響應面法超聲輔助提取香椿葉總黃酮及抑菌效果研究

宋怡偉，趙志剛，韓成云，*

（1.宜春學院化學與生物工程學院，江西宜春336000；2.宜春學院生命科學與資源環境學院，江西宜春336000）

香椿（Toona sinensis）為雙子葉植物綱蕓香目楝科植物[1]，全株具有濃烈的特殊性氣味且富含多種活性物質（黃酮類、酚類及其衍生物、萜類、皂苷類、以及揮發油等）[2]。它的根、皮、莖葉、果實都可入藥，藥用價值很高。香椿含鈣、磷、鉀、鈉和微量元素等成分，有補虛壯陽、補腎養發、消炎止血、行氣健胃等作用。因此腎陽虛衰、腰膝酸軟、遺精陽痿、易脫發、食欲不佳者宜食之。黃酮廣泛存在于各種植物中，其中香椿葉主要有效成分之一就是黃酮，研究表明黃酮對心血管疾病有一定預防作用[3]，對腫瘤也有一定的抑制作用[4]；黃酮還可用于保肝，可以用來治療肝炎，肝硬化等[5]。黃酮對抑制真菌、細菌也有一定的積極作用[6]。在香椿葉中含有的黃酮類物質具有藥用與保健價值，受到專家學者的廣泛的關注。因此，對于香椿葉黃酮類物質的相關研究具有重要意義與廣闊的前景[7]。

超聲波輔助提取法能增加所提取的化合物的含量[8]。其原理主要是通過破壞細胞壁，使得目標提取物更好的溶于溶劑中來實現提取有效成分[9-10]。響應面法分析在提取試驗中往往能夠得到一個試驗的最優工藝參數[11]，通常用來解決多因素影響的優化問題[12]。

研究通過對蘆丁對照品的標準曲線測定香椿葉中總黃酮的含量，采用響應面分析法對影響香椿葉總黃酮提取率的三因素（液料比、乙醇濃度和提取時間）進行分析，確定最優的提取工藝，再將香椿葉總黃酮提取液對3 種細菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及金黃色葡萄球菌）采用管碟法開展抑菌試驗研究，研究結果對于香椿葉總黃酮成分的開發具有一定的借鑒意義。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

新鮮香椿嫩葉：江西隆平有機農業有限公司，采摘時間不超過24 h，經過低溫烘干，用粉碎機粉碎，粉碎后過100 目篩，放于4 ℃冰箱備用；大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：上海魯微科技有限公司；蘆丁對照品（純度≥98%）：上海圻明生物科技有限公司；亞硝酸鈉：江蘇永華化學科技有限公司；氫氧化鈉、硝酸鋁：國藥集團化學試劑有限公司；乙醇：天津市大茂化學試劑廠。試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

主要儀器設備見表1。

表1 主要試驗儀器設備Table 1 Main experimental equipment

2 試驗方法

2.1 單因素及響應面試驗設計

參考其他[13-15]研究，選取液料比 10 ∶1（mL/mg）～50 ∶1（mL/mg），提取時間 20 min～60 min，乙醇濃度50 %～90%進行單因素試驗，再對三因素做響應面分析試驗，設計方案見表2，確定提取的最佳條件。

表2 響應面設計方案Table 2 Response surface design scheme

2.2 香椿葉總黃酮含量的測定

2.2.1 蘆丁標準曲線的制作

精確稱量10 mg 蘆丁，用70%的乙醇溶解并定容至50 mL，得到蘆丁對照品。分別移取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL 蘆丁對照品于試管中；在各試管中分別加入5 %亞硝酸鈉0.30 mL，振蕩后靜置6 min；再分別加入10 %硝酸鋁0.30 mL，振蕩后靜置6 min；分別加入4%的氫氧化鈉，并用60%的乙醇定容至10 mL，振蕩后靜置16 min；再分別取試管中的溶液于1 cm 的比色皿中置于分光光度計，檢測波長510 nm的吸光度，記錄各個值[16]。選取蘆丁濃度（mg/mL）為X軸，吸光度做Y 軸，見圖1。

得到回歸方程y=13.167x+0.026 43，其中R2=0.99109。結果顯示0 mg/mL～0.06 mg/mL 存在較好的線性關系。

2.2.2 香椿葉總黃酮含量的測定

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

取 5 份香椿葉干燥粉末（1.00 g），在 100 mL 的三角瓶中分別加入香椿葉干燥粉末和不同濃度的乙醇，振蕩搖勻。用超聲波（功率為500 W，提取溫度為60 ℃）在不同時間段進行總黃酮的提取。過濾，加同等體積的無水乙醇沉淀一晚，過濾，再濃縮。依據蘆丁標準曲線測定香椿中總黃酮的含量，然后選取適宜液料比、乙醇濃度和提取時間進行響應面分析。

2.3 抑菌試驗

將3 種供試菌活化，挑取單菌落放于裝有2 mL 生理鹽水的離心管中制備菌懸液[17]。無菌條件下，移取100 μL 菌懸液于LB 固體培養基上，涂布均勻，每種菌各9 個板，每個板上等距放置4 個牛津杯，靜置10 min。

準確稱取香椿葉粉末10.00 g，加入70 %乙醇300 mL，超聲波清洗儀中超聲提取40 min，提取后過濾、濃縮至20 mL，離心，即得到香椿葉乙醇粗提物。用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，待用。

以香椿葉乙醇粗提物原液為基礎，稀釋為3 個濃度梯度：提取原液、50%和25%香椿葉粗提物。同時也將溶劑對照組稀釋為同樣的濃度，觀察不同濃度提取液的抑菌情況[18]。

移取100 μL 各濃度提取液注入3 個牛津杯內，剩余一個為對照組，所有培養皿按此操作，每種供試菌各濃度梯度都進行3 次平行試驗。然后置于細菌培養箱內37 ℃條件下培養24 h，之后觀察抑菌圈大小。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗分析

3.1.1 液料比對提取率的影響

液料比對提取率的影響見圖2。在確定的因素下（超聲功率500 W，提取溫度60 ℃，提取時間40 min，提取溶劑為70%乙醇），液料比與總黃酮含量呈正相關，這可能是因為溶劑增多目標提取物的溶出量也有所提高[19]。但當液料比超過 30 ∶1（mL/mg）后總黃酮提取含量趨于平緩，通過對不同液料比對提取率的影響的研究，響應面設計液料比選定在30 ∶1（mL/mg）～50 ∶1（mL/mg）。

圖2 液料比對總黃酮提取的影響Fig.2 The effect of liquid and material ratio on the extraction of total flavonoids

3.1.2 提取時間對提取率的影響

提取時間對提取率的影響見圖3。

圖3 提取時間對總黃酮提取的影響Fig.3 The effect of extraction time on the extraction of total flavonoids

如圖3，在確定的因素下（超聲功率500 W，提取溫度為 60 ℃，液料比為 30 ∶1（mL/mg），提取溶劑為70%乙醇），考察不同提取時間對于提取量的影響。圖中曲線呈現先升后降的趨勢，在50 min～60 min 下降的可能是因為此時的固相濃度差較小，總黃酮很難進一步溶解；另外也可能是超聲時間過長，會存在機械和空化作用以及熱效應的影響[20]。通過對不同提取時間對提取率的影響的研究，響應面設計提取時間選在40 min～60 min。

3.1.3 乙醇濃度對提取率的影響

乙醇濃度對提取率的影響見圖4。在確定的因素下（超聲功率500 W，提取溫度為60 ℃，液料比為30 ∶1（mL/mg），提取時間 40 min），考察加入不同濃度乙醇對提取量的影響。由圖4 可知乙醇濃度在50%至70%過程中提取量不斷增加，而在70%至80%過程中目標提取物提取量呈現下降趨勢，下降的原因可能是香椿葉中的非目標成分溶出影響了目標提取物的溶出。通過對不同乙醇濃度對提取率的影響的研究，我們選取60%～80%乙醇濃度進行響應面分析。

圖4 乙醇濃度對總黃酮提取的影響Fig.4 The effect of ethanol concentration on the extraction of total flavonoids

3.2 響應面分析法優化提取總黃酮的結果及分析

采用Design-Expert 8.0.5 軟件，按照Box-Behnken試驗設計，以單因素試驗為基礎，以液料比、浸提時間、乙醇濃度為自變量，以總黃酮物質含量為響應值，進行響應面試驗。試驗設計方案及結果見表3。

對表3 的試驗結果進行響應面分析，各因素對總黃酮的影響用公式表示即Y=37.01+5.25A+0.17B－1.09C-1.79AB-1.38AC+1.84BC-5.32A2-2.99B2-4.79C2。對香椿葉總黃酮提取率的回歸模型進行方差分析，結果見表4。

表3 超聲波輔助乙醇提取總黃酮的響應面分析方案及結果Table 3 Response surface analysis scheme and results of ultrasonic assisted ethanol extraction of total flavonoids

表4 總黃酮提取率回歸分析結果Table 4 Regression analysis of extraction rate of total flavonoids

由表4 可知，香椿葉總黃酮的回歸模型P＜0.000 1達到極顯著差異，回歸系數R2=0.981 9 說明對于香椿葉總黃酮的回歸模型的擬合程度較好，因此可以使用該回歸模型來對香椿葉總黃酮提取條件進行分析。從表4 中可以發現 A、A2、B2、C2達到極顯著水平，C 達到顯著水平，AB 和BC 交互項對提取率也有顯著影響。影響香椿葉總黃酮提取率的順序依次為A、C、B。各因素交互影響的響應面圖見圖5。

由圖5 可以看出，B 與A 以及B 與C 的交互作用對提取率影響顯著，這與方差分析的結果一致。

圖5 各因素交互影響的響應面圖Fig.5 Response surface graph of the interaction of each factor

對公式做進一步分析，得到超聲波提取香椿葉總黃酮的最優參數為：液料比41.20 ∶1（mL/mg）、時間35.77 min、乙醇濃度為65.31%，預測香椿葉總黃酮的提取量為38.59 mg/g?？紤]到實際操作，將提取的液料比設定為 41 ∶1（mL/mg）、時間設定為 36 min、乙醇濃度設定為65%，在我們結合實際設定的工藝條件下進行了3 次香椿葉總黃酮的提取，測得提取量為（38.96±0.049）mg/g，說明響應面法的優化工藝參數是可靠的。

3.3 抑菌試驗結果與分析

用不同濃度總黃酮提取液對3 種供試菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及金黃色葡萄球菌）檢測香椿葉總黃酮的抑菌情況，根據不同濃度的香椿葉總黃酮的抑菌情況得到結果見表5。

表5 不同濃度提取液對5 種細菌的抑菌效果Table 5 Bacteriostasis effect of different concentration extracts on three kinds of bacteria

如表5 所示，香椿葉總黃酮原液、50%原液、25%原液對3 種細菌的抑菌效果均是對金黃色葡萄球菌的抑制最明顯，對大腸桿菌的抑制相對最差，并且香椿葉總黃酮原液的濃度越大對于3 種細菌的抑菌效果越強。這一結果與徐強采用AB-8 的大孔樹脂用70%的乙醇純化的黃酮產物的抑菌作用效果大致相同，即香椿葉總黃酮的濃度越高對細菌的抑制效果越明顯；香椿葉總黃酮對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯，但是徐強的結果顯示香椿葉黃酮對大腸桿菌的抑菌效果強于枯草芽孢桿菌，這可能是因為徐強采用的是香椿老葉，會對結果產生影響[6]。

4 討論與結論

近年來有很多提取香椿葉總黃酮的研究，陳叢瑾[21]以總黃酮含量為評價指標，采用正交試驗對香椿葉總黃酮半仿生提取工藝進行優化，但是所得工藝條件時間長、成本較高。正交試驗由于已經是一種比較成熟的試驗，所以能夠滿足一般的試驗需求，但與正交試驗相比，響應面法具有預測性好和能夠更好的反映各因素交互作用對試驗結果的影響[22]。乙醇輔助超聲波法輔助提取香椿葉中總黃酮化合物，這種操作方法具有操作簡便、能耗低、不會破壞生物活性、無毒副作用的優點，所以本試驗采用此方法提取目標提取物，再通過響應面法優化提取條件。

本試驗具體研究了液料比、提取時間、乙醇濃度對香椿葉總黃酮的影響，通過響應面法優化得到的最佳提取參數為：液料比 41 ∶1（mL/mg）、時間 36 min、乙醇濃度 65%，測得提取量為（38.96±0.049）mg/g，與理論值38.59 mg/g 接近。本試驗還探究了目標提取物對3 種不同供試菌種的抑菌作用，發現對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯。這為香椿葉的有效成分提取及綜合應用提供了借鑒。