天然植物抗菌液凝膠膏劑流變學特性及燙傷修復作用研究

楊飄，付鵬德，韋樂華，郝靜，向飛丹州，茆燦泉

(1.西南交通大學生命科學與工程學院，四川 成都 610031； 2.云南普洱丹州制藥股份有限公司，云南 寧洱 665199)

天然植物抗菌液(natural plant antimicrobial solution，PAMs)是云南普洱丹州制藥股份有限公司出品的一種多功能酊劑產品，具有抗菌消炎、促進傷口愈合、治療皮膚潰爛以及抗腫瘤等多種功效[1]。凝膠制劑已經廣泛地用于治療皮膚燒傷和燙傷，具有創面緊密貼合不粘連、減少微生物滋生、藥物緩慢釋放、延長作用時間、減少用藥次數、不污染衣物和方便使用等優點[2-3]。為此，將PAMs與凝膠制劑相結合，可望進一步強化PAMs功效、獲得皮膚生物相容性良好、且藥物作用時間長的透皮多功效制劑。

凝膠膏劑兼具固體和液體的特性，屬于透皮藥物傳遞系統，最早應用于日本[4]。中藥材中水溶性藥物成分很多，非常適合載入水凝膠基質，是目前研究的熱點[5-7]。遺憾的是，現階段關于水凝膠的配方評價尚缺乏一套完整統一且操作簡便、準確的評價方法[8-9]。對于交聯型凝膠膏劑的基質來說，流變學參數如復數模量(Complex modulus，G*)、儲能模量(Storage modulus，G′，也稱彈性模量)、損耗模量(Loss modulus，G″，也稱黏性模量)、相位角(Phase angle，δ)可間接反映交聯水平?；|的固體特性與G′ 有關，可以使凝膠膏劑擁有更大的內聚力；液體特性與G″有關，可以使基質和皮膚緊密的接觸，提高滲透率的同時增強療效；δ和G*用來表示凝膠膏劑基質的交聯程度，從而可較準確地評價凝膠膏劑的穩定性[10]。線性黏彈區(Linear Viscoelastic Region，LVR)可以確定凝膠基質承受壓力范圍的能力，當應力超過LVR的范圍時，復數模量G*明顯下降，表明此時其內部結構已經被破壞，穩定性下降[11-12]。目前，關于凝膠膏劑流變學研究的文獻報道較少，本文以聚丙烯酸高分子(Viscomate NP-700)為骨架材料制備載藥(PAMs)凝膠膏劑，結合它對大鼠燙傷模型的修復程度，初步探究PAMs凝膠膏劑的流變學特性及藥效作用[13-14]。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器

1.1.1 試藥 PAMs:云南普洱丹州制藥股份有限公司，2015年獲批云南省醫院制劑(滇藥制字Z20150009)；甘油、EDTA、Viscomate NP-700、酒石酸、無水乙醇、氮酮、丙二醇、薄荷醇、SDS(成都市科龍化工試劑廠)；甘羥鋁(梯希愛上?；晒I發展有限公司)。

1.1.2 儀器 AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；AKUP-TV-10愛科超純水機(振大水處理器材有限公司)；三用恒溫水箱(北京科偉永興儀器有限公司)；TA DHR-1高級旋轉流變儀(美國TA儀器公司)。

1.1.3 動物 14只健康Wistar大鼠，體質量260～280 g，成都達碩實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(川)2015-030。

1.2 方法

1.2.1 不同溫度和處理時間下水凝膠基質的制備 以甘油∶Viscomate NP-700∶甘羥鋁∶PAMs∶水∶酒石酸∶氮酮∶丙二醇∶SDS=30∶4∶0.4∶31.7∶27.2∶0.2∶3∶3∶0.5(質量比)制備凝膠基質[15-16]?？紤]PAMs酊劑產品的酒精揮發性，設置3種不同的溫度和處理時間制備凝膠基質：將新制備的凝膠50 ℃恒溫固化24 h后室溫25 ℃靜置2 d形成凝膠(記為：50 ℃-24 h，樣品1)；50 ℃恒溫固化6 h后室溫25 ℃靜置，總固化時間3 d(記為：50 ℃-6 h，樣品2)；室溫25 ℃，固化3 d，備用(記為：25 ℃-24 h，樣品3)。

1.2.2 正交設計優化水凝膠基質 采用L9(34)正交表設計正交試驗(見表1)，稱取0.4%甘羥鋁，EDTA 0、0.2%、0.4%，Viscomate NP-700 4.0%、6.0%、8.0%，分別按順序分散于30%甘油中，混勻，作為A相；稱取酒石酸 0、0.2%、0.4%，促透劑(氮酮3.0%+薄荷醇0.3%、丙二醇3.0%+薄荷醇0.3%、氮酮3.0%+丙二醇3.0%)，31.7%PAMs，0.5%SDS，溶于水中，攪拌均勻作為B相。將B相緩慢倒入A相，邊加邊攪拌，然后倒入直徑2.0 cm的圓形模具內，凝膠厚度控制在1.5 mm左右，50 ℃恒溫固化24 h后室溫25 ℃靜置2 d形成凝膠備用。同時根據促透劑的不同，制備3種不含PAMs的空白凝膠對照(分別記為#10、#11、#12)，各成分配比為甘羥鋁0.4%、EDTA 0.2%、Viscomate NP-700 6.0%、甘油30%、酒石酸 0.2%、促透劑(氮酮3.0%+薄荷醇0.3%、丙二醇3.0%+薄荷醇0.3%、氮酮3.0%+丙二醇3.0%)、31.7%乙醇(50%)、0.5%SDS、水。

表1 L9(34)正交試驗設計

Table1L9(34) orthogonal experimental designw/%

水平因素A(NP-700)B(EDTA)C(酒石酸)D(促透劑)14.000氮酮3.0+薄荷醇0.326.00.20.2丙二醇3.0+薄荷醇0.338.00.40.4氮酮3.0+丙二醇3.0

1.2.3 凝膠膏劑基質流變學特性的考察 采用旋轉流變儀，在室溫(25±0.1) ℃下進行流變學性能的檢測，平板夾具直徑為20 mm，間距設定1 000 μm，在流變儀動態振蕩模式下進行試驗，應力(σ)設置在0～500 Pa，頻率(f)設為1.0 Hz，檢測3種樣品的線性黏彈區(LVR)。在LVR區域內，選取固定應力為50.0 Pa，頻率設在0.016～16.0 Hz進行掃描，測定各樣品的流變學參數G*=[(G′)2+ (G″)2]1/2、G′、G″、δ(Tanδ=G″ /G′)[10]。

1.2.4 大鼠燙傷模型的建立與修復初步觀察 14只健康Wistar大鼠飼養于SPF動物房中，自由飲食，適應1周后，稱體質量。腹腔注射7.0%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉、固定。向帶有刻度的玻璃管(r=8.5 mm)中注入沸水2.0 mL，持續處理背部脫毛皮膚20 s，致深Ⅱ度燙傷，燙傷面積約為2.27 cm2。每只大鼠背部造模2個傷口并用苦味酸標記，隨機分為4組，分別為PAMs組、PAMs水凝膠膏劑組、空白凝膠組和陰性處理模型組。每日給藥1次，給藥前先用生理鹽水擦拭傷口。每帖凝膠膏劑0.7 g(含PAMs 31.7%)，等量PAMs 246.6 μL。將制備好的水凝膠膏劑，從模具中取出，置于醫用無紡布上，敷貼于大鼠患處，并用膠帶十字固定，敷16 h后取下；PAMs滴涂，拍照觀察[17]。以上所有試驗均重復3次。

2 結果

2.1 不同溫度和時間對PAMs凝膠膏劑強度的影響

樣品1(50 ℃-24 h)、樣品2(50 ℃-6 h)、樣品3(25 ℃-24 h)的LVR值分別為1～500、1～188、1～144 Pa，即LVR值排序為樣品1>樣品2>樣品3，見圖1。其中，樣品3的LVR范圍最低，說明在應力范圍下體系結構最容易被破壞，更有可能斷裂，更不穩定。對于3個不同樣品，隨著頻率的升高，G′值和G″值均呈現上升趨勢，且樣品1>樣品2>樣品3，即樣品1擁有更大的內聚力和皮膚黏附性，見圖2(a)、(b)。在0.016～11 Hz內，Tanδ值排序為樣品3>樣品2>樣品1，即樣品1彈性特性占比最大，凝膠固體化性質最突出；11～16 Hz內，樣品3>樣品1>樣品2，即樣品3黏性特性占比最大，凝膠液體化性質最突出，見圖2(c)。G*值排序為樣品1>樣品2>樣品3，與LVR順序一致，即樣品1交聯程度最大。溫度升高以及時間延長可導致交聯速度增大，見圖2(d)。

1200100080060040020001002003004005006000G*/Paσ/Pa50℃-24h50℃-6h25℃-24h

圖1不同制備條件下PAMs凝膠膏劑應力與復數模量的關系

Figure1Relationship between stress and complex modulus of PAMs gel paste by different preparation conditions

2.2 不同基質成分對凝膠強度的影響

將正交試驗獲得的#1～#9號凝膠膏劑從模具中取出，初步感官感受PAMs凝膠膏劑的成型性及強度依次為配方#9、#7、#5、#4、#3、#2、#8、#1、#6，見圖3(a)。其中，配方#6、#8 LVR范圍小，體系結構容易被破壞和不穩定，見圖3(b)。

PAMs凝膠膏劑的內聚強度由大到小依次為配方#9、#8、#5、#7、#4、#1、#2、#3(凝膠6結構不穩定，排除比較)，見圖4(a)、(d)G*、G′ 變化。PAMs凝膠膏劑的黏附性由大到小依次為配方#9、#8、#1、#5、#4、#7、#2、#3，見圖4(b)G″ 變化。配方#1、#3、#8凝膠液體化性質更明顯，#7、#5、#4凝膠固體化性質更明顯，隨著Viscomate NP-700濃度的升高凝膠強度增大，見圖4(c)tanδ變化。

100090080070060050040030050℃-24h50℃-6h25℃-24h50℃-24h50℃-6h25℃-24h50℃-24h50℃-6h25℃-24h50℃-24h50℃-6h25℃-24hG'/Paf/Hz250200150100500G″/Pa12001000800600400200G*/Pa0.240.200.160.120.080.04101214161802468tanδ(a)(b)(c)(d)f/Hz101214161802468

a.頻率與儲能模量的關系； b.頻率與損耗模量的關系； c.頻率與相位角tan δ的關系； d.頻率與復數模量的關系。

a. 9種PAMs凝膠膏劑的表觀性狀； b. 9種PAMs凝膠膏劑應力與復數模量的關系。

a.頻率與儲能模量的關系； b.頻率與損耗模量的關系； c.頻率與相位角tanδ的關系； d.頻率與復數模量的關系。

圖49種PAMs凝膠膏劑的流變學性能
Figure4Rheological properties of nine PAMs gel paste

2.3 PAMs凝膠膏劑初步藥效測定

陰性處理模型組(negative group)的傷口色澤沒有變化，周邊無翹起痕跡；空白凝膠組(#10，#11，#12)也是如此，2組恢復效果幾乎相同，說明含50%乙醇的空白凝膠對燙傷基本沒有修復作用。配方#3組痂體邊緣翹起，有脫落趨勢；#1、#2、#4、#9組第5天痂體邊緣翹起；PAMs 組在第4天時右邊傷口已有明顯恢復趨勢，第5天時痂體邊緣已經翹起，將要脫落，皮膚上有淺紅色恢復痕跡。以上結果表明，PAMs與PAMs凝膠膏劑對燙傷均有較好的修復作用。對比分析后，初步認為修復效果依次為#3、#4、#1、#2、#9、#6、#7、#5、#8(見圖5)。

2.4 PAMs凝膠膏劑性能的綜合評估

結合PAMs凝膠膏劑表觀成型性和黏彈性、動物燙傷試驗，對正交試驗中9種不同PAMs凝膠膏劑進行打分評價[9](評分標準見表2)，其中考慮綜合因素，經驗性地將成型性和黏彈性設置權重為30%，動物模型評價為70%。由評分結果(見表3)可知,影響因素C(酒石酸)>因素B(EDTA)>因素A(NP-700)>因素D(促透劑)，最優組合為A1B1C2D3，即NP-700 4.0%、酒石酸0.2%、氮酮3.0%、丙二醇3.0%，不含EDTA。

圖5PAMs凝膠膏劑處理對大鼠燙傷模型傷口愈合的作用
Figure5Wound healing of rats scald model treated with PAMs gel paste

表2 PAMs凝膠膏劑的評分標準Table 2 Scoring standard of PAMs gel paste

3 討論

相比測定表觀黏附力，流變學方法的精確度和可信度更高，實驗參數更容易調節和控制，重復性良好[18-20]。參考凝膠膏劑基本成分組成，本研究首先開展了PAMs凝膠膏劑的配方研究，綜合LVR、G*、G′、G″及δ流變學指標，發現3種不同溫度、時間條件下，50 ℃恒溫固化24 h后室溫25 ℃靜置2 d形成的凝膠 LVR范圍、G*值、G″值均最大，即其體系結構最穩定，交聯程度最大，說明溫度升高、時間延長可能導致交聯速度增大，凝膠強度更大。酒石酸既起到調節pH以及Viscomate NP-700分子中羧基的電離作用，還可競爭性地與Al3+發生絡合作用，也發揮交聯調節劑作用[15-16]。配方#6、#8均不含酒石酸，甘羥鋁與Viscomate NP-700交聯程度低，其LVR值范圍小，體系結構容易被破壞，不穩定，G″值大，黏性大；配方#8相比#6，G*值更大，強度更高，說明EDTA濃度的升高凝膠強度減小。在凝膠形成過程中，調節劑EDTA的濃度越大，與Al3+螯合的程度就越大，甘羥鋁與Viscomate NP-700交聯程度就會降低，凝膠強度也會隨之降低。配方#7無EDTA，甘羥鋁與Viscomate NP-700交聯程度大，G*、G′ 值大。配方#5相比#4，G*、G′值均更大，說明酒石酸對凝膠強度的影響大于EDTA對凝膠強度的影響。

表3 正交試驗評分結果分析Table 3 Analysis of orthogonal score results

通過不同配方凝膠膏劑的表觀性狀評價以及對大鼠燙傷修復程度的對比觀察，可以發現凝膠基質的黏彈性、硬度以及釋藥性能與凝膠骨架NP-700、交聯劑甘羥鋁及交聯調節劑EDTA及pH調節劑酒石酸的濃度大小存在直接聯系，且凝膠強度與釋藥性能間存在一定的正相關。酒石酸和促透劑對藥效的影響較大，其中酒石酸濃度越高可能效果更好，促透劑以氮酮和丙二醇為優。初步確定該PAMs凝膠膏劑的優化基質配方為Viscomate NP-700 4.0%、酒石酸0.2%、氮酮3.0%、丙二醇3.0%、不含EDTA 。

本研究通過體外、體內共同評價的方法為PAMs凝膠膏劑基質處方的篩選和優化提供了一種思路，同時對于建立凝膠膏劑可行的測量指標和評價體系具有十分重要的參考價值。需要說明的是，盡管本研究采用了表觀成型性、流變學特性及對大鼠燙傷修復相結合的方法進行了PAMs凝膠膏劑初步和多維度的篩選和評價，但作為一個新產品的研發，還有大量的研究工作需要開展和完善，包括加大實驗的重復數以獲得更可靠的數據，及對PAMs凝膠膏劑按《中國藥典》進行耐熱性、賦形性、黏附性檢驗以驗證本文評價體系的合理性，等等。關于以上方面的進一步研究，以及PAMs凝膠膏劑的實驗動物模型修復功效的藥物釋放、分子作用機制將在今后深入開展和進行。