GC-MS/MS在研究生實驗教學中的應用

虞俊超， 陳翠紅， 徐利斯， 馬小東， 孟鳳林， 展思輝

(南開大學 環境科學與工程學院，天津 300351)

0 引 言

研究生實驗教學是高校研究生培養的重要組成部分，是提高研究生科研水平和創新能力的中心環節[1-2]。在環境分析領域，熟練掌握相關儀器分析技術與方法對研究生進行科學研究及日后從事相關工作至關重要。雖然目前國內多數高等院校已開設了研究生的儀器分析實驗教學課，但受實驗條件限制，課程普遍與本科實驗相近，實驗教學內容拓展不足，這不利于研究生的高質量培養[3]。

氣質聯用儀因其兼有氣相色譜的單一流動相(通常為He)供應優勢、高效色譜分離能力及質譜對未知物的強大定性/定量功能而被廣泛應用于熱穩定性較好的中小分子化合物分析。由于其較寬廣的使用范圍，氣質聯用測試已成為化學、環境科學、環境工程等專業儀器分析課程的常見實驗內容。國內關于氣質聯用實驗的實踐探索很多，但多是面向本科生且使用氣相色譜-單級質譜聯用儀(GC-MS)進行實驗教學[4-8]。然而在實際的環境檢測中，單級質譜(MS)常受到復雜環境樣品的基質干擾，有時無法滿足目標物的確證分析需求。相比于單級質譜，串聯質譜(MS/MS)可對目標物進行二次裂解，有效地提高了測試的選擇性和靈敏度，因此在環境分析中發揮著愈發重要的作用[9]。

近幾年，在國家“統籌推進世界一流大學和一流學科建設”計劃支持下，我校環境科學與工程學院陸續購置了一批高精尖儀器，集中于大型儀器平臺共享使用，這對學院教學及科研發展形成了強有力的支撐。一流的研究生教育是高校實現“雙一流”建設目標的基石[10]。為進一步提高研究生的科研實踐能力，學院儀器平臺依托其較優越的設備條件和專職教師豐富的分析測試經驗，以必修課的形式開設了一系列的現代儀器分析課程(70學時)。本文涉及的“氣相色譜-串聯質譜聯用(GC-MS/MS)測定土壤中的硝基苯”就是其中的一節實驗課，課程緊系環境專業特色，并基于GC-MS/MS多樣的定性/定量功能拓寬儀器分析實驗內容，同時積極進行多元化教學方法實踐，對研究生的氣質聯用實驗教學進行探索。

1 GC-MS/MS實驗教學選題情況簡述

實驗課面向研究生，考慮到他們將來科研工作中可能遇到更復雜多樣的氣質聯用測試需求，因此選用GC-MS/MS進行實驗教學。如圖1所示，GC-MS/MS主要由5部分組成，分別為氣相色譜、離子源、質量分析器、檢測器及數據系統。進樣后樣品各組分先通過氣相色譜進行高效分離，然后依次進入離子源完成離子化(形成帶電離子)，質量分析器按離子質荷比(m/z)實現分離分析，檢測器將樣品中不同組分的存在情況轉化為電信號，最后通過數據系統進行數據的匯總及處理。平臺購置的氣質聯用設備采用大氣壓化學電離源(APCI)進行測試，因其優異的靈敏度和選擇性，該軟電離技術已被大量應用于GC-MS(/MS)分析測試中[11]。

圖1 GC-MS/MS結構解析

與單四級桿質譜(MS)不同，三重四級桿串聯質譜(MS/MS)由一級四級桿(MS1)，線性加速碰撞室及三級四級桿(MS2)3部分(見圖1)構成。樣品離子先進入MS1篩選出目標物的特征母離子；母離子與氣體(Ar)碰撞，裂解產生子離子；再由MS2捕集子離子。GC-MS/MS的結構特性使其可提供更多分析模式：質譜全掃描模式(MS scan)和子離子掃描模式(Product ion scan)可分別用于樣品組分的母離子和子離子電離特征分析，選擇離子監測模式(SIM)和多反應監測模式(MRM)可分別選擇目標物的特征母離子、母離子-子離子對進行定量分析。

硝基苯(Nitrobenzene)是一種芳烴類化合物，在農藥、紡織、炸藥等工業領域生產活動中應用廣泛[12]。早在1989年，硝基苯就被國家環保局列入“水中優先控制污染物黑名單”。2016年，為切實加強土壤污染防治工作，國務院印發土壤污染防治行動計劃，公布的污染物檢測名單也包括硝基苯。土壤中硝基苯類污染物定量分析常選用氣質聯用儀(EI源)[13]，但目前尚無基于APCI源離子化的GC-MS(/MS)分析報道。依托學院大型儀器平臺的設備條件，設計了GC-APCI-MS/MS測定土壤基質中硝基苯的實驗教學課程，將科研項目轉化為實驗課程，豐富了實驗的可探索性，有利于激發研究生的專業學習興趣，培養科研創新思維。

2 實驗教學目標的設定

(1) 通過教學，開拓學生的知識面，了解GC-MS/MS的結構與工作原理。

(2) 通過實驗，掌握GC-MS(/MS)的主要操作方法，加深學生對氣質聯用儀開展環境分析測試的認識。

(3) 通過文獻調研，讓學生結合各自未來的研究方向，了解氣質聯用分析測試的適用范圍，充分調動學生的主動學習興趣，為將來的科研工作做準備。

3 實驗準備與流程設計

3.1 試劑與材料

丙酮、正己烷、乙酸乙酯(色譜級)及無水硫酸鈉(分析級)購自天津市化學試劑六廠。硝基苯標準儲備液：1 g/L。弗羅里硅土SPE柱(500 mg/3 mL)購于東莞市譜標實驗器材科技有限公司。無水硫酸鈉使用前在馬弗爐中300 ℃烘烤2 h，冷卻后放入試劑瓶備用。

天亮后，先后有兩個人扒著木排求救。男人沒有再阻攔，任表姐把他們一個一個拉上木排。第二個上岸的人見表姐沒穿衣服，身子抖得厲害，就脫下自己的衣服，擰干，讓表姐穿上。那是件中山裝，厚厚的卡其布料，外掛四個兜。應該是干部裝，不知道是水里撈的還是那男人自己的。楊小水穿在身上又胖又長，連下身也罩得嚴嚴實實的。

3.2 儀器分析條件

Agilent 7890B-Waters Xevo TQS型氣相色譜-串聯質譜聯用儀。

(1) 氣相色譜條件。進樣方式：不分流進樣，進樣量1 μL，進樣口溫度250 ℃，載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min。選用DB5-MS UI柱30 m×0.25 mm×0.25 μm，升溫程序：起始溫度40 ℃，保持4 min，以20 ℃/min升溫至280 ℃，保持2 min。運行時間18 min，溶劑延遲為6 min，傳輸線溫度280 ℃。

(2) 質譜條件。采用大氣壓氣相色譜技術(APGC)，APCI電離源，正離子化模式，電暈針電壓2.0 μA，離子源溫度：150 ℃，MS scan掃描范圍：20～300 m/z，Product ion scan 掃描范圍：20～200 m/z。

3.3 土壤樣品制備

樣品前處理是完成待分析物提取、凈化和富集的重要過程，對后續的分析測試效果影響顯著[14]?？紤]到土壤樣品處理過程復雜，實驗耗時過長，課程采用教學演示的方式對樣品前處理各步驟用途、質量控制等方面進行詳細講解，具體制備流程如下：稱取約10.0 g樣品放入燒杯中，以20 mL丙酮-正己烷(1∶1, V/V)超聲提取30 min，提取結束后使用離心機3 000 r/min離心5 min(提取流程重復3次)，合并有機提取液；提取液經無水硫酸鈉柱除水后，使用弗羅里硅土柱凈化樣品：依次用10 mL正己烷、10 mL乙酸乙酯淋洗柱子，土壤提取液裝載后，選用12 mL乙酸乙酯洗脫；將洗脫液氮吹至近干，使用正己烷定容至1 mL，待上機測試。

3.4 實驗流程設計

實驗流程如圖2所示。以小組的形式(每組3～5人)開展實驗教學，保證學生都能進行儀器操作。設計了兩套實驗方案，通過抽簽分配儀器分析實驗內容，引導不同組別的學生協作完成單級質譜的SIM和串聯質譜MRM方法開發，并將兩套方法對土壤基質樣品的測試效果進行比較，讓學生對GC-MS(/MS)的主要定性/定量功能有較全面的了解。

圖2 GC-MS(/MS)實驗流程設計

4 多元化教學方法探索

研究生是儀器分析實驗教學過程中的學習主體，教師須改變以往“灌輸式”的教學培養方式，增強教學的直觀性、互動性、探索性，建立以學生為中心，教師為引導的新型教學關系[15-16]。為進一步提高實驗教學效率，達到鞏固研究生專業知識學習，提高科研創新能力的目標，課程從4個方面進行多元化的教學方法探索(見圖3)。

圖3 多元化的大型儀器分析教學方法實踐

(1) 健全課前預習制度。強化學生課前預習。通過文獻資料調研，讓學生對硝基苯這類污染物的檢測意義，儀器分析方法有所認識，以此鍛煉學生的主動學習能力；開課前安排5 min，讓學生重溫實驗講義，使學生對教學內容與方式，實驗準備流程、操作方法及相關注意事項有所了解，這有助于學生盡快進入課堂學習狀態，提高學習效率。

(3) 開展基于問題的課堂回顧與討論。要求學生在教學完成后積極提問，設置課堂回顧與討論環節，并將此環節表現納入成績考核。通過課堂知識點回顧，深化學生對相關知識點的理解；提出問題本身就是一種更主動的學習過程，通過對問題的交流與討論，可以有效強化同組學生對實驗原理、方法的理解，也提高了學生們對儀器分析的探索興趣和創造能力。

(4) 課后開放性問題拓展。針對本次實驗教學內容，設置開放性問題，讓學生結合自己的研究方向，進行相關資料的再檢索。通過對實驗現象進行開放性探索，有助于穩固學生知識積淀，提高實驗教學效果。

5 實驗結果與討論

5.1 氣相色譜條件選擇

在課前文獻調研的基礎上[12]，讓學生對氣相色譜儀主要參數進行設置。進樣口溫度設定為250 ℃，確保硝基苯能以氣態的形式進入色譜柱。實驗選用DB5-MS UI非極性毛細管柱，設置梯度升溫程序將硝基苯與樣品雜質進行高效分離。選擇正己烷作為溶劑，制備標樣和土壤基質樣品，在GC分析6 min后啟動質譜，切除溶劑峰，減少溶劑對GC-MS/MS分析測試的干擾。通過標準品的總離子流色譜圖確定硝基苯的保留時間為10.2 min。

5.2 質譜掃描條件優化

相比于單級質譜(MS)，串聯質譜(MS/MS)可以提供更多樣的掃描模式。在GC-MS/MS實驗過程中，可以先使用質譜全掃描(MS Scan)了解硝基苯的APCI源電離行為，篩選出豐度較高的母離子，再采用子離子掃描模式(Product ion scan)觀察特征母離子的裂解特征，結合兩級質譜的掃描信息有助于推斷待分析物的分子離子結構。錐孔電壓、碰撞能量分別是MS Scan、Product ion scan模式中的重要調控參數，通過參數條件的梯度實驗操作，使學生直接觀察到參數值的更改對儀器響應的影響，既培養學生嚴謹的科研思維，也加深了他們對GC-MS/MS結構及測試原理的理解。硝基苯標準品的MS/MS掃描結果見圖4，在APCI源離子化條件下，最優錐孔電壓為25 V，全掃描譜圖中最強峰是m/z 123.9，根據質荷比推斷應該是硝基苯(C6H5NO2)的質子化離子[M+H]+，其余特征母離子主要為m/z 94.1、77.2及105.0。譜圖里的m/z 148.7可能來源于氣相系統中的酞酸酯類化合物干擾，該現象在其他氣質聯用測試中也有報道[17]。選擇高豐度的母離子m/z 123.9，通過設置不同碰撞能量(10～30 eV)進行子離子掃描，記錄產物離子m/z 77.0、93.8、51.0、66.1的最優碰撞能量參數。

通過質譜掃描條件優化，對硝基苯化合物建立了基于單級質譜的SIM定量方法，以及基于串聯質譜的MRM定量方法，具體參數見表1。

5.3 土壤基質樣品測試效果

采用外標法定量: 配制20、50、200、500、1 000 ng/mL硝基苯標準溶液，以目標化合物的濃度值為橫坐標，峰面積為縱坐標，建立5點校準工作曲線。結果顯示在0～1 000 ng/mL范圍內測試線性效果良好，相關系數R2≥0.994 0。使用GC-MS/MS方法對土壤樣品中的硝基苯含量進行測定，未有檢出。通過對土壤基質加標樣品(800 ng/mL)進行測定，全面比較SIM與MRM兩種定量方法對真實環境樣品的測試效果差別，不同方法的提取離子色譜分析效果如圖5。分析結果表明，與SIM方法相比，串聯質譜MRM方法選用母-子離子對進行分析測試，能明顯降低土壤基質干擾，并增強色譜峰的信噪比值，顯著提高儀器分析測試的靈敏度。通過比對實驗，學生對GC-MS(/MS)的環境分析測試效果有了更直觀的認識，這有益于他們日后科研工作的開展。

圖4 硝基苯的質譜掃描條件優化

表1 基于MS(/MS)的硝基苯定量和定性離子選擇

圖5 GC-MS(/MS)對土壤加標樣品的測定效果比對

6 結 語

為提高學生的分析操作、創新及團隊協作能力，將大型儀器氣相色譜-串聯質譜聯用儀引入到研究生的儀器分析實驗課程中，選題為“GC-MS/MS測定土壤中的硝基苯”。課程緊系環境專業特色，并基于新設備多樣的測試功能，設計兩套氣質聯用定性/定量思路，引導學生協作式開展儀器分析實驗，使學生對GC-MS(/MS)的主要分析測定功能有較全面的了解。同時為切實提高教學效果，從健全課前預習制度、貫徹對比性教學、開展基于問題的課堂回顧與討論、課后開放性問題拓展4個方面進行多元化教學方法實踐。該實驗課開設已歷時2年，對研究生科研實踐能力的培養助力明顯，教學效果良好。依托儀器平臺的先進設備開展實驗教學，課程本身也可看作是環境專業研究生的“公用儀器操作準入培訓”，這為后續的公用實驗室大型儀器開放，學生自主操作儀器開展科研工作奠定了堅實的基礎。