利用芽孢桿菌去除水體中亞硝酸氮的研究

劉韶娜 余東游 趙智勇*

（1. 云南省畜牧獸醫科學院，云南昆明650224；2. 浙江大學動物科學學院，浙江杭州310058）

《中國環境狀況公報》報道，2017年全國地表水污染依然較重。1 940個水質斷面中，Ⅰ至Ⅲ類、Ⅳ至Ⅴ類和劣Ⅴ類水質的斷面比例分別為67.9%、23.8%和8.3%。在監測營養狀態的112 個重要湖泊(水庫)中，劣V類的占10.7%。

亞硝酸鹽是氨轉化為硝酸鹽過程中的中間產物，對魚、蝦的毒性較強，是養殖水域中誘發暴發性疾病的重要因素[1-2]。亞硝酸鹽主要通過層狀氯細胞主動運輸穿過鰓，通過體液積累，并競爭性的與血紅蛋白反應生成高鐵血紅蛋白，降低機體運輸氧的能力，從而導致水生生物的窒息死亡[3]，還影響血液中血紅蛋白、血糖、紅細胞總數、白細胞總數等血液化學指標。并且也會提高其對細菌性疾病的易感性[4-6]。國家地下水質標準中規定飲用水中亞硝酸氮濃度不得高于0.02 mg/l。

研究發現日本囊對蝦幼蝦養殖中亞硝酸氮的安全濃度為42.739 mg/l[7]，當鹽度為2.5%時，墨吉明對蝦的半數致死量為20.11 mg/l[8]，亞硝酸氮濃度在4 mg/l以下時，羅氏沼蝦的生長能達到最優[9]。亞硝酸氮對凡納濱對蝦的安全濃度為0.2 mg/l[10]。杜浩等[11]報道亞硝酸氮對中華鱘稚魚的24、48、72 h 和96 h 的LC50及95%可信區間分別為7.05（6.22～8.03）、4.07（1.51～7.88）、3.10（2.07～4.34）mg/l 和2.57（2.31～2.85）mg/l。呂敢堂等[12]就亞硝酸氮對三疣梭子蟹幼體饑餓和飽食兩種狀態下72 h 半致死濃度（LC50）研究發現分別為0.46 mg/l 和0.56 mg/l，養殖中亞硝酸氮應控制在0.23 mg/l?？傊?，高濃度亞硝酸氮在水產養殖中對生物具有直接或間接致死作用。

生物降氮技術被認為是目前除氮污技術中最經濟的方式，而且還安全無二次污染[13-14]。生物處理中以微生物處理為主，目前已經發現的硝化菌中主要有異養硝化菌和自養硝化菌[15-18]，自養硝化細菌因為分離困難、代時長等特點在一定程度上阻礙硝化細菌作為純微生物制劑在水產養殖領域的推廣應用[19]。目前有關耐高溫高鹽的亞硝酸鹽脫氮菌的特性研究，還較少。

本文通過對已分離到的一株去除亞硝酸氮的菌株JY14 脫氮特性進行研究，為其應用于養殖廢水的處理提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用菌株芽孢桿菌來自于實驗室分離、鑒定，NCBI中登錄號為EU581833.1。

硫酸銨、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、碳酸氫鈉、碳酸鈣、硫酸銨等試劑。

UNIC 7200 型分光光度計、電子天平、恒溫振蕩器、高壓滅菌鍋、恒溫培養箱。

基礎瓊脂培養基：NaNO21 g、FeSO40.03 g、K2HPO41 g、MgSO40.03 g、葡萄糖1 g、蒸餾水1 L、加1.5%的瓊脂粉。

人工廢水：NaNO20.012 g、FeSO40.03 g、K2HPO41 g、MgSO40.03 g、葡萄糖1 g、蒸餾水1 L，分裝到200 ml的三角瓶中，每瓶100 ml，121 ℃滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 分析方法

亞硝酸氮測定：N 一(1-萘基)一乙二胺光度法；硝酸鹽氮測定：紫外分光光度法；氨氮測定：納氏試劑法。

1.2.2 不同因素對菌株JY14去除亞硝酸氮的影響

本實驗重點探討碳源、氮源、溫度、pH 值及鹽度對菌株JY14的亞硝酸鹽去除率的影響。在各個單因素影響試驗中，碳源為麥芽糖、蔗糖、淀粉、苯甲酸鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、草酸鈉、甘露醇、葡萄糖；氮源為大豆蛋白胨、胰蛋白胨、甲魚料、牛肉膏、酵母粉、干酪素；NaCl濃度為0～7%；pH值為3～10；溫度為5～60 ℃，每一因素優化結果適用于下一實驗。于培養24 h 后測定亞硝酸氮的濃度。

1.2.3 不同時間對菌株JY14 去除亞硝酸氮能力的影響

將JY14 接種于LB 肉湯培養基中，在35 ℃、160 r/min 搖床培養12 h活化，在人工廢水中按照1%（v/v）的接種量接入培養24 h 的供試菌株菌懸液（設三個重復），在35 ℃，160 r/min恒溫振蕩器培養32 h，每隔4 h取樣，測定亞硝酸氮含量。

1.2.4 菌株JY14對天然污水中無機氮的影響

本實驗重點探討JY14 在降低亞硝酸氮的同時，對氨氮和硝酸氮的影響。取甲魚池養殖污水滅菌后按照1%（v/v）的接種量接入培養24 h 的供試菌株菌懸液（設三個重復），在35 ℃，160 r/min恒溫振蕩器培養12 h，每隔4 h測定一次各種無機氮的的濃度，計算各時段氮與起始濃度含量的百分比。

2 結果與分析

2.1 JY14去除亞硝酸氮的代謝特性

2.1.1 碳源對供試菌株去除亞硝酸氮能力的影響（見圖1）

圖1 碳源對JY14去除亞硝酸氮能力的影響

由圖1可以看出，JY14菌株以甘露醇、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、淀粉為唯一碳源，進行亞硝酸氮去除，在24 h內亞硝酸氮去除率達到95%以上，其中以淀粉為碳源的去除率最高，為96.70%，人工廢水中亞硝酸氮濃度可由初始濃度2.53 mg/l降為0.048 mg/l。

2.1.2 氮源對供試菌株去除亞硝酸氮能力的影響（見圖2）

由圖2 可以看出，當氮源為有機氮源時，JY14 對亞硝酸氮去除率較高，其中干酪素為其去除亞硝酸氮的最適氮源。

圖2 氮源對JY14去除亞硝酸氮能力的影響

2.1.3 NaCl 含量對供試菌株去除亞硝酸氮能力的影響（見圖3）

圖3 NaCl對JY14去除亞硝酸氮能力的影響

由圖3 可知，當NaCl 含量為0%時，JY14 對亞硝酸氮去除率達到最高，為98.12%，JY14對亞硝酸氮去除率隨著NaCl 含量的增加而降低?？梢?，氯化鈉的存在對JY14去除亞硝酸氮具有抑制作用。

2.1.4 pH 值對供試菌株去除亞硝酸氮能力的影響（見圖4）

由圖4可知，隨著初始pH值的不斷升高，JY14的對亞硝酸氮的去除率也不斷提高，當pH 值為6.0～7.0時，JY14 亞硝酸氮去除率也達到最大。pH 值為6.0～9.0時，JY14菌株對亞硝酸氮去除率在90%之上。pH值繼續升高，亞硝酸氮去除率逐漸下降。由此可見JY14去除亞硝酸氮最適pH值為7.0。

2.1.5 溫度對供試菌株去除亞硝酸氮能力的影響（見圖5）

圖4 pH值對JY14去除亞硝酸氮能力的影響

圖5 溫度對JY14去除亞硝酸氮能力的影響

從圖5中可看出25～40 ℃時，溫度對JY14亞硝酸氮去除率影響不顯著，當溫度在30～40 ℃時，JY14 的去除率均在95%以上，30 ℃為其去除亞硝酸氮的最適溫度。

2.1.6 不同時間對供試菌株去除亞硝酸氮能力的影響（見圖6）

由圖6 可知，16 h 至實驗結束時，亞硝酸氮去除率為99.50%。且在8～32 h內亞硝酸氮含量不出現反彈現象。亞硝酸氮的去除主要發生在4～8 h 內，此時JY14生長進入對數期。

2.2 菌株JY14對天然污水中無機氮的影響（見圖7）

由圖7可知，在0～12 h內，亞硝酸氮、氨氮和總無機氮的含量總趨勢呈下降趨勢，而硝酸氮含量呈上升趨勢，推測原因可能為JY14 在利用亞硝酸鹽和銨鹽的同時能產生一定濃度的硝酸銨，而總無機鹽濃度下降，則說明有部分無機氮被轉化為另一種形式的氮，可能為菌體蛋白，也可能為氮氣。

3 討論

環境中自養和異養硝化菌在水體氮的循環中起了非常重要的作用[16-17，20-21]，有機碳源不僅影響異養硝化菌的生長，還影響其硝化特性[20-23]。聶歡歡等[16]分離的具有亞硝酸氮去除能力的地衣芽孢桿菌FP6最適碳源為蔗糖，孫巍等[24]分離的異養硝化菌假單胞菌LT-11 最適碳源為琥珀酸鈉。宋君等[23]發現復合有機碳源更能提高短小芽孢桿菌對水體中無機氮的去除。菌株不同則碳源不同，添加有機碳源對于異養硝化菌的無機氮去除具有促進作用[20-24]。本研究則發現添加淀粉和干酪素等有機物可以提高芽孢桿菌JY14 對亞硝酸氮去除率，這與其他學者研究趨勢一致[16，22-23]。

劉慧玲等[8]以墨吉明對蝦為試驗動物，經研究發現硝酸氮濃度為2.5%時其安全濃度最高，韓楓等[25]發現亞硝酸氮對花鱸幼魚的危害性與鹽度呈反比，說明一定鹽度能降低亞硝酸氮對水生生物的危害性。JY14 能夠適應較寬的NaCl 濃度環境[22]，Mirandaa 等[6]認為0.5%～1.0%時，NaCl會成為亞硝酸氮氧化或氨氧化的重要媒介，王越等[26]發現鹽度為2.5%時花津灘芽孢桿菌對亞硝酸氮的去除效率最高，宋君等[23]則通過對短小芽孢桿菌研究發現2.0%～4.0%時，亞硝酸氮的去除效果最佳。而在本實驗中JY14去除亞硝酸氮的最佳NaCl 濃度為0%，可能是由于本菌分離于淡水環境，NaCl能夠影響菌體生長而間接影響對亞硝酸氮的去除率[22]。

研究發現pH 值在6.5～9.0 之間亞硝酸氮去除率較高[23-29]，李思倩等[27]研究發現在pH 值7.0～9.0之間亞硝酸鹽氮去除率較高。劉玉等[28]發現在pH值4.5 時羅伊氏乳桿菌對亞硝酸氮的去除效率最高。宋君等[23]則發現pH 值7～8 之間短小芽孢桿菌BP-171 對無機氮的去除率最高。結合本實驗結果認為中性偏酸性的環境最適合菌株JY14 的去除亞硝酸氮。

JY14 適于生長在中等偏高的溫度環境中，在5～25 ℃偏冷環境中也能生存[22]。而其他學者研究發現芽孢桿菌最適生長溫度為25～40 ℃[30-34]，宋君等[23]發現28 ℃時短小芽孢桿菌BP-171 去除無機氮效率最高。周鮮嬌等[35]通過研究芽孢桿菌發現30 ℃時，對亞硝酸氮去除效率最高，唐家毅等[36]則認為芽孢桿菌去除亞硝酸氮的最佳溫度為25～35 ℃。這與本實驗結果趨勢一致，JY14在25～40 ℃時具有較高的亞硝酸氮去除率。在25～40 ℃范圍內，溫度對其去除亞硝酸氮率影響較小，推測原因可能與其酶類有關，還需進一步研究。

4 結論

本研究結果表明，芽孢桿菌JY14 具有去除亞硝酸氮的能力。該菌在pH 值3.0～10.0 時均具有去除亞硝酸氮的功能，但受影響較大，其去除亞硝酸氮最適pH 值是7.0。能在一定的鹽度（0～3%）條件下去除亞硝酸氮，溫度對其去除亞硝酸氮能力影響較小，25～40 ℃時均能去除亞硝酸氮，且受影響較小。JY14 去除亞硝酸氮的環境條件較為寬泛，因此本實驗分離的芽孢桿菌可作為今后養殖水質調控菌進行深入研究。