海蓬子發芽富集γ-氨基丁酸和黃酮類化合物的條件優化及關鍵酶活性的研究

王杰，王篤軍，李鳳偉，商曰玲，卜雯麗，丁霄霄，余曉紅，*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013；2.鹽城工學院海洋與生物工程學院，江蘇鹽城224051）

海蓬子（Salicornia europaea L.），又名西洋海筍，系藜科（Chenopodiaceae）海蓬子屬（Salicornia）鹽生性植物[1]，種植在海灘鹽堿地、鹽沼地或輕質沙地，耐受5%NaCl 濃度的海水，可用海水直接灌溉，不與糧食作物爭土地，爭淡水[2]。海蓬子植株富含礦物質元素、膳食纖維、蛋白質、維生素和氨基酸等營養物質，不僅可以作為蔬菜直接食用，還可以作為一種草藥，其具有清熱排毒、利尿、減肥、降血脂、活血通絡和抗壞血病等功效[3]。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）在植物中含量很低，很難從這些天然組織中大量的分離提取[4]。因此，通過生物合成法（植物富集法和微生物發酵法）獲得GABA 備受學者關注[5]。研究表明種子發芽過程中發生了大量復雜的生理生化變化，種子中不斷產生新酶或被激活，一些大分子物質如淀粉和蛋白質被分解，種子中原來含量低或不具有的功能成分如GABA 等大量富集[6]。發芽過程中，種子中的L-谷氨酸（L-glutamic acid，L-Glu） 在谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）催化下脫羧形成GABA，而二胺（polyamines，PAs） 經二胺氧化酶 （diamine oxidase，DAO）催化形成氨基丁酸，后環化成吡咯啉，再在吡咯啉脫氫酶（pyrroline dehydrogenase，PDH）作用下形成GABA[7]。有研究表明，大豆正常發芽5 d 后，發芽大豆中GABA 含量是原料的4.19 倍[8]。而目前國內外對于海蓬子發芽富集GABA 的報道基本沒有。

黃酮類化合物作為一種生理活性物質，在許多植物和蔬菜中都有發現，Lee 等[9]從海蓬子中提取出了異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷兩種黃酮類化合物，發現這些物質能夠抑制糖代謝，利用這一特性研發出了新的治療糖尿病的藥物。Kong 等[10]進行了進一步研究發現這些物質能大大提升抗氧化酶的生物活性，保護細胞的基因，是一種天然抗氧化劑[11]，但以海蓬子種子為材料進行發芽試驗富集黃酮類化合物的研究鮮有報道。黃酮類化合物的生成是通過苯丙烷類的合成途徑，研究證實苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine aminolyase，PAL）、肉桂酸4-羥基化酶（cinnamicacid-4-hydroxylase，C4H），4-香豆酸輔酶 A 連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）是苯丙烷類代謝途徑的3 個關鍵酶[12-15]。植物種子萌發后會發生一系列的生理代謝變化，主要表現在細胞生理活性的恢復和復雜的生化代謝，從而使籽粒的營養成分發生重大的變化。周小理等[16]對苦蕎麥籽粒進行發芽萌發處理后，發現萌發物中黃酮化合物的含量遠遠高于苦蕎麥種子。

本研究通過單因素和正交試驗，研究NaCl、赤霉素、pH 值和溫度對海蓬子發芽率、黃酮和GABA 的影響，在最優的培養條件下，探究關鍵酶活性對發芽過程中GABA 和黃酮類化合物的富集機制，旨在為開發功能性海蓬子食品及發展鹽土農業經濟提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海蓬子種子：鹽城綠苑鹽土農業科技有限公司；GABA 標準品：青島捷世康生物有限公司；蘆丁標準品、磷酸吡哆醛（pyridoxal5-phosphatemonohydrate，PLP）、谷氨酸、赤霉素、愈創木酚、過氧化物酶、肉桂酸、苯丙氨酸、β-巰基乙醇：上海生工工程股份有限公司；腐胺、還原型輔酶Ⅱ（reduced coenzyme Ⅱ，NADPH）、對香豆酸、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、輔酶 A（coenzyme A，CoA）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純）：上海陸都化學試劑廠。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV752N 紫外可見分光光度：上海佑科儀器儀表有限公司；FA1104 電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；PB-20 型pH 計：德國賽多利斯公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；HY-4 型調速多用振蕩器：金壇市城東新瑞儀器廠；Agilent 1290 液相色譜儀：Agilent 公司；150 C 恒溫光照培養箱：常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發芽工藝

挑選飽滿均勻的海蓬子種子，用1%的次氯酸鈉消毒15 min 后沖洗至中性，置于鋪有兩層濾紙的培養盒中，每個培養盒放置1 000 顆種子，樣品置于恒溫光照培養箱中發芽，每8 h 噴一次培養液。分別測定海蓬子發芽第5 天時的發芽率、GABA 含量以及黃酮類化合物的含量。

1.3.2 單因素使驗

NaCl 濃度：分別設置 0、3.5、7.0、10、14 g/L 為 5 個不同的培養液濃度，每個梯度設置3 組平行試驗在24 ℃的光照培養箱中培養。

赤霉素（gibberellin，GA3）濃度：在 7.0 g/L 的 NaCl培養液中分別加入 0、5、10、20、30 mg/L 的 GA3、每個梯度設置3 組平行試驗在24℃的光照培養箱中培養。

pH 值：調節 7.0 g/L 的 NaCl 培養液 pH 分別為 5、6、7、8、9，每個 pH 值梯度設置 3 組平行試驗在 24 ℃的光照培養箱中培養。

溫度：將7.0 g/L 的NaCl 培養液培養的種子分別放在 18、20、22、24、26 ℃的光照培養箱中培養。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗結果基礎上，選擇NaCl 濃度、GA3濃度、pH 值、溫度為考察因素。以發芽率、GABA 含量、黃酮類化合物含量為評價指標，設計無交互作用的正交試驗表L9（34），研究各因素及其水平對發芽率、GABA 含量、黃酮類化合物含量的影響，正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.4 最優條件下關鍵酶活力測定

通過正交試驗得到最優培養液組合，在此條件下，對發芽 7 d 內的 GAD、DAO 和 PAL、C4H、4CL 活力進行測定。

1.4 測定指標和方法

發芽率：按照GB/T 3543.4-1995《農作物種子檢驗規程發芽試驗》測定；黃酮含量測定：亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法；GABA 含量測定[17]：稱取0.2 g 發芽海蓬子干粉溶于5 mL 質量分數為8 %的三氯乙酸溶液，在40 ℃水浴振蕩 2 h，離心分離，上清液經 0.45 μm 濾膜過濾后用于測定GABA 含量。GABA 測定采用柱前鄰苯二甲醛（O-phthalaldehyde，OPA）衍生化反相高效液色譜法來檢測GABA。高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 條件：檢測器波長為338 nm，色譜柱為 C18ODS 反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），色譜柱溫度 25℃；流動相比例為 0.1 mol/L 磷酸緩沖液（pH 值為6.0）52 %，甲醇46 %，四氫呋喃2 %，使用前經0.22 μm 微孔濾膜過濾，超聲波脫氣后使用，流動相流速為1 mL/min；GAD 酶活力測定：參考Xu 等[18]的方法；DAO 酶活力測定：參考 Xing 等[19]的方法；PAL 酶活力測定：參考陳雷等[20]的方法；C4H 酶活力測定：參考 Lamb 等[21]的方法；4CL 酶活力測定：參考Koopmann 等[22]的方法。

1.5 數據統計與分析

每組試驗設3 次重復，取平均值；采用IBM SPASS Statistics 19.0 軟件對數據進行處理和方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 NaCl 濃度對發芽率的影響

NaCl 濃度對種子發芽率的影響見圖1。

圖1 NaCl 濃度對種子發芽率的影響Fig.1 Effect of NaCl concentrationon on the seed germination rate

由圖1 可知，當 NaCl 濃度在 0 g/L～20 g/L 時，海蓬子種子的發芽率逐漸上升，對于一定濃度的NaCl，促進了種子發芽，這是因為海蓬子屬于鹽堿地植物，有一定的耐鹽性，低濃度的鹽刺激了種子的生長。當NaCl 濃度在7 g/L 時，種子的發芽率達到最大，當NaCl濃度大于7 g/L 時，種子的發芽率逐漸降低，這是因為高濃度的鹽抑制了種子的活性，使種子處于休眠狀態[23]。因此，NaCl 濃度選擇在 7 g/L～10 g/L 為宜。

2.1.2 GA3濃度對發芽率的影響

GA3濃度對種子發芽率的影響見圖2。

圖2 GA3 濃度對種子發芽率的影響Fig.2 Effect of GA3 concentrationon on the seed germination rate

由圖2 可知，當 GA3濃度在 0 mg/L～10 mg/L 時，海蓬子種子發芽率緩慢升高，在10 mg/L 達到最大值50 %，隨著GA3濃度的逐漸增大，發芽率呈現緩慢下降的趨勢，這是由于GA3作為一種高效植物生長調節劑，它能迅速打破種子、塊莖和鱗莖等器官的休眠狀態，促進發芽生長、發芽、開花、結果，但是高濃度的GA3反而會抑制種子發芽[24]。因此，GA3濃度控制在10 mg/L 最佳。

2.1.3 pH 值對發芽率的影響

pH 值對種子發芽率的影響見圖3。

圖3 pH 值對種子發芽率的影響Fig.3 Effect of pH on the seed germination rate

由圖3 可知，隨著pH 值的升高，海蓬子種子的發芽率呈現先增后降的趨勢，較低或較高的pH 值都會對種子發芽起到抑制作用，當pH 值為8 時，種子發芽率最高，為50%，因為海蓬子屬于耐鹽堿性植物，弱堿性條件下，對其生長發育起到一定的促進作用。因此，種子發芽pH 值以8.0 為宜。

2.1.4 溫度對發芽率的影響

溫度對種子發芽率的影響見圖4。

圖4 溫度對種子發芽率的影響Fig.4 Effect of temperature on the seed germination rate

由圖4 可知，當培養溫度為18 ℃～22 ℃時，種子的發芽率逐漸升高，溫度為22 ℃時發芽率達到最大值為50%。但是隨著溫度的升高，發芽率逐漸降低，這是因為較高的溫度導致酶活性降低，一定程度上抑制了種子的萌芽[25]。故發芽溫度為22 ℃～24 ℃為宜。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗結果基礎上，選擇NaCl 濃度、GA3濃度、pH 值、溫度為考察因素，以發芽率、GABA 含量、黃酮類化合物含量為評價指標，進行L9（34）正交試驗，正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

正交試驗發芽率直觀分析見表3。

表3 正交試驗發芽率直觀分析Table 3 Germination rate intuitive analysis of orthogonal test

由表3 可知，RB>RA>RD>RC，表明 pH 值對發芽率的影響最大，NaCl 濃度次之，其他依次是溫度，GA3濃度。

正交試驗發芽率方差分析見表4。

表4 正交試驗發芽率方差分析Table 4 Germination rate variance analysis of orthogonal test

由表4 可知，影響種子發芽的各因素顯著次序為pH 值＞NaCl 濃度＞溫度＞GA3濃度，其中 NaCl 濃度和pH 值均有顯著性影響。

正交試驗黃酮類化合物直觀分析見表5。

表5 正交試驗黃酮類化合物直觀分析Table 5 Flavonoids intuitive analysis of orthogonal test

由表5 可知 RB＞RA＞RC＞RD，表明 pH 值對黃酮類物質富集含量影響最大，NaCl 濃度次之，其他依次是GA3濃度，溫度。

正交試驗黃酮化合物方差分析見表6。

表6 正交試驗黃酮化合物方差分析Table 6 Flavonoids variance analysis of orthogonal test

由表6 可知，影響種子發芽的各因素顯著次序為pH 值＞NaCl 濃度＞GA3濃度＞溫度，其中 NaCl 濃度和pH 值均有顯著性影響。

正交試驗GABA 直觀分析可知見表7。

由表7 可知，RA＞RB＞RD＞RC，表明 NaCl 濃度對黃酮富集含量的影響最大，pH 值次之，其他依次是溫度、GA3濃度。

表7 正交試驗GABA 直觀分析Table 7 GABA intuitive analysis of orthogonal test

正交試驗GABA 方差分析見表8。

表8 正交試驗GABA 方差分析Table 8 GABA variance analysis of orthogonal test

由表8 可知，影響種子發芽的各因素顯著次序為NaCl 濃度＞ pH 值＞溫度＞GA3濃度，其中 pH 值和 NaCl濃度均有顯著性影響。

通過正交試驗獲得海蓬子種子發芽的最優培養液組合為 A2B3C1D3，即 NaCl 濃度為 7 g/L，pH 值為 8，GA3濃度為5 mg/L，溫度24 ℃。但在正交設計表中并沒有該組合的試驗，按此組合補充驗證試驗，如表9。

表9 驗證試驗結果Table 9 Results of verification experiments

在此條件下，海蓬子在第5 天時種子發芽率為59.28%，黃酮類化合物含量為31.601 μg/mL.，GABA含量為311.34 mg/100 g，高于正交試驗組合，因此此條件為最佳。

2.3 最優條件下關鍵酶活性變化

發芽過程中GAD、DAO 活性的變化及GABA 含量的變化見圖5、圖6、圖7。

圖5 發芽過程中GAD 活性的變化Fig.5 Changes of GAD enzyme activity during germination

圖6 發芽過程中DAO 活性的變化Fig.6 Changes of DAO enzyme activity during germination

圖7 發芽過程中GABA 含量的變化Fig.7 Changes of GABA content enzyme activity during germination

由圖5、圖6 和圖7 可知，最優條件下發芽的海蓬子GAD 和DAO 活性較對照顯著提高，培養4 d 時，GAD 和DAO 活性較對照提高了3.10 倍和2.97 倍，結合表3，GABA 的變化趨勢與 GAD 和 DAO 相似，GABA 在第5 天含量達到最大值，而GAD 和DAO 活性在第4 天達到最大，這可能是因為種子中的谷氨酸在GAD 和DAO 酶的催化作用下生成GABA 有一定的作用時間。本研究結果與前期文獻報道結果一致。白青云等[26]研究表明鹽脅迫條件可以使粟谷中GAD 活性增加，植物體內游離態多胺（polyamines，PAs）含量升高，PAO、DAO 活性也隨之升高GABA 得以富集。蘇國興等用NaCl 處理大豆幼苗，發現大豆根系GABA 含量隨著GAD 活性的提高而提高[27]。

發芽過程中PAL、C4H、4CL 活性的變化及黃酮類化合物含量的變化見圖8、圖9、圖10、圖11。

圖8 發芽過程中PAL 活性的變化Fig.8 Changes of PAL enzyme activity during germination

圖9 發芽過程中C4H 活性的變化Fig.9 Changes of C4H enzyme activity during germination

圖10 發芽過程中4CL 活性的變化Fig.10 Changes of 4CL activity during germination

圖11 發芽過程中黃酮類化合物含量的變化Fig.11 Changes of flavonoids content during germination

由圖8、圖9、圖10 和圖11 可知，最優條件下發芽的海蓬子PAL、C4H 和4CL 活性較對照顯著提高，培養 5 d 時，PAL、C4H 和 4CL 活性較對照提高了 1.92倍、1.48 倍和1.52 倍，結合表2，黃酮的變化趨勢與PAL、C4H 和4CL 酶活性變化一致，在第5 天含量達到最大值。PAL、C4H 和4CL 是苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶，可有效調節與之相應的黃酮類化合物等次生代謝產物的合成，而黃酮類化合物是種子發芽過程中對外界環境適應的結果[28]。這與周小理等研究苦蕎麥發芽結果一致，苦蕎麥進行萌發處理可激活PAL 活性，使得苯丙烷類代謝途徑增強，進而黃酮類物質的合成也增加[29]。Suzuki 等[30]研究發現，PAL 活性不僅受植物內源物質的調控，光照、溫度、病原菌和植物激素等外源條件同樣能影響其活性，刺激次級代謝產物黃酮的生成。

3 結論

本研究通過單因素試驗探討了NaCl 濃度、GA3濃度、pH 值、溫度對海蓬子發芽率的影響，經正交試驗，以發芽率，黃酮、GABA 含量變化為指標確定了海蓬子最佳的培養條件為NaCl 濃度為7 g/L，pH 值為8，GA3濃度為5 mg/L，溫度24 ℃，在此條件下，海蓬子種子發芽率為59.28%，黃酮富集含量為31.601 μg/mL，比發芽初期增加了2 倍，GABA 富集含量為311.34 mg/100 g，比發芽初期增加了3.5 倍。對比最優條件和純水培養條件的關鍵酶活性，GAD 和DAO 酶活力呈現先升高后下降的趨勢，在第4 天達到最大值，較對照提高了3.10 倍和2.97 倍，對GABA 積累有協同作用；PAL，C4H，4CL 酶活力呈現先升高后下降的趨勢，在第5 天達到最大值，較對照提高了1.92 倍、1.48 倍和1.52 倍，與黃酮類化合物含量變化趨勢一致。海蓬子在鹽堿性條件發芽過程中，GABA 和黃酮類物質均有所增加，但是對于如GaCl2、ABA 等其他鹽脅迫條件有待進一步的深入研究。本研究為海蓬子發芽富集活性物質機理提供理論依據以及對開發發芽海蓬子產品具有重要意義。