化學發光免疫分析技術在動物疫病檢測中的應用

（漯河市動物疫病預防控制中心，河南漯河 462000）

化學發光免疫分析（chemiluminesecence immunoassay，CLIA）是基于免疫反應原理，結合化學發光檢測技術而建立的一種免疫檢測技術。它是繼放射免疫技術（RIA）、免疫熒光技術（IF）、酶免疫技術（EIA）之后發展起來的。與RIA、EIA等相比，CLIA 除具有靈敏度高和特異性強的優勢外，還具有無放射性污染、檢測線性范圍寬、檢測效率高、操作簡便的特點，目前已被廣泛應用于生命科學、醫學診斷、食品安全以及環境監測等領域[1]，是發展和推廣應用最快的標記免疫分析技術之一。近年來，CLIA 技術開始引入動物疫病檢測領域，其在靈敏度、穩定性和檢測效率上明顯優于酶聯免疫吸附測定方法（ELISA），且可實現高通量和自動化檢測，已在H9 亞型禽流感、鴨甲型肝炎、豬細小病毒病、豬繁殖與呼吸綜合征、O 型口蹄疫、小反芻獸疫、布魯氏菌病等疫病檢測中得到了應用。本文闡述了CLIA 技術的原理、發展及在動物疫病檢測領域中的應用，以期為動物疫病化學發光免疫檢測方法研究提供參考。

1 CLIA 技術原理

CLIA 是將化學發光作為免疫反應的指示系統，用化學發光相關物質標記抗體或抗原，與待測物質發生特異性反應后，再加入其他相關物質使發光物發光，從而根據光信號強度來確定待測物質濃度的方法。CLIA 技術包括化學發光檢測技術和免疫反應，其中免疫反應是基礎。免疫反應是指在一定條件下，抗原與相對應的抗體結合形成抗原-抗體復合物的特異性反應?；瘜W發光本質是一種光輻射，是伴隨化學反應而產生的?；瘜W發光劑分子通過吸收化學反應過程產生的能量，從基態躍遷到激發態，當處在較高能級激發態的分子重新躍遷到較低能級的基態時，會釋放等能級的光子，從而產生化學發光?；瘜W發光的光信號強度可以由儀器檢測。在一定的化學反應中，發光強度與反應體系中物質濃度正相關，因此可以在一定的化學反應環境條件下，通過化學發光強度來測定待測物濃度。

在目前的CLIA 方法中，有兩種主要標記方法：一是用化學發光劑直接標記抗原或抗體，在一定條件下反應，使發光劑產生化學發光從而進行物質測定分析。常用的發光劑有魯米諾類和吖啶酯類，其經氧化劑或催化劑作用后即可快速穩定發光，產生的光量子強度與所測抗體或抗原濃度呈比例。二是用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶類標記抗原或抗體，即化學發光酶免疫分析方法。它是在酶聯免疫分析的基礎上，用化學發光劑作為底物，在酶的作用下產生化學發光，根據發光強度來測定待檢物質濃度。還有一種是電化學發光免疫分析（ECLI）方法。不同于前兩者，它是在電極表面由電化學引發特異性發光反應，以電子得失過程中的電位差作為能量激發源的免疫分析方法，一般采用三聯吡啶釕[Ru（bpy）3]2+為標記物，由電化學反應啟動。

2 CLIA 技術發展

1977 年，Halmann等[2]首先提出CLIA 技術。早期的CLIA 技術雖然有較強的特異性，但因光信號持續時間太短、靈敏度不高，未廣泛應用于臨床檢測。20 世紀80—90 年代，國外學者研究發現：在辣根過氧化物酶催化的魯米諾發光反應中，加入6-羥基苯并噻唑及其衍生物類或對位取代的苯酚類化合物等物質后，可以顯著增強HPR-Luminol-H2O2體系的發光信號強度，延長化學發光持續時間[3-4]；而且，用吖啶酯衍生物直接標記抗體或抗原可以產生較高的光信號，金剛烷衍生物在堿性磷酸酶作用下也可發出高強度的輝光，光信號可持續l～2 h[5-6]。隨后，國外生產廠家研制開發出相應試劑盒和全自動CLIA 系統，自此CLIA 技術開始被廣泛應用于臨床檢測。1990 年，Leland等[7]建立了電化學發光反應系統，大大提高了化學發光免疫檢測的靈敏度，穩定性、檢測效率和線性范圍。

近年來，隨著一些新材料、新技術的發展成熟，特別是金納米粒子、SiO2納米粒子、碳納米管、量子點以及它們的復合納米結構在高靈敏CLIA 檢測方法構建中的廣泛應用，化學發光免疫分析取得了突破性進展。首先在靈敏度上，通過研究新的化學發光劑、催化劑、增強劑及固相材料，優化化學反應條件，用小蛋白封閉生物功能界面，篩選制備高特異性抗原和單克隆抗體，修飾ECLI 中的電極表面，轉移化學發光共振能量等手段，使CLIA 方法發光信號強度和穩定性大大增強，靈敏度和特異性大大提高。其次，化學發光免疫分析與流動注射、毛細管電泳、微陣列芯片及免疫傳感器等先進技術的聯用，實現了高分離能力、高通量、自動化、快速、高效和多組分檢測，促進了化學發光技術的快速發展，也拓寬了其應用范圍。

3 CLIA 技術在動物疫病檢測中的應用

隨著各國對CLIA 技術研究的不斷深入，其已應用到了許多動物疫病的臨床檢測中。歐盟已經將CLIA 方法作為牛海綿狀腦?。˙SE）的快速檢測手段之一，并準備推廣為小反芻動物疫病，如綿羊癢?。═SE）等的快速檢測手段[8]。

3.1 病毒檢測

2015 年，亓文寶等[9]成功建立了H9 亞型禽流感病毒抗體ECLI 方法。此方法具有高度特異性，與其他亞型病毒無干擾，且能夠實現快速、高通量檢測，具備臨床推廣條件。鄭小龍等[10]建立了檢測血清中鴨黃病毒抗體的CLIA 方法。該方法特異性強、敏感性高，與鴨瘟、鴨病毒性肝炎和禽流感病毒抗體無交叉反應，最低可檢測出1:6 400 稀釋血清中的鴨黃病毒抗體，靈敏度為中和試驗的56 倍，適用于流行病學調查及監測。銀鳳桂等[11]2017 年研究建立了一種快速、靈敏、特異、重復性好的化學發光酶免疫檢測方法（CLEIA），適合鴨甲型肝炎的批量檢測診斷，檢出限低至1:0.289～1:1.5，也可用于鴨甲型肝炎免疫后的抗體監測以及雛鴨體內母源抗體的定量分析。

Zhang等[12]通過用羥氨放大金納米顆粒反應來增強化學發光信號，建立了超靈敏、簡便、快速、特異性強、重復性好的豬圓環病毒2 型化學發光檢測方法。Zhou等[13]將HRP 和檢測抗體同時固定在金納米粒子表面，形成金納米粒子探針，建立了一種快速、簡便、靈敏的檢測豬細小病毒抗體的CLIA 方法。該方法檢測限遠低于ELISA 方法。Yang等[14]基于磁性納米顆粒建立了高效檢測偽狂犬病毒的CLIA 檢測方法，其最低檢測限為100 amol/（5 pmol/L）。張社民等[15]將化學發光檢測系統和ELISA 相結合，建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測新方法，并成功制備出了試劑盒供臨床應用。

2017 年，邵康等[16]以金-石墨烯納米復合材料為電活性基質，硅包聯吡啶釕納米粒子為電化學發光信號標簽，利用生物素-鏈霉親和素-生物素構建了三重和多重信號放大的檢測豬偽狂犬病毒抗體的電化學發光免疫傳感器，檢測范圍為50 ng/mL～1 pg/mL，最低檢測限可達到0.40 pg/mL，與ELISA 和熒光測定分析方法相比，靈敏度更高，檢測線性范圍更寬，重現性和穩定性更好。同時利用碳納米管作為量子點載體，通過多孔鉑金納米管的催化作用和β-環糊精與金剛烷“橋”作用，采用“抗體-抗原-抗體”雙抗體夾心模式，構建了信號放大的近紅外電化學發光傳感器，實現了對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的高靈敏檢測。在19 ng/mL～19 pg/mL 范圍內，電化學發光信號強度與豬繁殖與呼吸綜合征病毒濃度呈線性相關（R2=0.9 951），最低檢出限為10.8 pg/mL，與ELISA 和PCR 方法相比具有更高的靈敏度和更寬的線性檢測范圍。

2016 年，崔辰等[17]利用豬O 型口蹄疫病毒VP1 重組蛋白為包被抗原，成功建立了一種快速檢測豬O 型口蹄疫病毒抗體的CLEIA 檢測方法，較傳統的ELISA 法，其敏感性和精密度都大大提高，與豬A 型、Asia 1 型口蹄疫病毒以及豬偽狂犬病、豬瘟、豬細小病毒病、豬圓環病等病原均無交叉反應，板內和板間變異系數分別為1.10%～6.70%和0.66%～4.80%，具有較好的特異性和重復性，可用于豬O 型口蹄疫病毒抗體檢測。2018 年，王世杰等[18]建立了一種高效O 型口蹄疫高通量LPBCLIA 定性檢測方法，用單一稀釋倍數對樣本血清進行稀釋，代替LB-ELISA 中對樣本的倍比稀釋，通過計算抑制率來判定測定結果，使檢測通量提高了5 倍左右，同時用化學發光檢測技術替代酶免檢測技術，提高了方法的靈敏度和穩定性。重復性試驗結果顯示，該方法檢測結果穩定，具有很好的可重復性。通過臨床樣品檢測發現，與國家參考實驗室蘭州獸醫研究所O 型口蹄疫抗體LPB-ELISA 檢測試劑盒相比，該方法敏感性為94.6%，特異性為95.6%，符合率為95.1%，證明其具有良好的敏感性和特異性，可大大提高檢測效率和材料利用率，為豬O 型口蹄疫檢測提供了更為高效、經濟的新方法。2018 年，Liu等[19]建立了檢測口蹄疫病毒3A 和3B 中兩種重組表位蛋白抗體的CLIA 方法，能夠準確區分口蹄疫病毒感染抗體和疫苗免疫抗體，有效解決了非結構蛋白（NSPs）對滅活疫苗污染而導致較高的假陽性率問題。

2019 年，任雪健等[20]建立了小反芻獸疫病毒抗體化學發光酶免疫分析檢測方法，用魯米諾作為發光底物代替傳統的TMB 底物，提高了檢測的敏感性、穩定性。通過臨床樣本測定發現，該方法與法國ID-VET 試劑盒的陽性和陰性符合率均大于95%，且與羊O 型口蹄疫病毒、綿羊痘病毒和山羊痘病毒等羊常見病毒無交叉反應，可用于小反芻獸疫病毒感染或疫苗免疫抗體水平檢測。

3.2 細菌檢測

目前，CLIA 技術在細菌檢測上的應用主要集中于人獸共患病檢測方面。Hu等[21]報道了一種基于AuCl4-增強型魯米諾CLIA 檢測方法。該方法能夠特異性測定血清中的豬傳染性胸膜肺炎Apx Ⅳ抗體，與IHA、ELISA等常規檢測方法相比，在靈敏度和實用性方面具有顯著優勢，適用于大規模血清樣品的篩選。Mutz等[22]將CLIA 技術與流動注射技術、免疫芯片技術結合起來，建立了檢測戊型肝炎?。℉EV）和腸源性耶爾森氏菌抗體的CLIA 方法，實現了快速、高通量、自動化的檢測分析。這種方法可在9 min 內完成檢測，能夠靈敏、特異地同時檢測血清中HEV和抗耶爾森菌IgG抗體。Morel等[23]建立了檢測炭疽桿菌的ECLI 法，檢出限為3×102CFU/mL，靈敏度較高。Liebes等[24]設計了化學發光免疫傳感器用于檢測抗布魯氏菌抗體。該方法采用光纖作為換能器，將布魯氏菌顆粒固定到光纖上，檢測限可低至0.207 μg/mL；較ELISA 耗時少，操作簡單，適合布魯氏菌病現場診斷。Vidziunaite等[25]經長期研究，建立了一種檢測布魯氏菌病和兔土拉桿菌病的高靈敏度增強型CLIA 方法，其檢測線性范圍較傳統方法有了較大提高。2016 年，Fei[26]等建立了一種基于納米顆粒的檢測白痢沙門氏菌的夾心電化學免疫分析方法。該方法用金納米粒子修飾還原氧化石墨烯作為電化學標記，用抗雞白痢沙門氏菌抗體與二氧化硅包被的磁性納米粒（SiO2/Fe3O4）來識別目標沙門氏菌，在102～106CFU/mL 范圍內呈良好的線性關系，檢測限低至89 CFU/mL，具有成本低、操作簡便等優點，為臨床分析提供了一種有效的檢測方法。

在國內，房芳等[27]研究建立了一種可同時檢測3 種沙門氏菌（豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌）的間接CLEIA 檢測方法。此方法簡便、快速，具有良好的特異性，與其他3 種常見腸道致病菌無交叉反應，檢測限為1×104CFU/mL，檢測準確率可高達97.33%。2017 年，范龍興等[28]將CLIA 技術與磁分離技術、夾心法 ELISA 相結合，建立了檢測單核細胞增生性李斯特菌的化學發光磁酶免疫分析方法。該方法在104～108CFU/mL 范圍內呈良好的線性關系（R2=0.954），最低檢出限為104CFU/mL，特異性良好，對檢測環境要求不高，操作簡單，檢測時限僅為3～4 h，適用于單增李斯特菌的快速檢測。2019 年，辛思培等[29]建立了針對腸出血性大腸桿菌O157:H7 的雙抗夾心CLEIA 檢測方法。該方法最低檢測限為2.5×104CFU/mL，比ELISA 方法提高了4 倍左右，具有良好的特異性，與其他大腸桿菌、副溶血弧菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、單增李斯特菌、銅綠假單胞菌等致病菌均無交叉反應。在精密度方面，批內和批間變異系數分別為2.10%～3.71%和2.16%～7.14%，證明其有良好的精密度，為O157:H7 污染檢測提供了一種準確度高、特異性強的檢測手段。

3.3 寄生蟲檢測

青憲等[30]采用磁性納米顆粒作為免疫反應載體，建立了一種用于檢測兔血清中日本血吸蟲抗體的CLEIA 方法。該方法檢測下限為1:13 442，靈敏度高，線性范圍寬，特異性好。Singh[31]分別采用ELISA 和液相化學發光酶免疫分析方法，檢測已知感染弓形蟲的豬和貓血液病料，發現后者的檢測靈敏度遠高于前者，而前者不能靈敏地測出貓血液樣本中的弓形蟲抗體含量。目前化學發光免疫分析法已廣泛應用于弓形蟲病的檢測診斷。

4 展望

目前，CLIA 方法在醫學診斷、藥物分析以及微生物檢測等方面應用非常廣泛，尤其是在人類醫學的臨床檢測上，有取代放免分析技術和酶免分析技術成為醫學檢測主要手段的趨勢，但在動物疫病檢測方面的應用仍處于發展階段。因此，要將CLIA 方法廣泛應用于動物疫病檢測和防控，必須加大對動物疫病CLIA 方法的研究，不斷提高檢測的靈敏度，拓寬檢測范圍，增強方法特異性、穩定性。為了更好地將該方法應用于市場，需要發展新型發光檢測儀器，發展多通道、多組分檢測和快速、自動化檢測方法。

近年來，CLIA 技術與新傳感器技術、微流控芯片技術等的聯用，磁性微粒子（MPs）、金納米粒子等新型材料在CLIA 中的應用以及新型反應增強劑和發光劑的出現，使得CLIA 的選擇性、靈敏度、檢測效率和檢測通量都得到進一步提高，其正向著高特異性、高靈敏度、高通量、快速和自動化檢測的方向發展。同時基于化學發光能量轉移的均勻免疫分析[32]以及開發高通量、全自動及便攜式檢測儀器等也將成為CLIA 技術發展的方向。隨著人們對人獸共患病以及食品安全等問題的重視，CLIA技術將會在動物疫病檢測、診斷、微生物檢測、藥物殘留分析及環境監測等領域發揮更大的作用。