H4 亞型和N2 亞型禽流感病毒二重RT-PCR 檢測方法的建立

（廣西壯族自治區獸醫研究所，廣西獸醫生物技術重點實驗室，廣西南寧 530001）

關鍵字：禽流感病毒；H4 亞型；N2 亞型；二重RT-PCR；檢測方法

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬正黏病毒科A 型流感病毒屬，為分節段、單股負鏈RNA 病毒。根據 AIV 血凝素（hemagglutinin，HA）和神經氨酸酶（neuraminidase，NA）抗原性不同，目前已發現18 個HA 亞型（H1—H18）和11 個 NA 亞型（N1—N11）[1-2]。根據致病性不同，這些亞型分為高致病性AIV（HPAIV）和低致病性AIV（LPAIV），其中部分H5 和H7 亞型AIV 屬于HPAIV，其余均為LPAIV。

H4 亞型AIV 屬于LPAIV，能感染各類家禽及野鳥，還可跨種傳播，感染哺乳動物[3]，在AIV流行調查中分離率較高。該型AIV 常分離到的亞型組合是H4N2。因此，建立一種同時鑒定H4 亞型和N2 亞型AIV 的檢測方法十分必要。

診斷H4 亞型和N2 亞型AIV 的傳統方法主要是病毒分離鑒定：將采集的咽喉和泄殖腔棉拭子或組織樣品接種SPF 雞胚增殖病毒96～120 h；收集雞胚尿囊液進行血凝試驗（HA），對HA 陽性樣品進行血凝抑制試驗（HI），鑒定H 亞型；通過PCR 擴增NA 基因并克隆測序鑒定N 亞型。該方法雖然結果準確可靠，但耗時較長、操作繁瑣，在實際應用中有一定的局限性。多重RT-PCR 是在普通PCR 基礎上建立的多基因檢測體系，可同時檢測多個靶基因或片段，具有省時省力的優點，已被廣泛應用于病原體檢測[4-6]。本研究旨在建立一種同時鑒別H4 亞型和N2 亞型AIV 的二重RTPCR 檢測方法，為H4N2 亞型、H4 亞型和N2 亞型AIV 的快速診斷提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、血清和毒株

DNA/RNA 共提試劑盒，購自北京天根生物技術公司；AMV 反轉錄酶、dNTP 等反轉錄試劑、2×TaqPCR Mix 和pMD 18-T 克隆載體，購自TaKaRa 公司；SPF 雞胚，購自北京梅里亞公司。H1、H3、H4、H6、H9 亞型AIV 抗血清，由廣西壯族自治區獸醫研究所制備保存。本研究所用毒株信息詳見表1。

表1 所用毒株信息

1.2 引物設計與合成

下載GenBank 基因庫中H4 亞型AIV HA 基因、N2 亞型AIV NA 基因序列，用DNAstar 軟件比對序列，在保守區域，用引物設計軟件Primer Premier 5.0 設計和篩選引物，經NCBI-blast 驗證，最終得到2 對特異性引物，分別用于H4 亞型和N2 亞型AIV 檢測。引物信息詳見表2，序列送至Invitrogen 公司合成。

表2 H4 和N2 亞型AIV 引物信息

1.3 核酸提取與反轉錄

參照DNA/RNA 共提試劑盒說明書，抽提病毒RNA 以及傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）和血清4 型禽腺病毒（FAdV4）的DNA。參照反轉錄體系，將RNA 反轉錄為cDNA，并保存在-30 ℃，備用。

1.4 條件優化

對H4 亞型和N2 亞型的引物終濃度，在0.1～1.0 μmol/L 范圍內進行優化，確定2 對引物同時使用時的最佳濃度；在50～60 ℃范圍內依次進行溫度遞增，確定最佳退火溫度。

1.5 特異性試驗

用優化好的二重RT-PCR 反應體系，分別對不同亞型AIV（H4N2、H1N1、H1N2、H3N2、H3N6、H3N8、H4N6、H5N2、H6N2、H6N6、H7N2、H9N2）、新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、ILTV 和FAdV4 的cDNA/DNA 模板進行檢測，檢驗該法的特異性。

1.6 敏感性試驗

參照HA 和NA 基因全長引物[7]，以H4N2 亞型AIV 為模板進行RT-PCR，將HA 和NA 基因的PCR 產物分別連接至pMD 18-T 克隆載體，轉化至大腸桿菌DH5α，挑取單菌落進行PCR 鑒定，并將陽性重組菌送至Invitrogen 公司測序。以H4 和N2 測序正確的陽性重組菌為模板提取質粒，測定質粒濃度，并倍比稀釋至108～101拷貝/μL。以不同梯度的質粒為模板，用建立的方法分別進行檢測。

1.7 臨床樣品檢測

用該法對廣西南寧市活禽市場采集的152 份棉拭子樣品（同只活禽的咽喉和泄殖腔拭子為1 份）進行檢測。同時，將上述棉拭子樣品接種9 日齡SPF 雞胚增殖病毒，收集24～120 h 內的雞胚尿囊液進行HA 試驗；對HA 陽性的分離液，用常見AIV 亞型（H1、H3、H4、H6、H9）抗血清進行HI 試驗，確定H 亞型。參照文獻[7]，對已確定為H 亞型的樣品，用NA 基因全長引物對其進行PCR擴增、克隆和測序，確定N 亞型。

2 結果與分析

2.1 最佳反應條件

經引物濃度和退火溫度優化，確定最佳反應體 系（25 μL）為：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，H4和N2 亞型上下游引物（25 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 2.0 μL，加dH2O 至25 μL；最佳反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 50 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35 個循環；72 ℃ 延伸10 min，12 ℃結束。

2.2 特異性試驗

特異性結果見圖1。該法對H4N2 亞型AIV 擴增出322 bp（H4 亞型）和224 bp（N2 亞型）兩個目的條帶；對H4N6 亞型AIV 擴增出322 bp 的目的條帶（H4 亞型）；對H1N2、H3N2、H5N2、H6N2、H7N2、H9N2 均擴增出224 bp 的目的條帶（N2 亞型）；對其他亞型AIV（H1N1、H3N6、H3N8 和H6N6）、NDV、IBV、ILTV 和FAdV4均無擴增條帶，表明無交叉反應。

圖1 二重RT-PCR 特異性試驗結果

2.3 敏感性試驗

敏感性結果見圖2。該法對H4 亞型和N2 亞型AIV 108～105拷貝/μL 質粒的檢測，均有明顯的條帶；對104拷貝/μL 質粒的檢測，H4 亞型AIV仍有較亮的條帶，N2 亞型目的條帶較弱，但仍能檢測到；對103拷貝/μL 的檢測，H4 亞型和N2 亞型均檢測不到，無目的條帶。該法最低檢測到104拷貝/μL 的H4 亞型和N2 亞型AIV。

2.4 臨床樣品檢測

用該法檢測152 份活禽棉拭子樣品，檢出H4亞型AIV 5 份、N2 亞型AIV 9 份，與病毒分離鑒定結果一致。

圖2 二重RT-PCR 敏感性試驗結果

3 討論

H4 亞型AIV 于1956 年首次被分離到，然后頻繁在亞洲、歐洲和北美洲的家禽和野鳥流行調查中被檢測到[8-11]。H4 亞型AIV 宿主范圍較廣，包括雞、火雞、水禽、濱鳥、鸚鵡、海獅、馬和豬等，但水禽和濱鳥是其主要宿主[12-13]。H4 亞型是常分離到的AIV 亞型之一，已有多種基因型在我國中部、東部和南部活禽市場被分離到，并且與其他亞型發生了復雜的基因重組[14-16]，因此其在流感病毒進化中的作用不容忽視[17]。雖然尚未有H4 亞型AIV 致人死亡和導致家禽大規模死亡的案例，但流行調查結果提示，需要定期監測該亞型的流行態勢和遺傳進化情況。N2 亞型也是常被分離到的AIV 亞型之一，常見的組合有H1N2、H3N2、H4N2、H6N2 和H9N2 等。在H4 亞型AIV 感染中，H4N2 亞型組合較普遍，因此有效檢測H4 亞型和N2 亞型AIV 的方法，對禽流感早期預警和防控十分關鍵。所以，本研究建立了同時鑒定H4 亞型和N2 亞型AIV 的檢測方法，以期為禽流感的有效防控提供技術支撐。

多重PCR 可同時擴增出2 個以上的目的片段，能同時檢測不同病原體的目的基因。而引物設計是多重PCR 技術的關鍵。由于在同一個反應體系中使用多對引物，在擴增中可能存在競爭，因此在設計篩選引物時，需考慮以下幾個因素：（1）引物之間會不會相互結合而產生非特異性擴增或引物二聚體，導致檢測不準確或擴增效率降低；（2）多對引物目的片段大小要間隔100 bp 以上，只有這樣才能用瓊脂糖凝膠電泳區分開；（3）多對引物的退火溫度需接近，以確保各擴增產物量相對平衡。

4 結論

本研究建立的二重RT-PCR 方法特異性好、敏感性高和重復性好，不僅可快速鑒別H4N2 亞型AIV，還可確定是否存在H4 亞型（包括與N2 亞型及其他N 亞型的組合）、N2 亞型（包括與H4亞型及其他H 亞型的組合）AIV，從而為禽流感的有效防控提供了技術支撐。