超聲波協同酶法提取黃山貢菊總黃酮及其抗氧化活性

史建俊 李偉偉 王免 李秀秀 莊雪燕

摘要 [目的]黃山貢菊總黃酮（total flavonoids from Huangshan Gongju，HGTF）提取工藝優化和抗氧化活性測定。[方法]以HGTF提取率為指標，采用單因素和正交試驗優化超聲波協同酶法提取HGTF工藝。通過自由基清除試驗評價HGTF的抗氧化活性。[結果]HGTF的最佳提取條件為酶解時間20 min、復合酶質量分數0.1%、纖維素酶和果膠酶配比1∶1、乙醇濃度60%、料液比1∶20（g∶mL）、超聲時間40 min、超聲功率280 W、超聲溫度50 ℃，HGTF提取率為2.78%?？寡趸钚栽囼灲Y果表明，HGTF溶液對DPPH·、·OH和O2·-的清除率較高，分別為90.47%（0.05 mg/mL）、73.44%（0.10 mg/mL）和78.73%（0.10 mg/mL）。[結論]復合酶解后超聲波提取HGTF條件溫和、提取率高。該研究為HGTF的應用提供參考依據。

關鍵詞 黃山貢菊;總黃酮;超聲波協同酶法;抗氧化活性

中圖分類號 R284.2文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）24-0174-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.24.049

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Ultrasonic Assisted Enzymatic Extraction of HGTF and Antioxidant Activity

SHI Jianjun，LI Weiwei，WANG Mian et al （School of Chemistry and Chemical Engineering，Huangshan University，Huangshan，Anhui 245041）

Abstract [Objective] To optimize the extraction process and antioxidant activity of HGTF. [Method] Taking the HGTF yield as index，the extraction process was optimized by single factor experiment and orthogonal experiment. The oxidation resistance of HGTF was evaluated by scavenging tests for different free radicals. [Result]The optimum extraction conditions were finally determined as follows，enzymolysis time of 20 min，mass fraction of complex enzyme of 0.1%，cellulasepectinase ratio of 1∶1，ethanol concentration of 60%，solidliquid ratio of 1∶20，ultrasonic time of 40 min，ultrasonic power of 280 W，ultrasonic temperature of 50℃，the extraction rate of HGTF was 2.78%.The results of antioxidant activity test showed that the scavenging rate of HGTF solution to DPPH·，·OH and O2·- was high. The clearance rates to DPPH·，·OH and O2·- were 90.94% （0.05 mg/mL），73.44% （0.10 mg/mL） and 78.73% （0.10 mg/mL），respectively. [Conclusion]Ultrasonic extraction of HGTF after complex enzymatic hydrolysis has mild conditions and high extraction rate. This research provides some reference for the further application of HGTF.

Key words Huangshan Gongju;Total flavonoids;Ultrasonic assisted enzymatic extraction;Antioxidant activity

菊花為菊科植物菊（Chrysanthemum morifolium Ramat）的頭狀花序。黃山貢菊為中國藥典中5種藥用菊花之一，具有平肝、明目、清熱、解毒等功效[1]，而且菊花屬于藥食兼用植物。菊花中主要含有黃酮、萜類、揮發油類等化學成分[2]。藥理學研究主要集中在抗氧化、抗菌消炎[3]、免疫調節、抗腫瘤[4]、保護心血管[5]、保肝作用[6]等方面，近年來新發現菊花提取物還具有抗癲癇作用[7]、預防干眼[8]、腸道菌群調節[9]的作用。

黃酮類物質是藥用菊花發揮藥效的主要成分之一。研究表明菊花黃酮也具有抗氧化性[10]、降血脂[11]和抗腫瘤[12-13]等活性。新的研究發現菊花黃酮可以通過α-葡萄糖苷酶和PTP-1B信號途徑的雙重調節，增加INS-1細胞胰島素分泌和顯著降低空腹血糖水平，從而可以用于糖尿病的治療[14]。黃酮的提取常用溶劑提取法、微波提取[15]、超聲提取等，現今，有些學者改進了提取方法，如采用酶提取法、超臨界CO2萃取法[16]、高壓水提法[17]、低共熔溶劑提取法[18]等。酶可以使植物細胞壁水解破碎，有利于胞內黃酮類物質的溶出[19]，與傳統提取方法相比，環境友好、提取率高。超聲波在液體中高頻振動而產生空穴作用，加快細胞組織破壞，縮短提取時間，提高黃酮得率[20]。超聲波協同酶法結合2種方法的優點，已廣泛應用于黃酮提取中。

為進一步開發黃山貢菊的綜合利用價值，該研究以黃山貢菊為原料，采用超聲波輔助復合酶法進行HGTF的提取條件優化，并通過檢測其清除自由基的能力初步研究HGTF的抗氧化活性，旨在為黃山貢菊資源的深加工提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。黃山貢菊（黃山儒香園茶業有限公司）;纖維素酶（南寧龐博生物工程有限公司）;果膠酶（福州飛凈生物科技有限公司）;蘆丁標準品（國藥試劑公司）;DPPH（合肥巴斯夫生物科技有限公司）;水楊酸（天津福晨化學試劑有限公司）;其他試劑均為AR級。

1.1.2 儀器。KQ超聲波清洗機（昆山超聲儀器公司）;紫外可見分光光度計（北京普析通用公司）;粉碎機（廣州晨雕機械公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線。參照文獻[21]，蘆丁濃度和吸光度線性回歸方程為A=14.058C-0.000 6（R2=0.999 4），說明蘆丁在0.004～0.052 mg/mL線性關系良好。

1.2.2 HGTF提取率的測定。稱取黃山貢菊粉末1.0 g于燒瓶中，加入10 mL蒸餾水，再加入一定量的復合酶。50 ℃水浴鍋中保溫酶解后，高溫滅活，再超聲提取，抽濾得到的濾液用40%的乙醇溶液定容到50 mL，得到HGTF溶液，稀釋后按“1.2.1”項下的方法，在510 nm處測定吸光度，計算HGTF提取率：

總黃酮得率=C×n×V×10-3W×100%

式中，C為HGTF含量（mg/mL），n為稀釋倍數，V為測量體積（mL），W為貢菊質量（g）。

1.2.3 單因素試驗。分別考察料液比（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）、超聲溫度（D）、乙醇濃度（E）、酶解時間（F）、復合酶配比（G）、復合酶質量分數（H）對HGTF提取率的影響。單因素水平見表1。

1.2.4 正交試驗。綜合單因素試驗中各因素對HGTF提取的影響，選擇料液比（A）、超聲時間（B）、超聲功率（C）和超聲溫度（D）為考察因素，以HGTF提取率為評價指標，采用正交試驗L9（34）優化提取工藝條件。因素與水平見表2。

1.2.5 工藝驗證試驗。按“1.2.4”得到的最佳提取工藝條件進行提取，根據5次平行試驗結果計算HGTF提取率。

1.2.6 HGTF抗氧化活性試驗。分別配制濃度為0.005、0.010、0.030、0.050、0.100、0.150、0.200和0.250 mg/mL的HGTF提取液和VC溶液，參考文獻[21]的方法，測定對DPPH·、·OH和O2·-的清除能力。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對HGTF提取率的影響。由圖1可知，當料液比超過1∶20（g∶mL）后HGTF提取率緩慢降低。其原因可能是加入的溶劑量越大，貢菊細胞內外濃度差越大，溶劑的擴散滲透作用也越強，溶解的黃酮類化合物增多，提取率逐漸升高。但當加入的溶劑量達到一定程度時，黃酮的浸出量達到飽和，而其他雜質的溶出相應增多，從而使提取率逐漸下降。因此適宜料液比為1∶20。

2.1.2 超聲時間對HGTF提取率的影響。由圖2可知，隨著超聲時間的延長HGTF提取率先增加后下降。其原因可能是超聲處理可有效地破壞貢菊細胞壁，促使細胞內更多的物質溶出，從而使黃酮的提取率升高。但隨著時間的延長，較多的雜質也會隨之溶出，從而導致HGTF提取率下降。因此適宜的超聲時間為40 min。

2.1.3 超聲功率對HGTF提取率的影響。由圖3可知，隨著超聲功率的升高，HGTF提取率先顯著增大，后又顯著降低。其原因是當超聲功率逐漸增大時，就會達到其最低空化閾值，其空化作用將細胞破碎，利于胞內組分的浸出;當繼續增大超聲功率，其空化閾值也隨之升高，空化不易產生，且已空化的氣泡無充分時間發生爆裂，空化強度減弱[22]。因此適宜的超聲功率為280 W。

2.1.4 超聲溫度對HGTF提取率的影響。由圖4可知，當逐漸升高超聲溫度時，HGTF提取率先顯著升高，而后又降低?？赡苁怯捎诟邷仄茐牧素暰罩悬S酮類化合物的結構，并且增加了雜質的溶出量。故超聲適宜溫度為50 ℃。

2.1.5 乙醇濃度對HGTF提取率的影響。由圖5可知，HGTF提取率隨著乙醇濃度先增大后減少。說明采用低濃度乙醇時，溶解的黃酮類化合物較少;隨著乙醇濃度的增加，傳質推動力增大，HGTF溶出增加;但采用60%以上乙醇濃度時，脂溶性雜質的溶出增加，致使HGTF提取率下降。因此乙醇濃度選擇60%比較合適。

2.1.6 酶解時間對HGTF提取率的影響。由圖6可知，20 min 的時間使復合酶與底物結合并充分反應，發揮其最大的酶解作用，使貢菊中的黃酮類化合物溶出完全。而較長的酶解時間可能使貢菊中有效成分在受熱條件下發生分解。因此，選擇酶解時間20 min較為適宜。

2.1.7 復合酶配比對HGTF提取率的影響。由圖7可知，隨著2種酶配比的改變，HGTF提取率先增大后減小。因為隨著纖維素酶在復合酶中所占比重增加，果膠酶所占比重減小，果膠酶對于細胞的分離作用減弱，致使纖維素酶不能充分地將細胞壁降解，細胞內有效成分不能完全溶出。因此，適宜的纖維素酶和果膠酶配比為1∶1。

2.1.8 復合酶質量分數對HGTF提取率的影響。由圖8可知，隨著復合酶質量分數的提高，HGTF提取率先增加后減小，當復合酶用量達到貢菊重量的0.1%時，HGTF提取率達到最高。因此，適宜的復合酶質量分數為0.1%。

2.2 正交試驗

由表2的極差值分析可知，提取條件中超聲溫度（D）對HGTF提取率的影響最大，其次是超聲功率（C），而料液比（A）和超聲時間（B）影響較小。再分析各因素不同水平下的綜合平均值k，可依次得到A1、B2、C2、D2為最優水平。因此，HGTF提取的最佳條件為A1B2C2D2，即料液比1∶20、超聲時間40 min、超聲功率280 W、超聲溫度50 ℃。在此條件下進行工藝驗證試驗，HGTF得率為2.78%。

2.3 HGTF抗氧化活性研究

2.3.1 對 DPPH·的清除作用。由圖9可知，0.05 mg/mL濃度下HGTF溶液和VC溶液對DPPH·的清除率分別為90.47%和95.29%，此后清除率增長緩慢。0.25 mg/mL濃度下HGTF溶液的清除率（95.53%）與同濃度VC溶液的清除率（95.41%）幾乎相同，說明HGTF對DPPH·的清除效果較強。

2.3.2 對·OH的清除作用。由圖10可知，2種溶液對·OH的清除效果隨著濃度增大不斷升高。 0.10 mg/mL的HGTF溶液和VC溶液對·OH的清除率分別達73.44%和90.86%，說明HGTF溶液對·OH的清除效果低于VC溶液，但也有較好的清除效果。

2.3.3 對 O2·-的清除作用。由圖11可知，HGTF和 VC的濃度與O2·-清除率之間存在量效關系。0.1 mg/mL的HGTF溶液和VC溶液對O2·-的清除率分別為78.73%和95.44%，相同濃度下HGTF溶液對O2·-的清除效果低于VC溶液。

3 結論

復合使用果膠酶與纖維素酶對黃山貢菊粉末進行酶解，果膠酶降解細胞壁中的果膠，降低細胞間的黏結作用，使細胞破碎分離，再利用纖維素酶處理降解細胞壁，2種酶協同作用，增強了對細胞壁的破壞程度，加速細胞內HGTF的溶出。經單因素和正交試驗優化，超聲波協同酶法提取HGTF得率為2.78%?？寡趸囼灲Y果表明，HGTF溶液對DPPH·有很強的清除能力，與VC溶液無較大差異，同時對·OH和O2·-的清除效果良好。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版一部[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：310.

[2] 王德勝，黃艷梅，石巖，等.菊花化學成分及藥理作用研究進展[J].安徽農業科學，2018，46（23）：9-11，17.

[3] 黃春華，謝美強，王小平，等.野菊花不同炮制品的提取物對5種常見致病菌抑菌效果的對比實驗[J].抗感染藥學，2020，17（4）：473-476.

[4] 瞿璐，王濤，董勇喆，等.菊花化學成分與藥理作用的研究進展[J].藥物評價研究，2015，38（1）：98-104.

[5] PEI L X，SHU S N，WANG X Y，et al. Effect of chrysanthemum extract on myocardial fibrosis in rats with renovascular hypertension[J]. Journal of traditional Chinese medicine，2019，39（4）：542-549.

[6] 范蘭蘭，張姍姍，姚夢雪，等.菊花炒制前后化學成分變化及對CCL4所致小鼠急性肝損傷的影響[J].中國中藥雜志，2020，45（13）：3144-3154.

[7] SALEM G A，ALAMYEL F B，ABUSHAALA F A，et al. Evaluation of the hepatoprotective，antiinflammatory，antinociceptive and antiepileptic activities of Chrysanthemum trifurcatum[J].Biomedicine & pharmacotherapy，2019，117：1-7.

[8] 陳立浩，時健，劉倩宏，等.菊花總黃酮對去勢所致干眼雄兔淚腺組織中AR、AR mRNA、Bax mRNA及形態學的影響[J].湖南中醫藥大學學報，2020，40（4）：406-411.

[9] LI Y F，HAO Y M，GAO B Y，et al. Chemical profile and in vitro gut microbiota modulatory，antiinflammatory and free radical scavenging properties of Chrysanthemum morifolium cv. Fubaiju[J]. Journal of functional foods，2019，58：114-122.

[10]黃涵年.杭白菊總黃酮提取物的體外抗氧化性及抑菌活性研究[J].現代農業科技，2019（23）：221-222，231.

[11] 王淑靜，李源馨.野菊花總黃酮降血脂作用的實驗研究[J].現代食品，2017（3）：123-125.

[12] LIU Y H，MOU X，ZHOU D Y，et al. Extraction of flavonoids from Chrysanthemum morifolium and antitumor activity in vitro[J]. Experimental and therapeutic medicine，2018，15（2）：1203-1210.

[13] 喬魏，荊新鑫，李明，等.基于網絡藥理學的昆侖雪菊總黃酮對食管癌細胞的抗瘤作用[J].新疆醫科大學學報，2019，42（9）：1216-1222.

[14] CHEN M Z，WANG K L，ZHANG Y N，et al. New insights into the biological activities of Chrysanthemum morifolium：Natural flavonoids alleviate diabetes by targeting αglucosidase and the PTP1B signaling pathway[J]. European journal of medicinal chemistry，2019，178：108-115.

[15] 田明杰，譚宏淵，葉帆宇，等.福白菊總黃酮的微波輔助提取工藝優化及其抗氧化活性研究[J].中國釀造，2020，39（1）：170-174.

[16] 王玲玲，邊祥雨，高蔚娜，等.植物類黃酮提取純化技術研究進展[J].營養學報，2019，41（6）：606-610.

[17] 王廣慧，魏雅冬，于德涵，等.高壓熱水浸提法提取金針菇黃酮的純化及活性測定[J].食品科技，2019，44（9）：228-235.

[18] 孫平，董萍萍，董丹華，等.超聲波輔助低共熔溶劑提取野菊花總黃酮的工藝研究[J].食品工業科技，2020，41（20）：147-152.

[19] 劉曉飛，劉寧，張娜，等.超聲波輔助酶法提取甜玉米穗軸黃酮及抑菌性檢測[J].食品科學，2014，35（20）：79-82.

[20] 蘆宇，呂長鑫，紀秀鳳，等.超聲波-纖維素酶輔助提取紅樹莓籽黃酮及其體外消化研究[J].中國食品學報，2019，19（11）：100-107.

[21] 張冰潔. 金銀花葉中黃酮類化合物的提取、純化及抗氧化研究[D].洛陽：河南科技大學，2017：38.

[22] 王涓，潘忠禮，馬海樂，等.超聲波的空化作用及其對多酚穩定性的影響[J].食品工業科技，2014，35（19）：388-391.