基于PCR-DGGE技術的古襄陽白酒窖泥微生物多樣性分析

向凡舒，王瑞萍，趙慧君，雷敏，崔夢君，李娜，折米娜，郭壯，張振東

（湖北文理學院食品科學技術學院鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北襄陽441053）

濃香型是中國八大香型白酒之一，主要制作原料是糧谷，經固態發酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成，具有以己酸乙酯為主題復合香的白酒，其產量與銷量均占我國白酒產量與銷量的一半以上[1]。一般而言，濃香型白酒使用泥窖進行固態發酵，在發酵過程中，窖泥的微生物可以進入到糧谷中，因此窖泥中的微生物群落結構對白酒的滋味與風味的形成起到重要作用[2-3]。研究表明，窖泥中的梭菌與乳酸菌的比例是影響白酒品質最主要的因素之一[4-6]。

梭菌是一類細胞形態呈梭狀（鼓錘狀），厭氧或微需氧，革蘭氏陽性，產芽孢的一類細菌。梭菌能夠發酵碳水化合物產生小分子脂肪酸，如丁酸梭菌（Clostridium butyricum）能發酵淀粉等糖類產生丁酸、乳酸以及醋酸，其他梭菌也多數能夠產生一些小分子的有機酸[7-8]，其中最重要的一類梭菌是能夠發酵淀粉等糖類產生己酸的微生物。固態發酵過程中，己酸能與產生的乙醇通過酯化反應產生己酸乙酯，是一種影響濃香型白酒品質的主要因素之一。對于能夠產生己酸乙酯的梭菌，最早是由巴克爾發現的Clostridium kluyviri 和北原分離出來的Clostridium barkeri[9]。后來隨著對國內白酒窖泥中微生物的研究，越來越多的己酸梭菌被發掘出來，甚至應用到窖池的維護及白酒生產。另一類在窖泥中占有較大比例的微生物類群為乳桿菌屬（Lactobacillus），研究顯示，乳桿菌在多個地區的濃香型白酒窖泥中被檢測出來。在對江蘇湯溝酒廠的窖泥研究顯示，高質量窖泥中的乳桿菌相對含量為6.45%，中等質量窖泥中為7.04%，而在退化窖泥中的相對含量高達91.46%[10]。本研究采集了湖北省襄陽市古襄陽酒業的新窖與老窖的窖泥，使用變性凝膠電泳技術對窖泥中的微生物群落結構進行了解析，這為人為調控窖泥中的微生物群落結構以提高白酒品質提供了理論指導，并為從窖泥中分離與收集特定的微生物菌種資源奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥樣品：采集于湖北省襄陽市古襄陽酒業有限公司，將樣品保存在無菌塑料容器內，迅速放置到-70 ℃冰箱備用，新窖下層窖泥樣品記為XS，新窖中層的窖泥樣品記為XZ，新窖上層的窖泥樣品記為XX，老窖下層窖泥樣品記為LX，分別選取5 個窖池，每個新窖窖池采集了3 個樣品，老窖采集了1 個樣品。

丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA·2Na）、尿素（Urea）、過硫酸銨、四甲基乙二胺（N，N，N'，N'-tetramethylethylenediamine，TEMED）、氯化鈉，均為分析純：上海國藥集團化學試劑有限公司；10×聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Buffer（含鎂離子）、dNTP（2.5 mmol/L）、rTaq DNA 聚合酶（5 U/μL）、pMD19-T 載體試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌（Escherichia coli）top10：鄂西北傳統發酵食品研究所微生物實驗室保存；胰蛋白胨、酵母粉：英國OXOID 公司；D5625-02 土壤 DNA 提取試劑盒：美國Omega 公司。引物序列見表1，由天一輝遠公司合成。

表1 所用引物與序列Table 1 The premiers and sequences

1.2 儀器與設備

280CB+手提式高壓滅菌鍋：浙江新豐公司；Veriti PCR 儀：美國ABI 公司；DCode 變性梯度凝膠電泳儀：美國伯樂公司；UVPCDS8000 凝膠成像系統：美國ProteinSimple 公司；CT15E 臺式高速離心機：日本日立；BG-160 隔水式培養箱：上海博訊公司；DYCP-31E 瓊脂糖凝膠電泳系統：北京六一公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺：江蘇蘇凈公司；NanoDrop 2000 超微量紫外分光光度計：美國ThermoScientific 公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥微生物總DNA 提取

將窖泥樣品取出迅速解凍后，稱取1 g，使用土壤DNA 提取試劑盒按照說明書進行窖泥總DNA 的提取，并使用超微量紫外分光光度計測定所提取的DNA質量。

1.3.2 窖泥細菌16S rRNA 的V3 區擴增

以提取到的窖泥總DNA 為模板，使用引物ALLGC-V3F 與 ALL-V3R 擴增窖泥樣品的16S rRNA 的V3 區，PCR 程序參照 Pearce 的條件[11]，略有修改：94 ℃熱啟動 5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 30 s，35 個循環；再 72 ℃延伸 10 min。體系為 50 μL：10×PCR buffer，5 μL；dNTP，4 μL；ALL-GC-V3F 與 ALLV3R（10 mmol/L），各 1 μL；DNA 模板，10 ng，加無菌純水補足50 μL。待PCR 結束后，使用瓊脂糖凝膠電泳檢車PCR 產物的質量。

1.3.3 窖泥細菌的變形梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）

DGGE 的操作參照黃靜的方法[14]進行：下層變性膠濃度梯度從上到下是27%～60%，使用輪式手動灌膠系統灌入下層膠后，加入水將下層膠壓平，待下層膠凝固后，除去加入的水，灌入分離膠。分離膠不含變性劑，長度為3 cm 左右。待上層膠凝固后，小心拔出梳子，將膠板固定好，裝入電泳槽，加入0.5×TAE 并加熱。待電泳液溫度升至60 ℃后，在每個泳道加入15 μL 左右的PCR 產物。初始電壓設置為120 V，待指示劑快速通過上層膠后，將電壓調整為80 V，電泳時間為16 h。

電泳結束后，使用銀染法染色，在掃描儀上拍照保存圖像，標識出特征條帶，并切下來，裝入無菌的1.5 mL 離心管中，加入 50 μL 的無菌水，4 ℃過夜，以之為模板，使用引物ALL-V3F 與ALL-V3R 進行PCR擴增，PCR 體系與PCR 程序參照1.3.2 的方法進行，并將PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 條帶序列測定與分析

PCR 產物的TA 克隆步驟參照黃靜的方法進行[14]，取1.3.3 步驟得到的PCR 產物，進行TA 克隆并測序：首先將 PCR 產物與 pMD19-T 在 16 ℃連接 90 min，連接后轉入大腸桿菌感受態細胞，使用M13F（-47）與M13R（-48）以克隆子為模板進行PCR 驗證，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。挑取陽性克隆子送到天一輝遠（武漢）生物科技有限公司測序。將獲得的序列在NCBI 數據庫Blast 比對，挑取相似度最高的模式菌序列，使用MEGA7.0 軟件[15]以鄰接法構建系統發育樹，確定DGGE 特征條帶序列的系統分類。

1.3.5 乳酸菌16S rRNA 的V3 區擴增

窖泥乳酸菌的PCR 使用帶有GC 夾子的引物Lac-GC-F 與 Lac-R，將退火溫度設為 55 ℃[13]，PCR 程序的其他條件及PCR 體系參照方法1.3.2。

1.3.6 窖泥乳酸菌的DGGE

窖泥乳酸菌的DGGE 變形梯度設置為30%～60%，其他條件與步驟同1.3.3。

1.3.7 條帶序列測定與分析

具體試驗方法與步驟參照1.3.4。

2 結果與分析

2.1 新窖與老窖窖泥的乳酸菌群落結構差異分析

窖泥對濃香型白酒的品質具有極大影響，為解析湖北省襄陽市古襄陽濃香型白酒窖泥的細菌群落結構，比較新窖與老窖的細菌群落結構差異，我們采集了新窖與老窖的窖泥樣品，并進行了變形梯度凝膠電泳，電泳圖譜見圖1。

由圖1 可知，新窖窖池下層的窖泥與老窖下層窖窖泥的圖譜中條帶帶型具有明顯差異，老窖下層的窖泥全菌條帶多于新窖，且條帶類型更為豐富，而新窖則主要集中在圖譜中央的兩條亮帶。由此可見，老窖窖泥中的細菌多樣性可能更為豐富，而新窖則較為單一。為明確DGGE 圖譜中的條帶所代表的微生物類群，切取特征性條帶，編號為A+數字，并對這些條帶進行了TA 克隆與測序，獲得的序列在NCBI 數據庫的比對結果見表2，并根據測序序列與NCBI 最相近的模式種序列建立系統發育樹見圖2。

由表2 及圖2 可知，窖泥中的細菌，通過DGGE法，共檢測到了2 個菌門，分別是厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），其中厚壁菌門的細菌較為豐富，可以分為6 個科，分別為：芽胞桿菌科（Bacillaceae）、梭 菌 科（Clostridiaceae）、Gracilibacteraceae、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）與高溫放線菌科（Thermoactinomyc－etaceae），其中條帶A9 與A14 的序列所代表的微生物類群尚未建立科的分類單位；它們進一步可以分為6個菌屬，為梭菌屬（Clostridium）、Gracilibacter、乳桿菌屬（Lactobacillus）、Sedimentibacter、Syntrophaceticus、Croceifilum，而條帶A13 的序列能與多個屬的模式菌相似度超過了99 %，A12 與A16 與已知模式菌的最高相似度均低于91%，因此無法將它們鑒定為個已知菌屬。

圖1 窖泥總細菌DGGE 圖譜Fig.1 Bacterial profile of DGGE fingerprints from the pit mud samples

表2 窖泥全菌DGGE 特征條帶序列NCBI 數據庫Blast 結果Table 2 The Blast results of bacterial bands sequences from pit mud using the NCBI database

圖2 基于窖泥全菌特征條帶序列的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the bacterial sequence of the DGGE bands of pit mud samples

在這些條帶中，能鑒定為乳桿菌屬與梭菌屬的特征條帶數量最多，分別為5 個和4 個，其次是歸為Petrimonas sulfuriphila 的特征條帶有3 個，但是它們的條帶亮度偏暗。由此表明在窖泥中，梭菌與乳酸菌的豐度最高，這與通過高通量測序法對窖泥的研究結果一致，乳桿菌屬的相對含量超過了50%以上[16]。代表乳桿菌屬的特征條帶可以進一步分類為兩種，第一類特征條帶 A2、A3、A6 與 A20 鑒定為為耐酸乳桿菌（Lactobacillus acetotolerans），條帶類型最多，而另一類條帶A1，與多個乳桿菌的模式種的序列相似度均較高，無法鑒定為具體的種。而梭菌的4 個特征條帶序列則可以進一步分為4 類，其中特征條帶A7、A11 和A18 分別與模式種Clostridium cochlearium、Clostridium fallax及Clostridium butyricum 的相似度為100%，可以鑒定為這3 個梭菌種，而條帶A22 僅與模式菌Clostridium caenicola 的相似度為95%，可能代表了一個新的細菌類群。

由于新窖窖泥DGGE 圖譜（圖1）泳道中間位置的A6 與A7 亮度明顯高于其他特征條帶，而經測序，我們發現基于這兩個條帶序列比對與系統發育關系分析（圖2 與表2），可以分別將他們代表的細菌類群歸為梭菌屬與乳桿菌屬，表明梭菌屬與乳桿菌屬類群的微生物在新窖窖泥中的豐度較高。另外，代表梭菌與乳酸菌的特征條帶數量也是最多的，也證實了這一點。老窖樣品的泳道中，A6 相對應的位置出現的條帶較淺，另外老窖A20 相對應位置則未出現相應的條帶，進一步說明了新窖的窖泥中的乳酸菌類群含量遠遠高于老窖窖泥中的數量，而這可能是導致新窖出產的白酒品質低于老窖的原因，差異主要可能由耐酸乳桿菌引起?；贒GGE 法對瀘州老窖窖泥[17]的研究，同樣檢測大了耐酸乳桿菌的特征條帶，說明在不同地區窖泥中，耐酸乳桿菌可能是窖泥中的共有微生物類群。

窖泥中的梭菌是另一類對白酒品質具有重要影響的細菌類群。DGGE 圖譜中，新窖窖泥特征條帶A7代表Clostridium cochlearium，對應位置的老窖樣品中條帶亮度更高，表明新老窖泥中的該類型梭菌均豐度較高，但老窖泥樣品中的梭菌含量要高于新窖泥樣品。除了A7 之外，老窖窖泥樣品A22 代表的細菌也歸為了梭菌未知種，而對應位置的新窖未出現特征條帶。此外，老窖中特征條帶A11 與A18 對應位置，新窖樣品也未出現相應條帶?？梢?，新窖與老窖雖然梭菌含量均較多，然而梭菌的組成卻顯然不同，新窖中的梭菌種類較為單一，老窖泥樣品中豐度更高，含量也較多。在瀘州老窖及江蘇湯溝的窖泥中，同樣是梭菌含量在老窖窖泥高于新窖窖泥[18-19]。

另外，對于位于不同位置的新窖樣品而言，共有特征條帶以A6 與A7 以及A20 為主，且它們的亮度遠遠高于其他條帶，盡在少數樣品中出現了一些偏暗的零散條帶，但總體上，隨著新窖上中下空間位置的變化，主要的細菌類群無明顯變化，仍然是以梭菌與耐酸乳桿菌為主。

2.2 新窖與老窖窖泥的乳酸菌群落結構解析

為進一步明確新窖中的乳酸菌類型，我們使用乳酸菌專用引物，對新老窖泥中的乳酸菌進行了PCR，并通過DGGE 進一步明確了乳酸菌在新老窖泥中的分布，得到的DGGE 圖譜如圖3 所示。

由圖3 可知，新窖中的最亮的特征條帶仍然集中在圖譜泳道的中央，而對應的位置老窖泳道中并未出現對應帶型。除此之外，老窖樣品泳道中出現的多個特征條帶，并未在新窖中并未出現，表明老窖與新窖之間的乳酸菌差異極大，與細菌的DGGE 分析結果一致。

對這些特征性條帶的序列進行了測序與系統發育分析，具體見表3 和圖4。

盡管在對窖泥中乳酸菌的PCR 時使用了乳酸菌的專用引物[13]，由表3 可知，老窖中的特征條帶L1、L2與L3 代表的細菌類群并未鑒定為乳酸菌，其他特征條帶L4、L9 與L10 鑒定為乳酸菌的2 個屬，分別是腸球菌屬（Enterococcus）與乳桿菌屬，其中腸球菌屬未在全菌DGGE 圖譜中檢測到；新窖中的特征性條帶L5、L6、L7、L8 與 L11 均鑒定為乳酸菌，且屬于乳酸菌的同一個屬，與全菌DGGE 圖譜的結果一致。

由表3 及圖4 可知，新窖窖泥中的主要特征條帶L5、L6、L7、L8 與 L11 代表的乳酸菌均鑒定為了耐酸乳桿菌，表明新窖窖泥中乳酸菌中耐酸乳桿菌占有絕對優勢，而根據DGGE 圖譜，在相應的位置老窖樣品泳道并未出現這些特征條帶。于此同時，老窖中的特征條帶的序列經測序與分析，可以將它們鑒定為4 個屬，分別是Pelospora、Pelotomaculum、腸球菌屬與乳桿菌屬，而條帶L2 的序列與序列相似度最高的模式菌低于97%，因此可能代表了Marinilabiliaceae 科的新屬。在老窖樣品泳道中出現的代表乳酸菌的特征條帶均為在新窖中出現，條帶L4 與L10 與多個腸球菌屬的多個模式菌相似度均超過了100%，條帶L9 與植物乳桿菌等多個模式菌的相似度也超過了100%，無法將這些條帶代表的乳酸菌歸到已知某個乳酸菌種的分類單元中。因此老窖中的乳酸菌以植物乳桿菌類群與腸球菌為主，而新窖窖泥樣品中以耐酸乳桿菌為主?？偟膩碚f，從空間排布上來看，來自5 個不同新窖上中下的窖泥中，特征條帶的數量與帶型并無明顯差異，也說明了古襄陽新窖窖泥中的乳酸菌類群差異不大。

圖3 窖泥樣品乳酸菌DGGE 圖譜Fig.3 Lactic acid bacterial profile of DGGE fingerprints from the pit mud samples

表3 窖泥乳酸菌DGGE 特征條帶序列NCBI 數據庫Blast 結果Table 3 The Blast results of lactic acid bacterial bands sequences from pit mud by NCBI database

3 結論

基于變性梯度凝膠電泳技術對新窖與老窖窖泥的全菌與乳酸菌的研究表明，古襄陽新窖與老窖窖泥中的微生物群落結構具有極大的差異，新窖中的細菌群落結構豐度低于老窖，且主要以乳桿菌屬中的耐酸乳桿菌為主，而老窖中的細菌群落多樣性更高，且以梭菌為代表的厚壁菌門類群為主，且含有的耐酸乳桿菌低于PCR-DGGE 的檢測限。進一步的研究證實，老窖中的乳酸菌以腸球菌屬乳酸菌以及植物乳桿菌類群為主，而新窖的窖泥樣品均未檢測到中這兩類的乳酸菌，主要以耐酸乳桿菌為主。

圖4 基于16S rRNA V3 區的窖泥乳酸菌系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the V3 region of 16S rRNA from pit mud samples