百香果中番茄紅素提取工藝優化研究

武廣珩，傅仙玉，陳志賓

（1.福建省生態產業綠色技術重點實驗室，福建武夷山354300；2.武夷學院生態與資源工程學院，福建武夷山354300；3.武夷學院茶與食品學院，福建武夷山354300；4.中國烏龍茶產業協同創新中心，福建武夷山 354300；）

番茄紅素廣泛存在于一些植物中，如百香果、番茄、草莓、胡蘿卜、番茄等，是一種較為常見的功能性色素，它屬于類胡蘿卜素中的一種[1]。番茄紅素是一種脂溶性有機化合物，易溶于有機溶劑，難溶于水，分子式為C40H56，分子量為536.85 Da，具有11 個共軛雙鍵和2 個非共軛碳-碳雙鍵[2]。番茄紅素是目前在自然界中發現的最強的抗氧化劑，它的抗氧化能力比β-胡蘿卜素強2 倍以上，比維生素E 強100 倍[3]，還具有消除人體自由基，延緩衰老的作用，因此又有“植物黃金”的美譽[4]。隨著研究的深入，發現番茄紅素能夠有效的預防心血管疾病，對動脈粥樣硬化具有延緩作用，能夠提高人體的免疫力[5-6]。同時對于多種癌癥具有一定的治療效果[7-8]。最近有研究發現，番茄紅素通過增強干擾素途徑提高了PD-1 單抗的治療效果[9]。番茄紅素以其極高的藥用價值，被認定為A 類營養素，是世界公認的集營養與著色雙重作用于一體的功能性食品添加劑[10]。

對于番茄紅素的提取方法，王藝璇等[11]對其進行總結，主要有如下幾種方法：一是有機溶劑浸提法，其利用的是番茄紅素為脂溶性色素，可溶于脂溶性的有機溶劑中，通過選擇最佳的有機提取劑，改變提取時間、溫度、液料比等來得到它最佳的提取工藝；二是超聲提取法，利用超聲波的特性來破壞細胞的基質，促進番茄紅素的釋放，這種方法的提取效率較高、耗能少、浪費少，是一種較為高效的提取方法；三是微波輻射提取法，這種方法的作用機理與超聲提取法較為類似，利用電磁波的穿透作用來破壞細胞壁，加快番茄紅素的析出，這也是一種高效的新型提取方法。

番茄紅素在各類植物的果實中廣泛存在，但是在各類的研究以及各種參考文獻中，主體的提取材料為番茄、圣女果、西瓜這3 種。在蔡俊等[12]的研究中，用番茄作為提取原料，氯仿作為提取劑，在25 ℃、pH 6.0、90%溶劑用量時提取效果最好。在王海紅等[13]的研究中，用圣女果作為提取原料，丙酮∶石油醚=1 ∶1（體積比）作為提取劑，在 28 ℃、液料比 4 ∶1（mL/g）、提取40 min 時，提取效果最好。在孫利祥等[14]的研究中，用西瓜作為提取原料，含有2%二氯甲烷的正己烷作為提取劑，在 25 ℃、料液比 1 ∶3（g/mL）、pH5.5、提取 2 h時提取效果最好。就目前的研究現狀來說，對番茄紅素提取的原材料方面的研究較少，相對而言番茄紅素提取各方面的數據情況還不夠完善。

百香果是西番蓮科西番蓮屬的草質藤本植物，人們日常生活中常見的一種水果，基本一年四季都可見到它的身影，它具有一定的藥用價值[15]。百香果中的化學成分主要以酚類、黃酮苷類、生物堿等為主，除了抗焦慮、抗疲勞的作用外，還具有抗氧化活性、神經保護等作用，常用于失眠、抑郁、神經緊張等方面的治療[16-17]。還有研究發現，百香果皮中的可溶性膳食纖維對乙醇所致大鼠潰瘍具有保護作用[18]。由于對百香果藥用價值的開發相對較少[19]，本試驗選擇以百香果作為提取材料，一方面可以加強對百香果藥用方面的開發，提高百香果各方面的利用率和其利用價值，另一方面可以拓寬番茄紅素提取的材料來源，進一步優化對番茄紅素的提取。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料

百香果：產自福建龍巖。

1.1.2 主要試劑

蘇丹Ⅰ色素（分析純）、丙酮（分析純）、無水乙醚（分析純）、氯化鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）、正己烷（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 儀器

電子分析天平（FA224 型）：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；恒溫振蕩培養箱（ZQWY-218N 型）：上海知楚儀器有限公司；高速離心機（Neofuge 15R 型）：上海力申科學儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1100）：上海美普達儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 番茄紅素提取

切開百香果，取出果肉于研缽中，研磨粉碎，稱取所需量的果肉并對其進行預處理，將預處理后的果肉轉入三角瓶中，加入提取劑，封口，置于恒溫振蕩器上，設置試驗所需要的溫度、時間、轉速等進行振蕩提取，用濾紙過濾提取液，置于485 nm 波長的可見分光光度計上測量吸光度。

1.2.2 單因素試驗設計

1.2.2.1 預處理設計

百香果研磨粉碎后，準確稱取10 g 百香果漿液，采用以下方法（表1）對其進行預處理：每個處理重復3 次，對于上述有進行離心的預處理，離心結束后，倒掉上清液，將果肉挖出，放入三角瓶中。預處理結束后，各加入30 mL 丙酮-正己烷2 ∶1（體積比）混合液，放置于35 ℃的恒溫振蕩培養箱中，以200 r/min 的速度振蕩提取2 h。用濾紙對提取液進行過濾處理后，用丙酮-正己烷2 ∶1（體積比）提取劑調零，然后在485 nm波長處測量吸光度。

表1 預處理試驗方案設計Table 1 Design of pretreatment test scheme

1.2.2.2 最佳提取劑設計

準確稱取5 g 百香果漿液，對其進行最佳預處理；取5 組三角瓶，每組3 次重復，對其進行編號，放入處理好的提取材料；然后在這5 組三角瓶中各自加入15 mL 不同的提取劑：無水乙醚、丙酮、正己烷、丙酮-正己烷 1 ∶1（體積比）、丙酮-正己烷 2 ∶1（體積比）。35 ℃，200 r/min 恒溫振蕩提取2 h，過濾處理后485 nm波長處測量吸光度。

1.2.2.3 最佳提取時間設計

設置 5 個不同提取時間：1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，并以2 h 為空白對照提取時間。準確稱取5 g 百香果漿液，對其進行最佳預處理；在6 組三角瓶中加入15 mL丙酮-正己烷2∶1（體積比）混合液。35 ℃，200 r/min 恒溫振蕩提取2 h，過濾處理后485 nm 波長處測量吸光度。

1.2.2.4 最佳液料比設計

以丙酮-正己烷2 ∶1（體積比）混合液為提取劑，設置 8 個不同的液料比：1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1、5 ∶1、6 ∶1、7 ∶1、8 ∶1（mL/g），以 15 mL 提取劑為空白對照添加量。準確稱取5 g 百香果漿液，對其進行最佳預處理；取9組三角瓶，每組3 次重復，對其進行編號，放入處理好的提取液。35 ℃，200 r/min 恒溫振蕩提取2 h，過濾處理后485 nm 波長處測量吸光度。

1.2.2.5 最佳提取溫度設計

設置 7 個不同的提取溫度：20、25、30、35、40、45、50 ℃，以35 ℃為空白對照提取溫度。準確稱取5 g 百香果漿液，對其進行最佳預處理；取8 組三角瓶，每組3 次重復，對其進行編號，在三角瓶中放入處理好的提取液；在8 組三角瓶中加入提取劑，丙酮-正己烷2 ∶1（體積比）15 mL。200 r/min 恒溫振蕩提取2 h，過濾處理后485 nm 波長處測量吸光度。

1.2.3 正交試驗設計

在單因素試驗條件的基礎上，根據番茄紅素的提取情況作為參考因素，選取提取時間、提取溫度和液料比這3 個因素，再選取這3 個試驗因素中峰值附近的3 個水平對正交試驗進行設置，進行正交試驗分析，正交方案設計如表2 所示。

表2 正交試驗因素及水平Table 2 Factors and level of orthogonal test

1.2.4 番茄紅素標準曲線制作及含量的測定

由于番茄紅素純標準品性質極不穩定，且它的價格昂貴，而蘇丹Ⅰ色素性質穩定且價格便宜，它的性質與番茄紅素相近，故番茄紅素標準曲線制作采用蘇丹Ⅰ色素代替番茄紅素標準品[20]；標準曲線的制作按照《GB/T 14215-2008 番茄醬罐頭》[21]的要求進行制作，番茄紅素最大吸收波長也采用上述標準的波長485 nm。番茄紅素含量測定計算公式如下：

式中：X 表示試樣中番茄紅素的含量，mg/100 g；C表示試樣色素提取液中番茄紅素的濃度，μg/mL；M 表示試樣質量，g。

1.3 數據分析

利用Excel 2007 軟件對試驗的數據進行整理和建庫，SPSS 20.0 軟件對正交試驗數據進行方差分析和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗分析

2.1.1 預處理分析

新鮮的百香果中含水量較大，預處理中用無水乙醇浸泡是對百香果細胞進行脫水處理，使得番茄紅素可以加快溶解于提取劑中；對百香果進行冷凍處理是讓百香果細胞質基質中的水分凍結，形成晶體，從而破壞胞基質同時使得細胞壁破裂，讓番茄紅素能夠加快析出。加入氯化鈉，使得在細胞內外就形成了一個濃度差，從而促進細胞內的水分和一些無機鹽以及胞內色素的析出，從而提高番茄紅素的提取效果。對百香果進行離心處理，通過高速的離心來破壞細胞結構，使得細胞壁破裂，而番茄紅素不溶于水，離心后處理后，番茄紅素就基本集中于沉淀于底下的果肉中，在上清液的含量相對較少，故之后對其進行提取時倒去上清液，用沉淀于底下的百香果果肉進行提取。不對百香果進行任何處理，可以與其他預處理形成鮮明對比。不同的預處理對百香果中番茄紅素提取的影響見圖1。

圖1 不同的預處理對百香果中番茄紅素提取的影響Fig.1 Effect of different extraction pre-treatments on extraction efficiency lycopene from passion fruit

由圖1 可知，用無水乙醇浸泡30 min，15 000 r/min離心處理與不用無水乙醇浸泡直接拿去離心處理的提取效果，優于用冷凍處理和氯化鈉處理的效果，而不做任何處理的提取效果最差。用無水乙醇浸泡30 min，15 000 r/min 離心處理與不用無水乙醇浸泡直接拿去離心處理的效果差異不大，說明無水乙醇對百香果細胞的脫水效果并不顯著；加入氯化鈉的預處理效果優于放置于冰箱冷凍的效果。故綜上所述，最優的預處理為15 000 r/min、離心15 min，接下去各試驗的預處理均采取離心處理。

2.1.2 最佳提取劑分析

不同提取劑對番茄紅素提取的影響見圖2。

圖2 不同提取劑對番茄紅素提取的影響Fig.2 Effect of different extractant on extraction efficiency

由圖2 可知，番茄紅素在各個提取劑中的析出情況不一，也就造成了提取效果的差異，其中以丙酮-正己烷2 ∶1（體積比）混合提取劑的提取效果最佳，其次分別為丙酮-正己烷1 ∶1（體積比）、丙酮、無水乙醚等，正己烷的提取效果最差。非混合的提取劑提取效果較差，混合提取劑的提取效果較優，說明兩種溶劑混合后，相互促進，大大提高了番茄紅素的提取效果。而丙酮和正己烷混合液中，以2 ∶1（體積比）混合的效果優于 1 ∶1（體積比）的混合效果。

2.1.3 最佳提取時間分析

不同提取時間對番茄紅素提取量的影響見圖3。

圖3 提取時間對番茄紅素提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

如圖3 所示，番茄紅素的提取效果與提取時間呈現一個近似正態分布的圖像，前期隨時間進行遞增，為正相關關系，達到最高峰后隨時間進行遞減，為負相關關系，峰值的時間為2.5 h，前期的提取量之所以會隨時間遞增，這是因為番茄紅素是一種胞內色素，其主要存在于細胞的有色體中，番茄紅素的析出需要一個緩慢的過程，從細胞中逐漸溶解到有機溶劑中，從而達到一種動態平衡。提取時間超過2.5 h 后，其提取量下降，這是由于番茄紅素的不穩定性造成的，對光、對熱的不穩定性，會造成番茄紅素的降解，從而導致提取量減少。番茄紅素對日光、紫外光等較為敏感，過長時間的日光暴曬和紫外光照射都會引起番茄紅素的降解，故提取時間也不宜過長。因此番茄紅素的最適提取時間為2.5 h。

2.1.4 最佳液料比分析

液料比對番茄紅素提取的影響見圖4。

圖4 液料比對番茄紅素提取的影響Fig.4 Effect of liquid to solid ratio on extraction efficiency

如圖4 所示，番茄紅素的提取效果與液料比呈現一個近似半邊正態分布的圖像，前期隨液料比的遞增進行遞增，為正相關關系，達到最高峰后隨液料比的遞增進行遞減，為負相關關系，峰值的液料比為3 ∶1（mL/g），后期隨著液料比的增加，吸光度呈現下降趨勢，說明液料比在3 ∶1（mL/g）的時候，提取液中的番茄紅素基本析出，繼續增加提取劑的量就相當于將番茄紅素濃度稀釋。因此，番茄紅素的最佳液料比為3 ∶1（mL/g）。

2.1.5 最佳提取溫度分析

番茄紅素對熱具有較為良好的穩定性，在付晶等[22]的研究中，較低的溫度不會使番茄紅素發生變性，它的熱損失率較小，但是過高的溫度會使得番茄紅素發生異構化反應和氧化降解反應[23]，所以溫度過高會對番茄紅素的提取產生不利的影響。

圖5 提取溫度對番茄紅素提取量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

如圖5 所示，番茄紅素的提取效果與提取溫度也呈現一個近似正態分布的圖像，前期隨提取溫度的遞增進行遞增，為正相關關系，達到最高峰后隨提取溫度的遞增進行遞減，為負相關關系，峰值的提取溫度為40 ℃，前期番茄紅素的析出效果與提取時間之所以會呈現正相關關系，是因為溫度的升高加快了分子的運動，隨之促進了番茄紅素分子的析出，同時有機溶劑對番茄紅素的溶解能力也增加，其析出量也就變大了；溫度超過40 ℃后它的提取量下降，這是因為較高的溫度會使得番茄紅素產生異構化和降解等其他的反應，從而造成了番茄紅素提取量的下降；因此，本試驗中番茄紅素提取的最佳提取溫度為40 ℃。

2.2 正交試驗分析

由圖3～圖5 可知，在不同提取時間、提取溫度和液料比處理下，番茄紅素的提取效果均存在差異。故而在單因素試驗的基礎上，根據正交試驗設計原理，選取提取時間A、提取溫度B 和液料比C 作為3 個因素，試驗方案及結果見表3 和表4。

表3 正交試驗極差分析Table 3 The range analysis of orthogonal experiment

表4 正交試驗方差分析Table 4 Analysis of orthogonal test difference

表3 為正交試驗極差分析，液料比對提取效果的影響最大，溫度次之，時間最小，不過二者R 的數值差異不大，故對番茄紅素提取效果影響相差不是很大。從表中可以看出，根據吸光度的大小從而來判斷番茄紅素的析出效果，其中，吸光度最高的處理是試驗號為7 的處理，其處理條件為A3B1C2，以此認定番茄紅素最佳的提取處理為：提取時間3 h，提取溫度35 ℃，液料比 3 ∶1（mL/g）。

表4 是對正交試驗進行顯著性分析，根據表格中的F、P 可知，液料比對番茄紅素的提取具有顯著影響，提取時間和提取溫度的F 值相差不大，故二者對提取效果影響相近且不具顯著影響。從以上兩個表格可知，正交試驗的極差分析和顯著性分析結果相對一致，都是液料比為主要影響因素，提取時間和提取溫度為次要影響因素且影響效果相近。

2.3 驗證試驗

對正交試驗所確定的最佳提取條件進行驗證分析，以單因素試驗的最佳提取條件作為對照，試驗重復3 次，結果見表5。

表5 正交試驗驗證Table 5 Verification of orthogonal experiments

從表5 可知，正交試驗的吸光度高于單因素試驗的吸光度，即正交試驗番茄紅素的提取量大于單因素試驗，故正交試驗的提取條件優于單因素試驗的提取條件，所以，本試驗中百香果種番茄紅素最佳的提取工藝為：提取時間3 h、提取溫度35 ℃、液料比 3 ∶1（mL/g）。

2.4 標準曲線的建立及含量的計算

根據GB/T 14215-2008《番茄醬罐頭》中的方法制作標準液，所得數據用Excel 2007 進行處理，得出番茄紅素標準曲線，為：y=0.221 5x-0.005 1，R2=0.999 3。曲線如圖6 所示。

圖6 番茄紅素標準曲線圖Fig.6 Standard curve of lycopene

準確稱取5 g 百香果磨碎的果肉，按照最佳提取工藝進行處理，根據標準曲線及計算公式計算番茄紅素的含量，結果為百香果中番茄紅素的提取量為3.54 mg/100 g。

3 結論

試驗結果表明：將百香果的研磨液放置于15000r/min的高速離心機中離心15 min 為最佳的預處理方法；用丙酮-正己烷2 ∶1（體積比）混合液作為提取劑時提取對番茄紅素的溶解效果較好，其中液料比為主要影響因素，提取時間和提取溫度為次要影響因素且影響效果相近。本試驗番茄紅素的最佳提取工藝為：提取時間 3 h、提取溫度 35 ℃、液料比 3 ∶1（mL/g）。

本試驗對提取劑的選擇是參照李麗杰等[24]的研究進行設置的，可能還存在其他提取劑對番茄紅素的溶解效果更好的情況；在提取條件上，再進行更進一步的優化時，可以考慮改變提取劑的pH，來得到更優化的提取條件，因為在堿性條件下，番茄紅素更容易被破壞掉。

番茄紅素從被發現至今，也算是經歷了一個較為漫長的過程，從最初的不被重視，到越來越多的生理功能被發覺出來，番茄紅素越發得到人們的青睞。隨著時代的發展，人們對生活質量的要求越加提高，尤其在食品安全方面更為關注，在各種不合格的食品添加劑事件層出不窮時，番茄紅素作為一種天然的功能性色素，對人體存在諸多好處，在食品添加劑方面存在著天然的優勢?？赡茈S著對番茄紅素研究的深入，更多的功能會被發掘出來，大規模工業化生產方面的工藝可能會日益完善，番茄紅素將可能被應用到更加廣闊的領域中。