百香果莖尖組織培養體系的建立①

趙家桔 高 玲 李莉萍 張如蓮 高錦合劉迪發 徐 麗 應東山

(1 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所 海南?？?71101;2 海南省南繁生物安全與分子育種重點實驗室 海南?？?71101)

百香果（Passiflora edulis）有較高的市場價值，種植前景良好。目前我國熱區已將百香果種植業列為“短、平、快”的精準扶貧項目［1]。但我國百香果優質苗木較為缺乏，存在品種單一，產量低，品質、抗病性差等問題。百香果種植中90%的種苗都是采用無性繁育方法獲得。無性繁育中的扦插繁殖種苗存在變異大、品種易退化、病害增加、產量降低等問題［2]。在百香果產業發展過程中，病毒病很大程度上制約了其發展［3]。由于頻繁的跨地區苗木銷售及引種種植，百香果病害日益加?。?]。種苗攜帶有莖基腐病菌、馬鈴薯Y病毒屬的百香果木質化病毒、黃瓜花葉病毒等［5]，豇豆蚜傳花葉病毒［6]和大戟曲葉病毒［7]，影響了百香果種植業和加工業的發展，給產業的持續發展帶了巨大風險。針對百香果種苗帶病毒問題，組織培養技術已經成為目前最有效去除病毒的方法，其效率高、周期短；同時能克服生產上無性繁殖率低，繁殖速度慢等缺點。許多學者對百香果的離體再生培養展開了研究，并取得一定成果。根據文獻報道，百香果不同器官部位，如莖節間、腋芽、葉片、子房、子葉、下胚軸、卷須、胚乳［8-11]均可作外植體材料進行快繁體系的建立；極少文獻報道利用腋芽為外植體［12-13]，通過不同的外植體誘導，可得到愈傷組織或不定芽。陳發興［10]試驗比較了百香果不同部位的萌芽率，發現葉盤和卷須誘導不定芽比較困難，而葉柄相對容易，莖段萌芽率可達100%。楊冬業等［11]研究表明，葉片萌芽極其困難，莖段的出芽率達100%。本研究利用組織培養對百香果莖尖進行脫毒研究，旨在為百香果產業可持續健康發展提供優質健康種苗，進而促進百香果產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2018年2月至2019年2月在中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所內進行。材料采自中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所新品種標準與測試中心資源圃，品種為“黃金百香果”。

MS 基本培 養 基：4.43 g/L MS 粉，30 g/L 蔗糖及7 g/L瓊脂，pH 5.8，經121℃，0.1 MPa、30 min高溫高壓滅菌后備用。

初代（誘導培養基）培養基：4.43 g/L MS 粉，30 g/L 蔗糖，7 g/L 瓊脂，6-BA 2.0 mg/L，GA30.5 mg/L，NAA 0.1 mg/L，pH 5.8，經121℃，0.1 MPa、30 min高溫高壓滅菌后備用。

繼代增殖培養基：4.43 g/L MS 粉，30 g/L 蔗糖及7 g/L 瓊脂，6-BA 1.5 mg/L，NAA 0.1 mg/L，pH 5.8，經121℃，0.1 MPa、30 min 高溫高壓滅菌后備用。

生根培養基：2.17 g/L 1/2 MS 粉，30 g/L 蔗糖及7 g/L 瓊脂，NAA 0.1 mg/L，IBA 0.1 mg/L，pH 5.8，經121℃，0.1 MPa、30 min 高溫高壓滅菌后備用

1.2 方法

在黃金百香果生長旺盛時，以其頂芽或帶腋芽莖段為外植體材料，剪取50 cm 左右的百香果嫩梢，留腋芽及頂芽，截成2～3 cm 的莖段。莖段先用自來水沖洗2～3 次，再用蒸餾水沖洗1 次，在無菌環境中用無菌水沖洗兩遍，用75%酒精消毒30 s，無菌水洗滌一次，隨后按照表1 中處理組A1～A4 進行消毒處理，處理時在消毒劑中滴加2～3滴吐溫，消毒期間不斷地晃動三角瓶，使消毒劑充分與材料接觸，消毒劑處理后用無菌水沖洗5～6 次，每次沖洗3 min，用濾紙吸干莖段表面的水分。于解剖鏡下剝取莖尖（0.5～1.0 mm）作為外植體，接種于初代培養基中。

表1 不同消毒時間的處理

1.2.1 培養條件

培養溫度（25±1）℃，光照強度2000 lx 左右，光照時長12 h/d。

1.2.2 初代培養

按照第一步篩選的消毒時間剝取莖尖接種于不同濃度的GA3，NAA和6-BA 1.0～2.0 mg/L 處理的培養基上，每個處理接種20 個大小較為一致的莖尖。在初代培養基上培養35 d 后，轉接到繼代增殖培養基中，每瓶接種2 個芽尖，每處理接種60個芽尖，培養30 d，觀察芽增殖情況，以選取最佳濃度激素組合。

1.2.3 繼代增殖培養

待初代培養后得到的無菌外植體莖尖長至5～7 cm時，切段繼代培養，每段0.5 cm左右，帶一個節間，接種到激素組合為6-BA＋NAA 的MS 培養基（每升培養基附加30 g蔗糖，7 g瓊脂）中進行繼代培養，每兩個月繼代一次，反復繼代4～5次之后，統計其增殖系數和玻璃化程度，重復3次。

1.2.4 生根培養

挑選健康、長勢好且均勻的組培苗進行生根誘導，長度2～3 cm 的增殖芽，將嫩芽從基部切下，接 入0.05、0.1、0.15、0.2 mg/L NAA 配 合0.1 mg/L IBA 的1/2 MS 的培養基中進行壯苗生根，培養25 d進行結果統計分析。

1.2.5 練苗移栽

待組培苗根長到2～3 cm 時，進行練苗5～7 d左右。移栽到育苗缽內，以透氣性、保水性較好的腐殖土為基質，苗不僅生長旺盛，移栽成活率也高。

1.2.6 計算方法及數據處理

接種后7～15 d分別統計污染率、褐化率、存活率，相關計算公式如下：

污染率＝污染外植體數/接種外植體總數×100%

褐化率＝外植體褐化數/接種外植體總數×100%

存活率＝（外植體接種總數－外植體污染數－褐化及被殺死的外植體數）/外植體接種總數×100%

采用SPSS 22.0對數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對百香果莖尖的影響

對黃金百香果外植體的消毒時間設置不同組合，統計結果發現，在0.1%HgCl2作消毒劑的處理組，污染率隨著消毒時間的延長而降低，并且呈現顯著差異，褐化率則隨著消毒時間的延長而升高，但是3個試驗組的結果無顯著差異。處理組A3的存活率較高，但是隨著消毒時間的增長，10和12 min的試驗組無顯著差異。

根據各處理組污染率、褐化率和存活率的分析，處理組A3 為黃金百香果外植體的最佳消毒方式，具體操作為75%乙醇消毒30 s，0.1 HgCL2消毒10 min，可以獲得較低的污染率、褐化率以及較高的存活率（表2）。

表2 不同消毒時間對百香果莖尖的影響 單位：%

2.2 初代培養叢生芽誘導

在培養基中添加GA3莖尖萌動早，長勢較快，不易分化成從生芽；不同6-BA 濃度處理的莖尖萌發慢，且不同6-BA 濃度對外植體生長和分化有明顯影響。6-BA 濃度很小時，愈傷組織不易分化成從生芽。隨著6-BA 濃度的增加，愈傷化越早，越容易形成愈傷組織；分化類型隨著6-BA 濃度的增加，叢生芽越多。當6-BA 濃度為2 mg/L 時，外植體芽易形成愈傷組織，且愈傷組織大量生長，易分化成為叢生芽且較健壯（表3）。由此認為，培養基MS＋6-BA 2.0 mg/L＋GA30.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L是最適初代培養基。

表3 不同培養基對百香果莖尖叢生芽誘導情況

2.3 繼代增殖培養

觀察NAA 濃度為0.1 mg/L，6-BA 濃度分別為0.5、1.0、1.5和2.0 mg/L 繼代 培養 上培 養4 周后的增殖生長狀況，結果發現，在6-BA 濃度為1.5 mg/L 的增殖培養基中的莖尖長勢快，葉片粗壯，顏色濃綠（圖1-A）；而6-BA 濃度為1.0 mg/L的增殖培養基中莖尖苗長勢緩慢，葉片細，植株矮?。▓D1-B）。

2.4 生根培養

誘導組培苗生根的重要條件是生根培養基，植物調節劑是提高百香果組培苗不定根的關鍵因素。把叢生芽（圖2）切割成單株小苗，接入不同生根培養基，25 d 后觀察。由表4 可知，生根培養基以1/2 MS 附加0.1 mg/L NAA和IBA 為最好，在此培養基上誘導的根粗壯，數目多，生長良好（圖3）。

2.5 煉苗移栽

煉苗（圖4）是組培苗生根不可缺少的環節。將經生根壯苗培養獲得根長為2～3 cm 的苗，移入室外遮陰棚煉苗5～7 d，然后將培養瓶瓶蓋打開，在自然光下鍛練2～3 d。經過鍛煉的幼苗用攝子輕輕地取出，放入濃度為0.1%多菌靈溶液中浸泡5 min，再用清水沖洗2～3次，把根部的培養基沖洗干凈，栽入體積比椰糠∶表土∶蛭石＝2∶1∶1 的混合基質中，澆足定根水，放置于遮陽棚內，保持濕潤，移栽后待10～15 d 新根與新葉長出，移栽成活率可達95%以上。

3 討論與結論

以百香果莖尖為材料，在解剖鏡下剝取莖尖，莖尖需要在短時間內誘導出大量的叢生芽，以芽生芽的方式建立再生體系是最快捷的途徑，再進行生根誘導，以便短時間內可以得到大量的植株［11，14]，從而加快百香果繁殖速度，有利于脫毒苗及優良種源的繁殖與保存。本試驗結果表明，最佳的消毒方式為75%的酒精溶液消毒30 s后再用0.1%HgCl2消毒10 min，這與焦楠［13]的最佳消毒方式類似，具體操作為75%乙醇消毒30 s，0.1%氯化汞消毒12 min，可以獲得較低的污染率、褐化率以及較高的存活率。最適初代培養基為MS＋6-BA 2.0 mg/L＋GA30.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，有利于叢生芽的誘導。本研究通過添加不同濃度的6-BA和NAA，對百香果莖尖初代培養基進行了篩選，發現2.0 mg/L 6-BA 可使百香果莖尖誘導出大量愈傷組織；在培養基中添加GA3，莖尖萌動早，長勢較快；最適繼代培養基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，適宜芽的增殖且利于壯苗；最適生根培養基為1/2 MS＋NAA 0.1 mg/L＋IBA 0.1 mg/L，形成的苗健壯，生根率高達95%。本試驗采用1/2 MS 作為基礎培養基效果較好，這與前人研究一致［11，13，15]。史沉魚等「14]在誘導百香果生根時發現，活性炭的加入可促進二級根的生成。

表4 不同培養基對百香果生根誘導的影響

莖尖培養的成功率主要取決于莖尖的大小，莖尖過大，脫毒不徹底；莖尖過小，則容易引起褐化。本文認為切取莖尖控制在0.5～1.0 mm 有利于其成活。繼代次數不能超過5次，長期繼代的試管苗有可能再感染病毒，還會引起芽變的可能。因此，脫毒試管苗組織快繁，需二年更換一次基礎苗，以提高試管苗的質量。試管苗要及時進行繼代培養，因為長時間培養，不能及時轉移，容易出現“玻璃化”苗。