柱前衍生-超高效液相色譜法測定油莎豆餅粕中17種氨基酸的含量

陸雨順，趙麗娟，宮瑞澤，陳建波，李志滿，孫印石

（中國農業科學院特產研究所，長春 130112）

油莎豆為莎草科（Cyperaceae）莎草屬（Cyperus）油莎草種（Cyperus esculentus L.）1 年生植物（別名：油莎草、糖根果、地下板栗），原產于非洲及地中海沿岸國家，是我國近年來引進的一種優質、高產、綜合利用前景廣闊的經濟作物[1-5]。其塊莖油莎豆（Cyperus beans）產油量約為大豆4 倍、油菜的2 倍，是我國大力推廣的新型油料作物，已被列入《全國種植業結構調整規劃（2016-2020）年》推薦作物品種。它適應性極強，適宜在荒地、灘涂地及鹽堿地等土地上種植[6]。

2018 年11 月22 日，科技部農村司在北京召開了油莎豆產業科技創新座談會，討論如何通過促進油莎豆產業發展來替代部分大豆產品，從而解決大豆進口比例過高的問題。目前，國內油莎豆餅粕主要用作飼料和肥料，產品附加值低、造成極大的浪費。國內針對油莎豆餅粕中氨基酸含量鮮見相關報道。本試驗采用超高效液相色譜法（UPLC）同時檢測油莎豆餅粕中17種氨基酸的含量，為進一步挖掘油莎豆在食品、飲料、醫學等方面的應用價值提供理論依據。

1 材料

1.1 試驗材料

油莎豆，采購自吉林省吉林市農貿市場，經吉林農業大學李偉教授鑒定為莎草科植物油莎草（C.sculentusL.）的塊莖。

1.2 試驗試劑

鹽酸（分析純，北京化工廠）；乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；AccQ·Tag 氨基酸試劑包（包括氨基酸專用衍生劑 AccQ Fluor Buffer、AccQ Tag Eluent A 溶液（0169190771）、硼酸鹽緩沖液、17 種氨基酸混合標準液（組氨酸、絲氨酸、精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸，除半胱氨酸濃度為1.25mol/mL 外，其余氨基酸濃度均為2.50mol/mL）（美國 Waters 公司）。

1.3 試驗儀器

ACQUITY H-Class超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；MS204S 電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；TGL-16G高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；Milli-Q Advantage A10 超純水器（美國密理博公司）；JP-100ST超聲儀（廣州市潔盟超聲波清洗設備有限公司）；XW-80A 微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）。

2 方法與結果

2.1 標準溶液的配制

以17 種氨基酸混合標準液為母液，用超純水配制成濃度分別為 25、50、250、500、1 250mol/L的混合氨基酸標準溶液。

2.2 供試樣品溶液的制備

油莎豆餅粕的制備按文獻方法[7]，將干燥后的油莎豆粉碎，過20～40 目篩，采用正己烷60 ℃恒溫水浴鍋中回流提取2 次，每次9 h，抽濾得到萃取液及固形物，將固形物室溫脫溶制得油莎豆餅粕。按文獻方法[8]，準確稱取餅粕樣品粉末0.50 g，置于30 mL水解管中，加入6 mol/L 鹽酸20 mL，渦旋混勻后，置于110 ℃水解24 h，水解完全后冷卻至室溫，取800L 上清液于試管中，80℃加熱揮干溶劑，加入2 mL 超純水復溶，渦旋30 s，使其充分溶解。采用0.22m 濾膜過濾樣品至進樣瓶，待衍生化。

2.3 衍生化反應

2.4 色譜條件

AccQ-TagUltraC18 色譜柱：100mm 2.1mm，1.7m；柱溫：49 ℃；流動相：A 為 AccQTag Eluent A 溶液，B為10%乙腈水，C為水，D為乙腈；梯度洗脫程序：見表1；進樣體積：1L；檢測波長：260 nm。17 種氨基酸對照品和餅粕樣品色譜圖見圖1。

圖1 17 種氨基酸標準品（A）及油莎豆餅粕樣品（B）的UPLC圖Fig.1 UPLC of 17 amino acid standards(A)and soybean meal of Cyperus Beans samples(B)

表1流動相梯度洗脫程序Table1 Mobile phase gradient elution procedure

2.5 方法學考察

2.5.1 線性范圍、檢出限和定量限 配制的系列濃度混合氨基酸標準溶液衍生后進樣測定，以氨基酸溶液濃度X（mol/L）為橫坐標、峰面積Y 為縱坐標，繪制17 種氨基酸回歸方程，結果見表2。從表2 可以看出，17 種氨基酸在25～1 250mol/L 線性關系良好，決定系數R2為0.942～0.997。以3 倍信噪比（S/N=3）計算檢出限（LOD），以10 倍信噪比計算定量限（LOQ），結果見表2。

表2 17 種氨基酸的回歸方程、決定系數（R2）、檢出限和定量限Table 2 Regression equations,determination coefficients(R2),LOD and LOQ for determination of 17 amino acids

2.5.3 重復性試驗 準確稱取0.5 g 油莎豆餅粕樣品3 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件上機測試，對各成分峰面積積分，得17 種氨基酸RSD 為0.10%～4.77%，表明樣品的重復性良好。

2.5.4 穩定性試驗 精密吸取“2.2”項下同一樣品供試品溶液1L，分別在 0、2、4、8、16、24 h 按“2.4”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積。結果發現，17 種氨基酸的RSD 為1.84%～2.13%，表明該試驗在24 h 內穩定性良好。

2.5.5 加樣回收試驗 精密稱取9 份已知氨基酸含量的餅粕樣品粉末0.3 g，按低、中、高劑量加入適量的17種氨基酸標準品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定峰面積計算含量，計算氨基酸回收率。結果發現，17 種氨基酸平均加樣回收率為98.22%～100.01%，RSD 為1.70%～2.44%，表明加樣回收率良好。

2.6 油莎豆餅粕中氨基酸含量檢測

油莎豆餅粕樣品中氨基酸含量采用外標法定量，具體含量見表3。從表3 可以看出，油莎豆餅粕中富含參與蛋白質合成的17 種氨基酸，總量為95.7 g/kg，其中，精氨酸、天冬氨酸和谷氨酸是最主要的3 種氨基酸，分別占總氨基酸的31.02%、15.92%和16.93%；半胱氨酸為油莎豆中的第1 限制性氨基酸，在餅粕中未檢出；8 種人體必需氨基酸（甲硫氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸、賴氨酸）總量為14.4 g/kg，占總氨基酸的15.04%，其中，賴氨酸和異亮氨酸占總氨基酸4.4%和3.8%，最接近FAO/WHO 模式譜參考值；呈味氨基酸總量為88.1 g/kg，占總氨基酸的92.06%，其中，鮮味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸）、甜味氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸）和苦味氨基酸（組氨酸、精氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸）含量分別為32.9、10.0 和45.2g/kg。以上氨基酸分析結果表明，油莎豆餅粕營養價值較高。

表3 油莎豆餅粕中氨基酸含量Table 3 Amino acid content of soybean meal of cyperus beans samples （g/kg）

3 結論與討論

本試驗采用酸水解法將油莎豆餅粕水解后，通過柱前衍生高效液相色譜法測定17 種氨基酸成分，并進行一系列方法學評價。結果表明，該方法簡便、重復性好、精密度高，可用于油莎豆餅粕中氨基酸的含量測定。

氨基酸是生物有機體的重要組成部分，在生命現象中起著至關重要的作用。對餅粕中的氨基酸成分進行分析是開發油莎豆餅粕的基礎工作之一。通過對油莎豆餅粕中氨基酸含量分析發現，油莎豆餅粕中氨基酸以精氨酸含量最高，其次是天冬氨酸、谷氨酸和賴氨酸含量，分別占總氨基酸的32.5%、16.7%、17.8%、4.4%；油莎豆餅粕中富含人體所需的必需氨基酸，占總氨基酸含量的15.0%。此外，根據Rotzoll 等[9]對氨基酸滋味特征的描述，鮮味氨基酸天冬氨酸和谷氨酸在油莎豆餅粕中含量均較高，占總氨基酸的34.32%，保證了餅粕鮮美的口感；但纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、組氨酸、異亮氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸8 種苦味氨基酸含量占到總氨基酸的47.23%，會影響餅粕的口味，是后續開發產品需要著重關注的問題。本研究為后續油莎豆餅粕產品的精深開發提供了理論基礎。