對乙酰氨基酚損傷肝線粒體造成肝衰竭的分子機制及應用

李青霞，張玉彬

（中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京 211198）

對乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）又名撲熱息痛，是一種常用的解熱鎮痛藥，自1955年應用于臨床后就成為歐洲最受歡迎的解熱鎮痛藥[1-3]，并一直占據解熱鎮痛藥原料藥市場的主導地位，以單組分或復方的形式被應用到多種治療感冒、發熱和緩解疼痛的藥物中，全世界每年的消耗量達75 000～80 000噸。1966年，首次發現APAP可引起肝損傷[4]。目前在美國，APAP已經成為引起急性肝功能衰竭最多的藥物，而在我國，APAP是僅次于乙型肝炎病毒引起肝功能衰竭的重要因素[5]。另外，我國酒精性和非酒精性肝病發病率逐年升高，這類患者肝臟氧化還原平衡遭到破壞，對APAP的耐受降低，亦增加服食APAP患者用藥風險[6-8]。除此之外，Gong等[9]研究發現，腸道微生物比例的晝夜差異可導致微生物代謝產物——1-苯基-1，2-丙二酮（1-phenyl-1，2-propanedione，PPD）在夜間含量升高，而PPD轉運至肝臟會消耗肝臟谷胱甘肽（glutathione,GSH），導致相同劑量的APAP在夜間引發更加嚴重的肝損傷，而夜間發病很容易使患者失去最佳的救治時間，因此，APAP毒性的時辰問題在臨床使用中應加以關注。此外，路燕等[10]利用美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research, ICR）小鼠模擬APAP肝損傷時發現，相同劑量的APAP對成年的雄鼠所致的肝損傷較雌鼠嚴重，故APAP肝毒性的易感性和嚴重程度受到了多方面因素的影響，且APAP中毒早期臨床表現不明顯，往往導致了APAP中毒難以防治。

線粒體是真核生物進行氧化代謝產生能量的細胞器，它對氧化損傷極為敏感，缺氧、微生物毒素、各種毒物以及射線、滲透壓改變等均會導致線粒體腫脹。APAP造成的肝損傷一般可分為代謝損傷階段和炎癥損傷階段。線粒體作為APAP代謝產物的主要靶標，參與到APAP引起的代謝損傷和炎癥損傷2個階段，在代謝與免疫反應中均發揮了重要的橋梁作用。因此，線粒體也成為“代謝免疫（immunometabolism）”這一新興的學科分支重要的研究對象。本文主要從線粒體損傷出發，探討APAP造成肝損傷甚至急性肝衰竭的機制以及與線粒體損傷相關的潛在治療方案。

1 對乙酰氨基酚損傷肝臟線粒體的機制

1.1線粒體與氧化應激

線粒體是一種由2層膜包被的細胞器，由外至內可劃分為線粒體外膜、線粒體膜間隙、線粒體內膜和線粒體基質4個功能區，除作為細胞的“能量工廠”外，也參與細胞分化、細胞信息傳遞和細胞凋亡等過程，并擁有調控細胞生長和細胞周期的能力。線粒體在通過氧化磷酸化產生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）時，呼吸鏈中傳遞的電子很容易從線粒體內膜漏出，與線粒體基質中的氧結合生成超氧陰離子（˙O2-），再轉變為羥基自由基（· OH）和過氧化氫（H2O2），這三者是細胞內最強的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）成員。細胞內80%的ROS來自線粒體，因此，生物進化時，線粒體內保留了一套完整的ROS防御系統，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPX）、 谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GRX）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）等，這些生物分子可及時消除線粒體內產生的過量ROS，但當線粒體受損傷時，則會產生持續性高濃度的ROS，導致線粒體膜脂質和線粒體DNA氧化受損，從而引起炎癥反應。

1.2 對乙酰氨基酚在肝臟內的代謝

藥物在肝臟進行的代謝轉化一般可以分為Ⅰ相代謝反應和Ⅱ相代謝反應，Ⅰ相代謝反應包括氧化、還原、水解和去甲基化，可將藥物代謝為具有肝細胞毒性的產物。Ⅱ相代謝反應為結合反應，藥物或Ⅰ相代謝反應產物與葡萄糖醛酸、硫酸、谷胱甘肽等內源性物質共價結合，增強物質極性，使其易于通過尿液排出體外，即藥物解毒的過程。1973年Mitchell等[11]通過APAP動物模型揭示了APAP的代謝過程，在治療劑量下，APAP主要通過Ⅱ相代謝途徑代謝，85% ～ 90%的APAP在葡萄糖醛酸基轉移酶（glucuronic transferase，UGTs）和磺基轉移酶（sulfonate transferase，SULTs）的催化下與葡萄糖醛酸和硫酸物結合，生成無毒的代謝物，10%的APAP經肝臟細胞色素P450系統代謝，產生有毒的活性中間體N-乙酰對苯醌亞胺（N-acetylp-benzoquinone imine，NAPQI），正常量的NAPQI在谷胱甘肽硫轉移酶（glutathione-S transferase,GST）的催化下能夠結合谷胱甘肽產生無毒的硫醇尿酸，通過尿液排出體外，4%的APAP以其原型從尿液中排出體外。另外，還有極小比例的APAP會被髓過氧化物酶或環氧酶-1氧化[1,12]。肝臟作為體內以代謝為主的器官，攝入的各類物質在影響肝臟健康狀態的同時也會影響APAP的代謝。有研究顯示，由于酒精也通過CYP2E1進行代謝，長期飲酒會增強CYP2E1的活性或延長其半衰期，促進細胞色素 P4502E1（cytochrome P4502E1，CYP2E1）對APAP的代謝，產生更多的NAPQI，導致肝臟對APAP的耐受降低,但研究發現，急性的酒精攝入或許能夠通過競爭CYP2E1來緩解APAP造成的肝損傷[1]。因此，酒精攝入對于APAP肝損傷的影響還有待進一步探究。此外，多種食物也會影響CYP450酶活性，故在臨床使用APAP的過程中應多加關注。

1.3 代謝產物誘導氧化應激并破壞線粒體防御體系

APAP代謝產生過量NAPQI，在造成氧化應激的同時能夠結合線粒體和肝臟細胞蛋白，破壞線粒體和細胞結構，損傷線粒體功能并阻礙新的線粒體生成，導致肝臟內線粒體防御體系受損。美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration,FDA）建議成人每天攝入的APAP應少于4 g，超出UGTs和SULTs代謝能力的APAP主要通過細胞色素P450酶系統中CYP2E1代謝，也有少量由CYP1A2/3A4代謝，產生大量的NAPQI[1]。線粒體是NAPQI的主要靶標，一方面過量的NAPQI通過半胱氨酸殘基結合到線粒體膜蛋白上形成APAP復合物[13]，改變線粒體膜結構，導致線粒體膜通透性增加，破壞膜電位；另一方面，NAPQI消耗大量的GSH，破壞肝臟氧化還原平衡，從而使線粒體中ROS水平升高，導致線粒體膜脂質過氧化，膜流動性降低。GSH耗竭導致未被及時清除的ROS激活c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）并使其轉位進入線粒體，持續激活的JNK促進線粒體不斷地產生ROS，ROS和JNK的相互作用增強了線粒體氧化應激[14]。核因子E2相關因子（nuclear factor erythroid 2-related factor-2，Nrf2）作為體內主要的抗氧化轉錄因子，受到刺激能夠入核誘導其下游包括解毒、抗氧化以及藥物代謝相關基因的表達；低劑量APAP能夠激活Nrf2，使其入核誘導下游抗氧化基因的表達，發揮對肝臟的保護作用，但攝入過量的APAP會抑制Nrf2的表達，故大劑量的APAP代謝產物不僅消耗谷胱甘肽儲備，同時還破壞機體抗氧化相關基因的轉錄，導致肝臟的抗氧化防御系統崩潰[15]。

由于細胞中80%的ROS都來自線粒體，線粒體結構和功能的完整有助于線粒體固有的ROS防御系統發揮作用，但張廷芬等[16]研究發現，低濃度的APAP會影響線粒體的呼吸功能，且由ROS激活的JNK亦能結合到線粒體，通過下調丙酮酸脫氫酶的活性，從而降低線粒體代謝。Barbier-Torres等[17]也發現，APAP中毒患者體內內源性線粒體負性調節因子——MCJ的水平顯著升高，MCJ是一種定位于線粒體內膜的跨膜蛋白，可與線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ相互作用，從而降低其活性，APAP能夠通過MCJ干擾線粒體呼吸復合物的形成，在減少ATP合成的同時增加ROS的生成。另外，過量APAP代謝產生的NAPQI能夠選擇性地抑制線粒體復合物Ⅱ的正常功能，同時NAPQI能夠與ATP合酶的α亞基結合，破壞其生物活性，使ATP合成受損[2,18]。APAP在體內由3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸作為硫酸的供體，在葡萄糖醛酸基轉移酶的催化下代謝為無毒的產物排出體外。由于3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸是由含硫氨基酸提供硫酸基團并與ATP反應生成，ATP合成受損可能會減弱SULTs對APAP的代謝，導致更多的APAP經CYP2E1代謝，從而放大NAPQI對線粒體的氧化損傷。

在正常生理狀態下，過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator 1α，PGC-1α）作為促進線粒體生成的主要調節因子，能夠調控線粒體的數量與形態[19]。研究顯示，乙酰肉毒堿能夠通過PGC-1α調控線粒體生成[20]。張廷芬等[16]研究發現，低濃度的APAP能夠誘導PGC-1α的表達，同時也促進核呼吸因子1/2（nuclear respiratory factor1/2，NRF-1/2）以及下游線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，MTFA）的表達，進而抵抗線粒體損傷，緩解APAP造成的肝損傷，但高濃度的APAP會抑制PGC-1α、NRF-1/2和MTFA的表達，減少線粒體生成，表明APAP通過代謝活性中間產物NAPQI，不僅能夠消耗GSH，造成氧化應激，破壞線粒體的結構和功能，亦能阻礙線粒體的生成，導致肝細胞線粒體數量和功能異常。

1.4 代謝產物通過線粒體介導肝臟炎癥損傷

肝臟作為體內固有免疫的主要器官之一，不僅含有大量的內源性巨噬細胞，即枯否細胞（Kupffer cells，KCs），且能夠快速募集循環系統的淋巴細胞進入肝臟發揮免疫作用。Nod樣受體蛋白3（Nodlike recepter protein 3，NLRP3）炎性小體的激活能控制促炎因子白細胞介素-1β/18（interleukin -1β/18,IL-1β/18）的成熟和分泌，其活化依賴于“啟動”和“激活”2個功能不同的步驟[21]。Zhong等[22]在研究炎癥小體NLRP3激活的過程中發現，損傷線粒體生成的ROS能氧化線粒體DNA（mitochondria DNA，mtDNA）生成氧化型mtDNA（Ox-mtDNA），Ox-mtDNA可結合并激活NLRP3，促進半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前體（pro-caspase1）的成熟，進而切割白細胞介素-1β/18前體（pro-interleukin-1β/18，pro-IL-1β/18），使其成熟并釋放到胞外發揮免疫作用；另外，激活Toll 樣受體4/9（Toll-like receptor 4/ 9，TLR4/9）信號產生 pro-IL-1β和 pro-IL-18的同時能夠通過髓樣分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）和β干擾素TIR結構域銜接蛋白（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β，TRIF）激活干擾素調節因子（interferon regulatory factor 1，IRF1）依賴的胞苷單磷酸激酶2（cytidine/uridine monophosphate kinase 2，CMPK2）轉錄，增加mtDNA的合成，促進由NLRP3介導的免疫反應。

在APAP中毒破壞肝臟的過程中，活性代謝產物NAPQI既能消耗GSH，提高肝臟內ROS的水平，亦能與線粒體蛋白結合，破壞線粒體導致線粒體DNA釋放，機體免疫系統能夠通過TLR9識別mtDNA并使其激活，同時釋放包括凋亡誘導因子（apoptosis inducing factor, AIF）和核酸內切酶G（endonuclease G，Endo G）在內的間質蛋白，并轉移至核內，從而使DNA發生碎片化，導致mtDNA、ATP、DNA碎片等細胞內容物作為損傷相關分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），刺激KCs，為NLRP3活化的啟動和激活階段提供條件，最終導致固有免疫反應和適應性免疫反應的發生[23]。一般認為，激活KCs能夠加劇APAP導致的肝損傷，但免疫反應亦能夠通過清除壞死細胞促進肝臟的修復，因此免疫反應能在肝臟中發揮損傷和修復的雙重功能，但持續和過量的炎癥反應會加劇肝細胞的損傷和壞死。

2 緩解肝線粒體損傷的藥物研究

2.1 抗氧化藥物

2.1.1N-乙酰半胱氨酸 在目前的臨床治療中，N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是對APAP中毒具有明確療效的解毒劑，可以用于所有APAP過量中毒的患者[1]。NAC進入細胞后，可脫去乙?；蒐-半胱氨酸，L-半胱氨酸是GSH的合成前體，能夠與甘氨酸和谷氨酸結合生成GSH，同時NAC中含有巰基，是GSH的活性基團，易被氧化脫氫，能夠代替GSH與APAP的代謝物NAPQI共價結合，從而發揮直接解毒作用；另外NAC能提供合成磺酸基的原料，磺酸基能與APAP結合而解毒[1,5]。但NAC一般用于疾病發生的早期，在過量服用APAP后的10 ～ 12 h內能阻止肝損傷的發生，但對于無意識服用大量APAP的患者以及中毒晚期患者治療效果有限[3]。然而，也有文獻報道，在疾病發展后期，NAC可能通過提高NO的產生，改善肝臟灌注和供氧，同時清除活性氧和活性氮，改善線粒體的能量供應，從而降低APAP急性肝衰竭患者的死亡率[24]。

2.1.2 天然活性物質 氧化應激為APAP導致肝損傷的重要環節，已有大量文獻報道具有抗炎和抗氧化能力的天然提取物能夠預防APAP導致的急性肝損傷（見表1）。

表 1 部分植物提取物緩解對乙酰氨基酚肝損傷的作用機制Table 1 Mechanism of certain plant extracts in alleviating acetaminophen liver injury

然而，值得注意的是，有關天然活性物質的研究仍停留在預防階段，且Salminen等[30]研究顯示，在灌胃給予小鼠150 mg·kg-1的APAP 6 h后再給予小鼠綠茶提取物加重了APAP導致的肝毒性，因此具有抗氧化活性的天然提取物對APAP肝毒性的治療效果仍需進一步研究。

2.2 靶向線粒體緩解對乙酰氨基酚肝毒性

APAP中毒可導致線粒體功能受損，利用電子傳遞鏈復合物以及相關酶的類似物能夠修復線粒體功能，緩解APAP導致的肝損傷。四甲基哌啶氮氧化物（2，2，6，6-tetramethyl-1-piperidinyloxy，TEMPO）可以作為SOD的類似物，通過與親脂性的三苯基膦離子結合靶向進入線粒體，從而改善線粒體抗氧化的功能[31]。Du等[32]給予C57BL/6J小鼠腹腔注射 300 mg·kg-1的APAP，1.5 h后給予線粒體靶向抗氧化劑——Mito-TEMPO（MT），發現MT能減少肝臟谷胱甘肽二硫化物以及過氧亞硝酸鹽的形成，并抑制線粒體Bax的轉移以及線粒體內膜蛋白（如凋亡誘導因子）的釋放，抑制核DNA的片段化，進而緩解3 ～ 12 h內APAP導致的肝損傷。進一步研究顯示，MT在APAP中毒12 h和24 h后仍能夠發揮保護作用，然而在MT處理的小鼠肝臟中雖未見細胞壞死，但細胞凋亡顯著增加，且MT組半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase 3）的切割和活化顯著提高，表明MT能通過調節線粒體氧化應激和受體結合絲氨酸蘇氨酸激酶3（receptor binds serine threonine kinase 3，RIP3）的表達，將細胞死亡的方式由壞死轉化為繼發性凋亡，從而能夠減少由壞死細胞釋放的細胞內容物對肝細胞的損傷[33]。

此外，亞甲藍作為一種用于臨床的解毒劑，可以通過滲透線粒體膜，作為電子傳遞鏈復合物Ⅱ的替代品，維持線粒體電子傳遞鏈穩態和線粒體生物能量平衡[18]。Lee 等[18]研究表明 ,小于 3 μmol·L-1的亞甲藍就能夠接受NAPQI的電子，恢復線粒體ATP合成速率。在正常情況下，亞甲藍能夠阻止線粒體通透性轉變以及細胞內ATP的缺失。C57BL/6J小鼠在給予450 mg·kg-1APAP 90 min后腹腔注射給予10 mg·kg-1的亞甲藍能夠緩解APAP造成的肝損傷[18]。并且亞甲藍在體內被還原后能夠將高鐵血紅蛋白還原為血紅蛋白，緩解APAP造成的高鐵血紅蛋白血癥[34-35]。

目前，雖然針對線粒體修復的解毒劑能夠治療APAP中毒，其療效甚至超過NAC，如MT與NAC聯合使用的療效較NAC單獨使用更好[32]，且利用MCJ的抑制劑能夠在NAC治療無效的情況下緩解APAP導致的肝毒性[17]。但上述藥物多處于體外研究階段，僅能作為探索治療APAP中毒藥物的研究方向，尚不能直接用于臨床。

2.3 線粒體移植治療

線粒體治療(mitochondrial therapy，mitotherapy）是利用外源的功能性線粒體替換有功能障礙的線粒體，從而達到治療線粒體相關疾病的目的。Shi等[36]將從HepG2中分離得到的功能性線粒體加入到APAP造模的細胞培養基中后發現，外源線粒體能夠進入到體外培養的肝原代細胞中，并能顯著提高APAP處理后細胞的活力，同時還能夠降低ROS的水平，增強ATP的合成，提高GSH的水平。通過靜脈注射將外源的功能性線粒體注射進小鼠體內后，線粒體會分布到包括肝臟在內的多種組織中，通過這一技術，外源性的線粒體通過增加肝細胞能量供應，降低氧化應激，緩解了APAP導致的肝臟損傷，但外源性的線粒體應完整，損壞的線粒體可能會破壞肝細胞[36]。因此，外源性線粒體在細胞和動物水平緩解APAP所導致的肝損傷為治療因線粒體損傷導致的人肝損傷提供了一種有潛力的治療方案，但若進入臨床治療，還有待深入。

3 結語

目前，APAP是造成藥物性肝損傷的主要因素，其致病過程較為復雜，且不同階段呈現出不同的特征。雖然臨床上認為常規劑量的APAP副作用較少，但由于目前超過30種在售的解熱鎮痛藥都含有APAP[5]且患者對APAP肝毒性的認識較少，易導致患者在無意識的情況下重復服用APAP，進而導致肝臟受損，因此在未來對APAP肝毒性的防治工作中不僅要加強對治療藥物和治療方案的研究與開發，還需提高患者對APAP肝毒性的認識，才能從根源減少APAP導致的肝損傷。