重組人凝血因子Ⅷ藥物的結構改造及其類似物開發的研究進展

侯閃，尹駿，姚文兵，高向東*

（1.中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 210009；2.中國藥科大學江蘇省生物藥物成藥性研究重點實驗室，江蘇 南京210009）

血友病A是一種由凝血因子Ⅷ（Factor Ⅷ，FⅧ）基因缺陷（功能喪失、突變、缺失或基因倒位）引起的罕見的X連鎖的遺傳性出血性疾病，其特點是缺乏參與血液凝固的蛋白質FⅧ，其發病人數約占血友病患者總數的80% ～ 85%，每10 000名男性新生兒中就有1 ～ 2名血友病患者；根據臨床嚴重程度和基因突變類型，血友病A可分為重度、中度和輕度，FⅧ因子活性水平分別為不足正常水平的1%、1% ～ 5% 和 6% ～ 40%[1]。缺乏 FⅧ會使關節和軟組織自發性出血，進而導致血友病性關節病。血友病A患者也可能會因創傷或手術過程中凝血功能障礙造成失血過多，嚴重者可危及生命。

FⅧ蛋白替代療法是臨床治療血友病A的主要方法[1-2]。最初用于治療血友病A的FⅧ產品來源于血漿冷沉淀，雖然利用其進行間歇性治療能夠有效控制出血，但并不能改善因長期出血造成的關節損傷。在發達國家，一種更為理想的治療方法——預防治療逐漸成為血友病治療的標準。在預防性治療過程中，長期靜脈注射FⅧ以維持FⅧ水平在1%以上，在一定時間內可以使凝血功能恢復正常，從而達到防止出血的目的，這種策略通常用于重度或中度血友病A患者。20世紀90年代，重組FⅧ（如Kogenate?、Recombinate?）的開發克服了血漿來源FⅧ的一些缺點，包括潛在的病毒污染、血液制品來源有限及成本高等，但仍存在著蛋白穩定性差、產量低以及受到靜脈注射給藥方式的限制等問題。另外，抑制物的形成和FⅧ半衰期短是血友病A替代治療中的兩大關鍵問題[3]。為了解決以上問題，近年來人們利用蛋白質工程技術對重組FⅧ進行結構改造以獲得改構重組的FⅧ藥物，進一步改善了FⅧ蛋白的活性、穩定性及半衰期。同時基于FⅧ的作用機制，FⅧ抗體模擬類似物也不斷被開發出來。因此，本文對已上市或正在研究中的重組人FⅧ改構藥物及其類似物開發的研究進展進行綜述。

1 FⅧ的結構及其作用機制

FⅧ基因定位于X染色體長臂末端（Xq28），全長186 kb，包含25個內含子和26個外顯子，其編碼由2 332個氨基酸組成的成熟蛋白。FⅧ蛋白的結構域為A1-A2-B-A3-C1-C2（見圖1），這些結構域在FⅧ蛋白的功能中發揮著關鍵作用，每個結構域都有針對凝血級聯反應中不同組分的特定結合位點。在細胞內加工過程中，全長的人FⅧ（hFⅧ）蛋白在多個位點發生蛋白水解，其中最主要的切割位點是B結構域羧基末端的成對堿性氨基酸蛋白酶Furin的識別基序（R-X-R）。在Furin的作用下，FⅧ蛋白可產生2條多肽鏈，即重鏈（A1-α1-A2-α2-B）和輕鏈（α3-A3-C1-C2），α1、α2 和 α3 由 30 ～ 40個氨基酸組成，富含酸性殘基。2條鏈可以通過金屬依賴性的非共價結合作用形成異源二聚體，這是hFⅧ蛋白的主要分泌形式[4-5]。被分泌之后，血管內皮細胞產生的大的、多聚體的血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）可作為載體蛋白與FⅧ蛋白的A3結構域N末端區域和C2結構域結合形成FⅧ/vWF復合物，FⅧ蛋白在Arg372、Arg740和Arg1689處可被凝血酶（Ⅱa）切割，產生有活性的FⅧ（activated FⅧ，FⅧa），并與vWF分離[5]。FⅧa是活化的FⅨ（activated FⅨ，FⅨa）的輔助因子，在Ca2+和血小板Ⅲ因子（PF3）共同存在條件下，FⅨa和FⅧa形成FⅧ復合物，可以在內源性凝血途徑中激活FⅩ產生活化的FⅩ（activated FⅩ，FⅩa），FⅩa可在Ca2+和PF3共同存在的條件下，與FⅤ結合形成凝血酶原激活物，進一步激活凝血酶參與后續的凝血途徑以達到凝血目的。

圖 1 天然FⅧ的蛋白結構示意圖Figure 1 Schematic diagram of the protein structure of natural FⅧ

2 基于結構改造的重組FⅧ藥物的開發

目前，對FⅧ的結構改造主要包括刪除次要結構域（常規FⅧ）和長效化修飾（長效FⅧ），以下對這2個方面分別介紹。

2.1 常規FⅧ藥物的開發

20世紀90年代初，Bayer和Baxter兩大公司開發了最初的全長FⅧ產品Kogenate?和Recombinate?，兩者由于制造工藝的發展已演變成今天的Kovaltry?和Advate?。這些重組FⅧ產品與血漿來源的FⅧ類似，其中心B結構域有不同程度的截短，因此這些產品主要是由相對分子質量為170 000 ～ 280 000的蛋白異構體組成的混合物。20世紀90年代后期，人們意識到FⅧ中的B結構域（741 ～1 648）對其凝血催化活性并不是必需的[6]。與全長重組FⅧ相比，B結構域缺失的重組FⅧ（B-domain deleted recombinant factor Ⅷ，BDD-FⅧ）具有更好的穩定性和更高的分泌表達效率，而其活性并未受到影響。因此，在過去的十幾年中，多種重組BDD-FⅧ藥物已被開發并應用于臨床（見圖2）。

2008年上市的Xyntha?（Moroctocog alfa）是由Wyeth公司繼首個B結構域（744 ～ 1 637）缺失的重組FⅧ產品（ReFacto?）開發的后續產品，又名ReFacto?AF，其保留了B結構域中的14個氨基酸肽段。與ReFacto?相比，Xyntha?通過無白蛋白細胞培養工藝生產，在親和層析中使用合成肽親和配體（TN8.2）取代了小鼠單克隆抗體，并在純化過程中增加了35 nm病毒過濾步驟，使藥物安全性更高，而藥動學參數與前者并無差異[7]。

韓國Green Cross公司開發的Greengene F?（beroctocog alfa）是一種高度同源的B結構域（741～1 648）完全缺失的重組FⅧ產品，其分別以重鏈（A1-A2）和輕鏈（A3-C1-C2）的形式進行表達純化而得到的均一產物，該產品于2008年在韓國上市。在生產工藝開發中，Greengene F?通過添加有機溶劑/洗滌劑（S/D）滅活病毒、采用20 nm孔徑濾膜去除病毒以及使用無白蛋白制劑配方等措施，最大限度地降低了病毒污染的風險，提高了藥物安全性[8]。

Novo Nordisk公司于2013年上市的NovoEight?（turoctocog alfa）是一類B區截短（751 ～ 1 637）的重組FⅧ產品，其保留了包括編碼天然B結構域N 末端（741 ～ 750）和 C 末端（1 638 ～ 1 648）在內的21個氨基酸，同時保留了B區O-糖基化位點，可用于糖基化修飾。在NovoEight?中，1 680位酪氨酸被完全硫酸化，使FⅧ與vWF的結合親和力高于之前的重組FⅧ產品，從而最大限度地減少了未結合的FⅧ的循環和FⅧ的清除[9]。NovoEight?已被證明具有與全長重組FⅧ產品（Advate?）相似的藥動學特性[10]。在世界血友病聯盟（WFH）2018年世界大會上，Novo Nordisk公布了一項有關NovoEight?長期穩定性實驗的結果，在高儲存溫度和濕度條件下，NovoEight?仍然能夠保持其效價強度，這一發現在一定程度上解決了該藥物制劑的儲存問題。

2015年上市的首個利用人細胞系HEK293F（human embryonic kidney，人胚腎細胞）生產的Nuwiq?（simoctocog alfa）是由 Octapharma公司開發的一類B區截短（749 ～ 1 648）型重組FⅧ產品，其保留了天然B結構域N端8個氨基酸，并添加了額外的8個氨基酸短肽（QAYRYRRG）。與之前在中國倉鼠卵巢（Chinese hamsters ovary，CHO）細胞系或乳倉鼠腎（baby hamster syrian kidney，BHK）細胞系中生產的重組FⅧ不同，利用人細胞系表達獲得的重組FⅧ的主要優勢是獲得了類似人類的翻譯后修飾（post-translational modification，PTMs）模式，使其類似于內源性FⅧ分子，不攜帶非人源的抗原表位，因此在降低藥物免疫原性和減少抑制物的形成方面具有一定優勢[11-12]。

目前，Afstyla?是由CSL Behring公司開發并于2016年上市的首個獲批治療血友病A的重組單鏈FⅧ，其是利用B結構域保留的24個氨基酸短肽（741～764）使重鏈和輕鏈（去除1 649 ～ 1 652）共價鍵連接形成的單鏈結構。研究證實，Afstyla?與全長重組FⅧ生物活性相當，但穩定性更高，且與vWF具有高親和力；此外，vWF還可能限制抗原提呈細胞對重組FⅧ的識別作用，具有潛在的降低藥物免疫原性的作用[13-15]。

2.2 長效FⅧ藥物的開發

由于血漿來源或常規重組FⅧ存在生物活性不穩定、半衰期短等問題，需要長期頻繁靜脈注射FⅧ，不僅給患者帶來痛苦，還可能產生抗體。因此，長效FⅧ藥物的開發至關重要（見圖3）。

圖 3 長效FⅧ藥物的蛋白結構示意圖Figure 3 Schematic diagram of the protein structure of FⅧ with extended half-life

2.2.1 聚乙二醇修飾 聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）是一類高分子聚合物，具有較大的流體力學半徑，將PEG共價修飾在功能蛋白質分子上，可通過保護蛋白質分子免受血液中的蛋白酶水解或降低清除率來達到延長半衰期的作用，對于FⅧ來說，PEG可阻斷FⅧ與低密度脂蛋白受體相關蛋白（LRP）家族受體的相互作用，進而降低其肝臟清除率[16]。

2015年 上 市 的 Adynovate?（BAX855） 是 由Baxalta公司基于Advate?開發的首個PEG修飾的全長重組FⅧ分子。利用氨基隨機進行PEG（相對分子質量為20 000）修飾，使得全長FⅧ中平均有2個賴氨酸側鏈可被其修飾，這種方法使PEG修飾在分子的不同的位點上，從而得到PEG修飾的重組FⅧ混合物。動物實驗表明，與Advate?相比，Adynovate?的半衰期延長，相關療效也隨之延長[16]。臨床研究發現，Adynovate?對于治療嚴重血友病A患者的出血發作和預防是安全有效的，受試者未發生超敏反應，對過往接受過治療的患者使用Adynovate?治療后未見抗FⅧ抑制性抗體風險的增加，與標準重組FⅧ（半衰期為10.5 h）相比，Adynovate?在人體中的半衰期延長了1.4倍（14.3 h）[17-18]。

Bayer公 司 于 2018年 上 市 的 Jivi?（BAY 94-9027）是一類基于B結構域（744 ～ 1 637）缺失的定點PEG修飾的重組FⅧ分子。其通過定點突變的方法，在A3結構域中引入由賴氨酸到半胱氨酸的突變，從而使相對分子質量為60 000的PEG-馬來酰亞胺與引入的半胱氨酸發生特異性結合，進而實現PEG的定點修飾。動物實驗結果表明，BAY 94-9027保持了凝血活性，與未修飾FⅧ相比較有較低的免疫原性，同時還改善了家兔和血友病小鼠的藥動學性質[19]。臨床研究結果顯示，BAY 94-9027具有良好的預防出血作用，并且能夠有效控制并治療手術中或其他條件下的出血事件，其在人體中的半衰期為18.4 h，相比于標準重組FⅧ（12.9 h）提高了 1.4 倍[19-21]。

Esperoct?（N8-GP）是由 Novo Nordisk公司開發的一類利用定點糖基化來延長分子半衰期，同時保持凝血功能不變的重組FⅧ分子，已于2019年獲批上市。N8-GP是在Turoctocog alfa的基礎上進行進一步改造得到的，Turoctocog alfa保留了B結構域中的21個氨基酸短肽，其中包含了O-糖基化位點，O-糖鏈結構末端的唾液酸可以被一個相對分子質量為40 000的含支鏈PEG中的共軛唾液酸取代，進而得到定點修飾的PEG產物。臨床研究中，Esperoct?顯示出良好的耐受性、預防作用和安全性[22-23]。與標準重組FⅧ（半衰期為11.7 h）相比，Esperoct?在青少年或成人患者體內的半衰期延長了1.6倍（19 h），在兒童患者體內的半衰期延長了1.9倍[24-25]。

2.2.2 Fc融合 Eloctate?是由Biogen Idec公司開發并于2014年上市的一類由單分子的B結構域（744～1 637）缺失的FⅧ（BDD-FⅧ）與二聚體人Fc區融合而成的重組FⅧ分子。Fc融合通過利用新生兒Fc受體和內源性IgG循環途徑延長重組FⅧ的半衰期，延緩IgG和Fc融合蛋白的溶酶體降解，并使其進入循環中。在嚴重血友病A的小鼠和狗模型中，單體Fc融合蛋白可將FⅧ的半衰期延長約2倍[26]。臨床研究表明，Eloctate?的終末半衰期（19.0 h）比標準重組FⅧ（12.4 h）延長1.5倍，在嚴重血友病A青少年和成年患者中，能有效預防和治療出血事件，且具有良好的耐受性[27-28]。此外，Fc融合并不損害FⅧ活性或導致免疫原性增加。因此，與傳統FⅧ治療方案相比，Eloctate?具有將注射頻率降低50%的潛力，這一治療負擔的改善可能會提高血友病A患者的預防依從性。

2.2.3 其他類長效FⅧ藥物 在血漿中，95%以上的FⅧ與vWF以非共價復合物的形式進入循環，在維持止血方面具有重要作用，此外，vWF與FⅧ的相互作用在FⅧ的功能、免疫原性及清除等方面起著至關重要的作用。vWF是相對分子質量為250 000的蛋白質，可形成大的多聚體（相對分子質量高達2.0×107），其半衰期約為16 h。研究表明，vWF在一定程度上可以穩定并保護FⅧ免受自身清除途徑的影響，但其也使FⅧ進入vWF介導的清除途徑[29]，與vWF的相互作用限制了當前技術（Fc融合、PEG修飾）實現的FⅧ半衰期延長的程度。因此，穩定FⅧ與vWF的相互作用并克服FⅧ依賴vWF的降解途徑的限制也是FⅧ實現長效化的另一策略。

Bioverativ公司開發的BIVV001是一類新型在研的可以突破vWF限制上限的長效重組FⅧ分子[30]，該分子由vWF的FⅧ結合區域D'D3區域（結合FⅧ C1和C2結構域的必需區域）通過Fc共價結合在FⅧ上，這一修飾增加了D'D3的局部濃度，使其能夠競爭內源性vWF，同時避免了vWF清除的限制。除D'D3結構域外，該分子中還含有2個XTEN連接子：一個XTEN連接子取代FⅧ的B結構域，另一個連接到D'D3結構域，XTEN是一種由6個氨基酸重復序列（Gly、Ala、Pro、Glu、Ser、Thr）組成的非結構多肽，在一定程度上具有延長融合蛋白半衰期的作用。D'D3結構域和XTEN連接子在凝血級聯反應中凝血酶激活的條件下可被切掉并移除，不影響FⅧ的活性。Ⅰ/Ⅱa期臨床試驗結果顯示，單次低劑量（25 IU·kg-1）的BIVV001可將FⅧ的半衰期延長至37 h，與標準重組FⅧ（半衰期為13 h）相比，其半衰期延長了2.8倍，在靜脈注射后第5、7 d的平均殘留FⅧ活性分別是13%和5.6%，未產生抑制物，并具有良好的耐受性[30]。

FⅧ-KB013bv是由 Muczynski等[31-32]研究的一類B結構域由2個識別vWF D'D3結構域的非抑制性納米抗體取代的FⅧ-納米抗體融合蛋白，該蛋白中的納米抗體部分可以靶向vWF。FⅧ-KB013bv具有FⅧ完全活性，其對vWF的親和力是標準重組FⅧ藥物的25倍。小鼠體內實驗結果顯示，該分子能夠延長FⅧ的半衰期[31]。與BDD-FⅧ相比，FⅧ-KB013bv的免疫原性顯著降低，其可能的原因是FⅧ-KB013bv對vWF的高親和力使該復合物在與細胞抗原呈遞細胞相互作用時不會發生解離，這一過程降低了可用于呈遞給T細胞的FⅧ的數量和FⅧ的攝取，從而減少了抗FⅧ抗體的形成[30]。此外，另一種正在進行的研究是利用白蛋白與D'D3融合形成融合蛋白，在過量的情況下與重組FⅧ共同靜脈注射，原則上，這種融合蛋白能夠競爭內源性vWF結合FⅧ，進而穩定并延長FⅧ半衰期[33]，但此方法仍需要進一步的數據來確定能否達到預期目標。

3 FⅧ類似物的開發

另一種治療血友病A的新方法是尋找一種抗體作為FⅨa和FⅩ之間的橋梁，從而發揮FⅧa的輔因子功能[34-35]。與傳統FⅧ藥物相比，抗體的半衰期更長，且可以皮下給藥，這種抗體不會與抗FⅧ抗體發生交叉反應，因此其可以為不能成功接受免疫耐受誘導（immune tolerance induction，ITI）的血友病A患者提供預防性治療[3,36]。但這種方法的缺陷在于，FⅧ在體內發揮功能時需要特定的蛋白質-蛋白質和蛋白質-磷脂相互作用，并接受正負調控調節，而抗體可能不能模擬這些相互作用[37]。

目前，最先進的FⅧa模擬抗體是由Chugai公司開發的 Hemlibra?（emicizumab/ACE910）。Emicizumab是一種人源化的抗FⅨa/FⅩ不對稱雙特異性抗體（人IgG4/κ），其一只手臂識別FⅨa的表皮生長因子（EGF）樣結構域1，另一只手臂識別FⅩ的EGF樣結構域2，因此可以通過同時結合FⅨa和FⅩ而起到FⅧa輔因子模擬物的作用[37]（見圖4）。但實際上，emicizumab不僅可以結合FⅨa和FⅩ，還可以結合FⅨ和FⅨa，因此它其實是一種四特異性抗體[38]，其與酶原FⅨ的結合可以隔離來自FⅨa的抗體，且與FⅩa的結合可以延遲凝血酶原（FⅩa-FⅤa與凝血酶原）復合物的組裝。這些可能解釋為什么在emicizumab臨床試驗中的患者需要使用他們之前使用的FⅧ產品治療急性出血[39]。Emicizumab模擬FⅧa發揮凝血活性由FⅨa濃度驅動并且依賴于磷脂[37]，雖然其不能像FⅧa那樣直接與磷脂結合（FⅧa將磷脂與FⅨ和FⅩ結合，促進它們之間的相互作用），但emicizumab可以以較弱的親和力同時與FⅨ和FⅩ結合，使該分子某些部分間接結合磷脂。而emicizumab的調節方式與FⅧ并不類似，FⅧ僅在凝血酶切割后活化，然后通過A2結構域解離和活化蛋白C（activated protein C，APC）切割后失活，emicizumab則能夠不斷地將FⅨ-FⅨa連接到FⅩ-FⅩa發揮作用且不會失活，因此，emicizumab必須依賴凝血級聯反應中的其他步驟來控制其促血栓形成的功能。臨床研究結果證實，emicizumab對于血友病A成年和兒童患者包括體內已產生或未產生FⅧ抑制物的患者常規預防作用均有效[30,40]。因與FⅧ沒有結構上的同源性，所以emicizumab不會誘導產生FⅧ抑制物或被已有的FⅧ抑制物所抑制。此外，emicizumab還具有皮下給藥方式和較長的半衰期（約30 d）等額外優點[39]。藥動學模型顯示，在給予每周負荷劑量后，受試者可以通過每周（QW）、2周（Q2W）或每月（Q4W）劑量維持穩定的血漿水平，這足以維持臨床研究項目中大多數受試者的無出血狀態[41]。這種新療法的總體療效和安全性以及對實際應用的指導仍在不斷發展中，需要進一步的數據來支持。

FⅧ雙特異性抗體模擬方法的其他類似物正在進行臨床前研究。如BS027125[42]，該抗體的雙臂是通過酵母展示系統利用陽性和陰性選擇產生的，能夠特異性結合FⅨa和FⅩ而不是FⅨ和FⅩa，因此BS027125可以更好地模擬FⅧa選擇性地將FⅨa橋連至FⅩ。盡管該抗體可特異性結合FⅩ而非FⅩa，并且對FⅨa具有更高的親和力，但它仍然可保持與FⅨ的實質性結合，因此該抗體實質上是一種三特異性抗體。目前BS027125正處于臨床前研究階段。

圖 4 FⅧ和Emicizumab作用機制示意圖Figure 4 Schematic diagram of the action mechanisms of FⅧ and emicizumab

4 結語與展望

在過去的幾十年中，血友病A治療方法的不斷發展使患者預期壽命顯著延長。盡管存在著基因療法和ITI等其他治療方法，FⅧ替代療法在血友病A的臨床治療中仍占據著至關重要的地位，但FⅧ分子穩定性差、半衰期短且長期使用后可產生抑制物仍然是替代療法面臨的關鍵問題。近十幾年來，多種重組FⅧ藥物及抗體模擬類似物已經獲批上市或正處于臨床研究階段（見表1）。

表 1 上市或在研的FⅧ改構藥物及其類似物Table 1 Structural modification of FⅧ and its antibody mimetics on the market or under investigation

常規FⅧ藥物主要通過對B結構域的截短或刪除、生產工藝優化或表達系統優化等改善FⅧ蛋白的穩定性或免疫原性，但并未達到延長半衰期的目的。傳統的長效FⅧ藥物是利用PEG或Fc等分子對FⅧ進行修飾，但其半衰期僅能延長1.4 ～ 1.6倍。由于FⅧ在血液循環中是以FⅧ/vWF復合物的形式存在，其半衰期不僅取決于自身的結構性質，還與vWF的結構性質和半衰期有關，因此進一步穩定FⅧ/vWF復合物的形成或延長vWF的半衰期可進一步改善FⅧ的半衰期，這可能是今后長效FⅧ藥物開發的重點研究方向。近幾年新開發的FⅧ抗體模擬類似物是一種以雙特異性抗體形式模擬FⅧ功能的一種特殊抗體，其可適用于已有或未有抑制物的血友病A患者，并且具有皮下給藥方式和更長的半衰期等優點，克服了FⅧ替代療法中抑制物產生、半衰期短和受到靜脈給藥方式限制等缺點，進一步擴大了FⅧ替代療法的應用范圍。但是在體內FⅧ功能的發揮受到正負調控以及與其他分子之間復雜的相互作用的影響，而FⅧ的復雜相互作用及特異性是否能被雙特異性抗體更好地再現，并產生更大的功效和更準確地反映FⅧ活性的多功能性，這可能是未來FⅧ類似物開發中需要解決的關鍵問題。

業界仍需要尋找更多的FⅧ改構產物和模擬類似物，以期望得到更多活性高、特異性強、免疫原性低、給藥方式簡便、半衰期長的FⅧ藥物。