良性狀的基礎上提高突變頻率，擴大選擇譜，產生有益突變，還能打破原有基因的連鎖，促進遺傳重組，從而能在短時間內獲得豐富突變體以育成新品種。研究指出，利用航空誘變白樺能夠提高其凈光合率，但是對其葉片葉綠素含量影響并不顯著[9]。用秋水仙素溶液處理露地黃瓜，植株節間變短，莖變細，葉柄變短、變細，葉片變厚且顏色加深，葉面積增大，花器變大，果形指數減小，且秋水仙素濃度越高，效果越明顯[10]。有人用碳重離子對藻類進行誘變，最終獲得2株高光效微擬球藻突變藻株[11]。研究證明誘變后水稻通過增加葉脈密度提高光合能力[12]。相對于物理誘變，化學誘變對處理材料引起的生物損傷小，染色體畸變的比率較小，并且具有位點特異性和點突變等優點[13]。鹽酸羥胺是一種重要的有機合成中間體。它在醫學、農藥和化學領域有著廣泛的應用，但作為誘變劑處理種子的研究較少。鹽酸羥胺主要與胞嘧啶反應，作用于CG→AT上，屬于點突變的一種。但利用鹽酸羥胺誘變選育黃瓜高光效材料的研究尚在探索。本文通過對不同濃度鹽酸羥胺誘變下黃瓜后代發芽生長及光合參數的分析，探討鹽酸羥胺對黃瓜光合能力的影響，為豐富和完善黃瓜誘變育種途徑，創造高光效型的黃瓜種質資源奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

‘新泰密刺黃瓜（購買于新疆石河子蔬菜研究所，常規種）;鹽酸羥胺（HO-NH2.HCl，分析純99.9%）用少量乙醇溶解后蒸餾水配制成0.5%、1%和2% 3種濃度。

1.2 儀器與設備

SPAD-502Plus便攜式葉綠素儀， CIRAS-3光合儀， IMAGING-PAM調制熒光成像系統。

1.3 試驗設計

1.3.1 試驗處理 2016年4月于石河子大學農學院實驗站開展。用0.5%、1%、2%濃度的鹽酸羥胺浸泡黃瓜干種子各600粒（200粒為1次重復），以清水處理的種子為對照。30 min后將浸泡的種子清洗干凈，室溫下浸種6 h，然后放入28 ℃恒溫箱催芽，統計發芽率、發芽勢。將露白后的種子播在穴盤中（V草炭∶V蛭石=2∶1）育苗，并調查統計子葉變異性狀及變異率。3葉1心時移栽到花盆中，每盆2株。誘變植株進入現蕾期時單株套紗網袋隔離，使其自交，獲得M1代種子。2017年4月將M1代種子露地直播，按各處理播種種子數統計發芽指標，每處理3次重復。待子葉展平時各處理按移栽株數的10%（對照和0.5%處理各選45盆;1%處理選30盆，1.5%處理選18盆），測量子葉葉面積、葉綠素含量;光合速率和葉綠素熒光參數。各處理隨機選5株測定。當M1代黃瓜現蕾時，選取倒3葉測量真葉葉面積、葉綠素、光合速率、葉綠素熒光等指標，取樣數量同子葉期。以未經誘變的材料為對照。

1.3.2 測定項目與方法 M0、M1的發芽率從催芽后第2天開始統計，共統計9 d，第6天統計發芽勢。誘變后的種子播到穴盤，第2天開始觀察子葉出土及形態變異情況。重點觀察子葉顏色、子葉邊緣完整性和水平展開度以及生長點發育情況。葉面積測定采用方格紙法[14]，將葉片壓在坐標紙上，用鉛筆把黃瓜子葉輪廓準確地描在事先準備好的坐標紙上（小方格為2 mm×2 mm），然后統計葉輪廓占的小方格數量（不到格子一半不計數，超過格子一半的計一格）。最后將葉輪廓的小方格數相加，即為葉面積。葉綠素含量在子葉期（子葉展平，心葉展露）和蕾期（10片真葉）從上往下第3片葉，采用SPAD-502Plus便攜式葉綠素測定儀測定[15]。用CIRAS-3光合儀分別測定M1代黃瓜子葉和蕾期真葉的凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（E）等參數。于2017年4月和5月選晴天，于上午11：00—14：00在室內測定光合速率，室內光照強度為800 ?mol·m-2·s-1，溫度27～30 ℃。每個處理重復測定3次，結果取平均值。采用IMAGING-PAM調制熒光成像系統測定葉綠素熒光參數。

1.4 數據分析

數據處理采用SPSS 17.0 軟件，差異顯著性采用單因素均值LSD比較法，制表、繪圖采用Excel 2010。

2 結果與分析

2.1 鹽酸羥胺誘變對黃瓜種子發芽的影響

由表1可知0.5%、1%和2%鹽酸羥胺處理時M0代黃瓜種子發芽率分別為94.3%、93.3%和80.0%;相應的發芽勢分別為61.0%、56.7%和42.7%。M1代相應濃度的種子發芽率分別為96.3%、96.6%和95.4%，發芽勢分別為75.7%、77.6%和65.3%?？芍?種濃度下，M0代和M1代黃瓜種子發芽率均隨鹽酸羥胺濃度的升高而下降，除M0代2.0%處理的種子發芽率顯著降低外，其它處理間及其與對照間發芽率差異均不顯著。但兩代的發芽勢卻隨鹽酸羥胺濃度的變化出現了顯著差異。

2.2 鹽酸羥胺誘變對M0代黃瓜子葉形態變異的影響

參照楊小苗[16]的方法將葉片突變形態分為以下幾類。由圖1可知鹽酸羥胺誘變使M0代黃瓜子葉出現多性狀變異，包括子葉發黃（圖1-A），葉緣上卷（圖1-B），子葉黏連卷縮（圖1-C、1-E），子葉缺刻非全緣（圖1-D、1-F），子葉下垂，無生長點（圖1-E、1-F）等。調查表明（表2）0.5%濃度鹽酸羥胺處理的子葉黃化植株平均有6.0株，子葉上卷類型有4.0株，子葉粘連類型有5.0株，葉緣缺刻類型有9.0株，子葉下垂類型有2.0株，無生長點類型有4.0株，總變異株率15.00%;1%和2%濃度處理的子葉總變異率分別為30.17%和31.50%。整體上，隨著鹽酸羥胺濃度的升高M0代黃瓜子葉變異株比例升高，但變異類型差異不大。

2.3 鹽酸羥胺誘變對M1代黃瓜葉面積的影響

子葉是種子結構中重要的組成部分，黃瓜子葉由于肥厚，面積大，因此在種子萌發以及幼苗生長初期，能夠進行光合自養，提供養分和能量[17-18]。試驗結果表明0.5%、1.0%、2.0%濃度鹽酸羥胺處理后黃瓜幼苗子葉葉面積分別比對照下降了34.88%、27.96%及45.35%，與對照差異顯著（圖2）。整體上各濃度鹽酸羥胺均能抑制黃瓜子葉的生長。對于蕾期真葉，由圖2右側可知，誘變M1代黃瓜真葉葉面積均較對照有一定的增大，單葉葉面積在220 cm2左右，處理和對照無顯著差異。

2.4 鹽酸羥胺誘變對M1代黃瓜葉綠素含量的影響

葉綠素是光合作用中最重要的色素分子，排列在類囊膜上，在光能的吸收和轉換中起著重要作用，直接影響植物的光合速率。試驗結果表明0.5%、1.0%、2.0%濃度處理的M1代黃瓜子葉葉綠素含量分別比對照下降了0.23%、4.63%和3.17%。而誘變處理后真葉葉綠素含量顯著上升，分別比對照提高了11.92%、19.13%和15.53%，與對照差異顯著（圖3）。

2.5 鹽酸羥胺誘變對M1代黃瓜光合作用的影響

凈光合率能綜合反映植物的光合生理特性，是植物光能利用能力強弱的直接指標。試驗結果表明，0.5%、1.0%、2.0%濃度處理的M1代黃瓜子葉凈光合速率分別比對照下降了62.50%、58.70%、76.01%;相應濃度處理的M1代真葉，凈光合速率分別比對照增加2.11倍、3.89倍和4.41倍。Ci的變化方向是確定光合速率變化的主要依據。試驗結果表明，子葉期高濃度鹽酸羥胺使M1代黃瓜Ci與對照差異顯著，蕾期真葉差異不顯著。0.5%、1%、2%濃度處理的M1代黃瓜子葉，Ci分別比對照下降4.95%、0.84%和升高了4.02%，真葉Ci分別比對照升高了2.30%、4.24%和6.55%。氣孔是植物葉片與外界進行氣體交換的主要通道，氣孔導度表示的是氣孔張開的程度，影響光合作用、呼吸作用及蒸騰作用，與蒸騰作用成正比。試驗結果表明，0.5%、1%、2%濃度處理的M1代子葉氣孔導度分別比對照下降24.90%、7.91%和升高18.64%，真葉氣孔導度分別較對照增加了0.36倍、0.93倍和1.64倍。誘變后M1代子葉的蒸騰速率隨鹽酸羥胺濃度升高而增大，0.5%、1%濃度處理的子葉，蒸騰速率分別比對照下降了36.08%、11.36%，2%濃度處理的子葉蒸騰速率較對照升高15.91%。相應濃度處理的蕾期真葉，蒸騰速率分別比對照升高了26.70%、19.61%和79.08%，這與氣孔導度的變化趨勢一致（圖4）。

2.6 鹽酸羥胺誘變對M1代黃瓜葉綠素熒光動力學參數的影響

Fv/Fm表示暗適應下PSⅡ的最大光化學效率，反映植物潛在的光化學能力，常作為光抑制程度的重要指標。試驗結果表明0.5%、1%、2%濃度處理的M1代黃瓜子葉Fv/Fm值分別比對照升高了1.82%、1.33%和1.70%;真葉Fv/Fm值分別比對照下降了3.20%、3.20%和1.70%（圖5）。子葉PSII值分別比對照升高了0.35%、0.88%和1.03%，而真葉PSII值分別比對照升高了2.63%、3.77%和2.58%。誘變處理后M1代黃瓜子葉和真葉的電子傳遞速率無顯著變化。光化學熒光淬滅系數（qN）表征了植物自我保護的程度。研究表明0.5%、1%、2%濃度鹽酸羥胺處理的M1代黃瓜子葉，qN值分別比對照下降了57.13%、32.72%和2.67%;相應濃度處理下的黃瓜真葉，qN值分別比對照下降了16.67%、23.79%和25.98%。

3 討論與結論

葉片是植物進行光合作用和蒸騰作用的主要器官，葉面積大小對植物生長發育、抗逆性及產量的影響很大。本試驗中不同濃度的鹽酸羥胺處理后黃瓜子葉葉面積差異不顯著，但都低于對照，說明鹽酸羥胺處理對黃瓜子葉葉面積有一定的抑制作用。這應該與鹽酸羥胺處理種子時對黃瓜胚乳和子葉造成的傷害有關，導致子葉葉面積明顯下降。

匡廷云院士在《作物光能利用效率與調控》一書中提出了“外在光能轉化效率（合理株型）和內在光能轉化效率（高光效）”的高光效育種路線[17]。此后國內很多學者在水稻、大麥、大豆、棉花、油菜[18-23]等作物研究中建立了高光效育種程序和方法，育成了一批高光效、高產的新品種。高光效育種目前主要幾種篩選方法：一是篩選光呼吸強度低，二氧化碳補償點低的育種材料;二是篩選凈光合速率高的材料;三是篩選氣孔導度大的材料;四是選擇Ribisco酶活性高的材料。牛寧等[24]對150份大豆光合氣體交換參數的分析發現高光效種質并不僅僅是具有高的凈光合速率，較高的氣孔導度及高水分利用效率也與高光效密切相關。因此提出在高光效育種實踐中，不能單憑某一光合參數的高低評價光合能力，而應該綜合運用多個參數全面評價。

本試驗中3種濃度鹽酸羥胺誘變處理M1代黃瓜子葉葉綠素含量有所下降，但蕾期真葉葉綠素含量顯著升高，鹽酸羥氨表現出促進真葉葉綠素合成的作用。用氮離子束輻照可誘發黑稻葉綠素含量增加，但劑量高時導致葉綠素突變，出現淺黃突變體[25]。本研究中黃瓜真葉光合速率的上升主要與葉綠素含量上升，氣孔導度增大，胞間CO2濃度上升，光合碳同化底物增多有關。另一方面蒸騰作用帶走熱量，降低葉片溫度，保護葉片不受熱害，延遲了真葉的衰老。鹽酸羥胺處理后，子葉的蒸騰速率增加不顯著，應該與葉片發育階段有關。子葉尚未發育完全，葉面積處在不斷增長狀態，表皮上的氣孔數目、大小仍在不斷變化，因此子葉期的光合速率主要與葉綠素含量有關，與氣孔導度關系不大。進入蕾期，葉片發育成型，每片葉的氣孔數目、大小不再變化，此時改變的主要是氣孔開閉程度，因此光合速率主要受氣孔導度限制。這與朱玉、陸璃、劉影、王靜等[26-29]研究結果類似。

葉綠素熒光參數也是表征光合能力的重要指標。正常環境下高等植物葉片的Fv/Fm為0.80～0.83。本研究顯示，鹽酸羥胺處理時，整體上黃瓜子葉和真葉的Fv/Fm值在上述范圍內，與對照差異不顯著，表明鹽酸羥胺處理并沒有對黃瓜葉片的PSII效能和PSII反應中心的潛在活性造成傷害。非光化學淬滅系數（qN）反映了植物是否受到過剩激發能的傷害。本試驗中誘變處理后黃瓜子葉的qN隨著鹽酸羥胺濃度升高而升高，真葉的qN隨鹽酸羥胺濃度的升高而下降。這表明誘變后子葉用于熱耗散的能量增加，誘變使黃瓜子葉產生了過剩光能，造成了光損傷，這與之前的葉綠素含量降低，凈光合速率降低相符合。真葉qN下降說明處理后黃瓜葉片PSⅡ反應中心開放程度加大，電子傳遞速率上升，使得更多光能轉換為電子繼續傳遞下去，因此凈光合速率表現出增加的趨勢，這與前人報道一致[30-31]。

近年來隨著光合測定儀器的不斷改進，凈光合速率、氣孔導度、水分利用效率等光合生理指標的相關性成為高光效育種的研究熱點。本研究中鹽酸羥胺誘變后黃瓜真葉的凈光合速率、氣孔導度都有顯著升高，因此鹽酸羥胺可以作為黃瓜高光效育種材料的誘變劑。

本研究表明，鹽酸羥胺處理黃瓜種子時，M1代真葉長勢優于對照，子葉生長雖有一定的抑制，但不影響后期生長。因此，0.5%～1.0%的鹽酸羥氨為誘變劑有望創造出高光效型黃瓜種質資源。研究只從生長及光合生理層面展開了突變體的篩選，對于誘變后突變的具體位置、突變基因并未進行深入研究。

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