丁苯酞對博來霉素誘導肺纖維化小鼠的治療作用

張林，白俐，鄧海娟，黃桑，鄧群，曾昭智

(1.廣州新海醫院重癥醫學科，廣東 廣州 510300； 2.廣東藥科大學實驗動物中心，廣東 廣州 510006)

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) 是一種病因不明、發病機制不清的致死性彌漫性肺間質疾病，以各類炎癥細胞在肺間質浸潤、纖維母細胞增生及纖維結締組織沉積于肺間質為特征。IPF患者中位存活時間2～5年，5年存活率僅為20%[1]，嚴重危害人類健康。目前臨床針對IPF的治療尚無特效療法，主要依靠免疫抑制劑治療，但不良反應較大，部分患者治療依從性較差，不能從根本上治療該疾病，因此迫切需要尋找治療肺纖維化有效、安全、副作用小的藥物。研究表明，氧化應激反應在IPF發生發展中發揮了重要作用，氧自由基通過參與肺組織細胞內的氧化還原反應，誘導促炎因子產生， 影響細胞免疫活化狀態和基質金屬蛋白酶表達，從而損傷肺泡上皮細胞、導致胞外基質沉積、引起肺間質纖維化，因此，肺纖維化發病機制可能與細胞因子網絡調節紊亂、抗氧化系統失衡、肺泡上皮細胞凋亡過度等因素有關[2-5]。丁苯酞(NBP)是從芹菜籽內所提取，通過人工合成而得的消旋類化合物，其結構與天然芹菜籽內的左旋芹菜甲素一致。研究發現，丁苯酞具有抗血小板聚集、促進血管生成、改善循環、減少氧自由基生成、抗凋亡等作用[6-9]，故推測丁苯酞對肺纖維化具有一定的治療作用。為此本研究嘗試用丁苯酞對博來霉素誘導肺纖維化小鼠進行干預，探討其對肺纖維化小鼠模型的治療作用，為肺纖維化的藥物治療提供新的思路和實驗依據。

1 材料

1.1 藥物與試劑

丁苯酞軟膠囊(恩必普有限公司，批號：118180427)；IL-1β、TNF-α、MDA、SOD ELISA檢測試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司，批號：201905)；硫酸博來霉素(麥克林，批號：B802467)；中性甲醛溶液(廣州化學試劑廠，批號：20150722)；PBS磷酸鹽緩沖劑[賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司，批號：8118378]；玉米油(麥克林，批號：201424)；生理鹽水(廣東科倫藥業，批號：H18091601)。

1.2 主要儀器

FA2004B電子天平(上海精科天美)；HZT-A1000電子天平(廈門華志)；TC-120C++智能程控生物組織自動脫水機(湖北泰維)；TB-718L生物組織自動包埋機(湖北泰維)；生物組織全自動染色機，TR-180Ⅰ(湖北泰維)；RM2235切片機(德國徠卡)；AE2000倒置顯微鏡(廈門麥克奧迪)；HCP246恒溫培養箱(德國Memmert)；3K15冷凍離心機(德國SIGMA)；Infinite 200 pro酶標儀(瑞士tecan)；Forma 902超低溫冰箱(美國Thermo)；LUK1801005自動樣品快速研磨儀(廣州露卡)；移液槍(Genex Beta)；JY92-IIN超聲儀(寧波新芝)；DHG鼓風干燥箱(上海一恒)。

1.3 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠，雄性，8周齡，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，生產許可證號：SCXK(魯)2014-0007。實驗期動物飼養在廣東藥科大學實驗動物中心屏障環境，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2017-0125。

2 方法

2.1 肺纖維化小鼠模型的建立[10]

C57BL/6小鼠腹腔注射硫酸博來霉素35 mg/kg(硫酸博來霉素用生理鹽水溶解)，1周2次，連續注射8次，建立肺纖維化小鼠模型。

2.2 分組及給藥

取同批24只正常小鼠作為正常對照組；選取建模成功的小鼠48只，隨機分成模型組和丁苯酞治療組各2組，每組動物12只， 正常對照組和模型組灌胃實驗專用玉米油10 mL/kg，丁苯酞治療組灌胃丁苯酞180 mg/kg(根據臨床用藥折算)，每天1次，分別連續14 d和28 d，丁苯酞用實驗專用玉米油稀釋混懸。分別于末次給藥24 h后處死對應各組小鼠12只進行相應指標的測定。

2.3 觀察指標

2.3.1 小鼠體質量測定 給藥前和末次給藥24 h后進行小鼠體質量測定。

2.3.2 肺指數測定 分別于末次給藥24 h后取各組小鼠全肺稱質量，并按如下公式計算肺指數:肺指數=肺質量(mg)/體質量(g)。

2.3.3 肺濕/干質量測定 取左肺稱質量，置烘箱60 ℃烘72 h，再次稱質量，進行濕/干質量比計算，以此判別大鼠肺部的水腫程度。

2.3.4 肺組織形態學評價 給藥14 d和28 d各組小鼠的右肺上葉經10%(φ)甲醛溶液固定，按常規方法制作石蠟病理切片，染色鏡檢。每只小鼠病理切片隨機選擇1個觀察視野，根據Hubner等[11]的方法對肺纖維化程度進行評分。0分：無纖維化，肺泡結構正常；1分：散在輕度纖維化灶，肺泡間隔厚度≤3倍正常值，部分肺泡腔擴大，肺泡壁變薄，但無成團肺纖維化；2分：明顯的肺纖維化改變，肺泡間隔厚度>3倍正常值，并伴有繩結樣改變，但病變未融合，部分肺泡腔擴大，肺泡壁變薄，但無成團肺纖維化；3分：連續肺纖維化，肺泡間隔厚度>3倍正常值，部分肺泡腔擴大，肺泡壁變??；4分：單個成團肺纖維化灶，病灶范圍<10%視野；5分：融合成團肺纖維化灶，病灶范圍10%～50%視野，肺形態結構嚴重受損但還能依稀可見；6分：大片融合成團肺纖維化灶，病灶范圍>50%視野，大部分肺泡間隔消失，大部分肺結構毀損；7分：肺泡內幾乎充滿成片的纖維組織，肺泡間隔消失，但仍可見至少5個氣泡樣改變；8分：滿視野成團的纖維組織。

2.3.5 血清IL-1β、TNF-α含量測定 分別于給藥14 d和28 d后小鼠眼眶靜脈采血，2 000 r/min離心10 min取血清，ELISA 法測定IL-1β、TNF-α水平，含量測定步驟按照ELISA試劑盒說明書操作。

2.3.6 肺組織中MDA、SOD含量測定 分別于給藥14 d和28 d后處死小鼠取右肺下葉，按照一定的比例加入PBS制成10%的組織勻漿液，3 000 r/min離心15 min取上清液測定肺組織中MDA、SOD的含量，含量測定步驟按照ELISA 試劑盒說明書操作。

2.4 統計學處理

3 結果

3.1 丁苯酞對肺纖維化小鼠體質量的影響

與模型組比較，正常對照組、丁苯酞治療組小鼠在給藥14 d和28 d后其體質量差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

3.2 丁苯酞對肺纖維化小鼠肺指數的影響

與模型組比較，正常對照組在給藥14 d和28 d后其肺指數差異有統計學意義(P<0.01)，而丁苯酞治療組差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)，提示丁苯酞對肺纖維化小鼠肺指數無明顯影響。

3.3 丁苯酞對肺纖維化小鼠濕/干質量比的影響

與模型組比較，正常對照組給藥14 d后的左肺濕質量、左肺干質量和給藥28 d后的左肺干質量、肺濕/干質量比差異有統計學意義(P<0.01)，而丁苯酞治療組差異無統計學意義(P>0.05)(見表3)，提示丁苯酞對肺纖維化小鼠濕/干質量比無明顯影響。

表1 丁苯酞對肺纖維化小鼠體質量的影響Table 1 Effect of butylphthalide on the weight in mice with pulmonary fibrosis

表2 丁苯酞對肺纖維化小鼠肺指數的影響Table 2 Effect of butylphthalide on the lung index in mice with pulmonary fibrosis

與模型組比較:**P<0.01。

表3 丁苯酞對肺纖維化小鼠濕/干質量比的影響Table 3 Effect of butylphthalide on the wet/dry ratio in mice with pulmonary fibrosis

與模型組比較:**P<0.01，*P<0.05。

3.4 丁苯酞對肺纖維化小鼠肺組織形態學的影響

肉眼可見，模型組小鼠雙肺體積明顯增大、充血水腫、肺外周可見片狀出血。經丁苯酞治療后，肺表面血紅色區減少，水腫和充血大部分消失，接近正常組。光鏡下正常組肺泡腔完好，肺泡腔內無分泌物，幾乎無肺水腫，肺泡壁結構完整，支氣管上皮無變形和管周炎，無纖維化。模型組肺泡腔消失，肺泡腔內有漿液性滲出物及大量炎癥細胞、紅細胞滲出，肺泡間隔厚度增加和肺纖維化明顯。丁苯酞治療后，支氣管變形等現象明顯減輕或者消失，肺泡炎癥細胞和肺間質炎癥細胞明顯減少，纖維化明顯減輕，見圖1。與模型組相比，丁苯酞治療組給藥14 d和28 d后其肺纖維化程度均有不同程度降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表4。

A.正常對照組(給藥14 d); B.模型組(給藥14 d); C.丁苯酞治療組(給藥14 d); D.正常對照組(給藥28 d); E.模型組(給藥28 d); F.丁苯酞治療組(給藥28 d)

圖1丁苯酞對肺纖維化小鼠肺組織病理學影響

Figure1Effect of butylphthalide on the lung histopathology in mice with pulmonary fibrosis (HE,100×)

3.5 丁苯酞對肺纖維化小鼠血清IL-1β和TNF-α水平的影響

與模型組相比，正常對照組和丁苯酞治療組給藥14 d和28 d后小鼠血清的IL-1β和TNF-α水平均明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；丁苯酞治療給藥28 d小鼠血清的IL-1β水平明顯低于14 d的水平，差異有統計學意義(P<0.01)，見表5。

表4 丁苯酞對肺纖維化小鼠肺纖維化程度評分的影響

組別劑量/(mg·kg-1)肺纖維化/分給藥14 d給藥28 d正常對照組-0.58±0.67??0.67±0.65??模型組-3.17±1.112.92±1.00丁苯酞治療組1801.75±0.62??1.67±0.65??

與模型組比較:**P<0.01。

3.6 丁苯酞對肺纖維化小鼠肺組織中MDA和SOD含量的影響

與模型組相比，正常對照組和丁苯酞治療組給藥14 d和28 d后小鼠肺組織中MDA含量顯著降低，SOD含量顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；丁苯酞治療給藥28 d小鼠肺組織中SOD含量明顯高于14 d的水平，差異有統計學意義(P<0.01)，見表6。

4 討論

理想的肺纖維化動物模型必須能復制典型普通型間質性肺炎的組織學特征，肺纖維化持續或不可逆進展。博來霉素獲取途徑便利、可重復性強，成為目前最常用的誘導肺纖維化的藥物[10]；C57BL/6小鼠對博來霉素最敏感，是目前最常用的肺纖維化實驗動物，通過腹腔注射博來霉素建立穩定的C57BL/6小鼠肺纖維化模型，該方法操作簡單，可重復性好，成模時間短，病理及相關細胞因子的改變與人類IPF類似[10，12-14]。本實驗中小鼠連續注射博來霉素8次后出現肺充血水腫、炎癥細胞，肺泡間隔厚度增加，纖維化明顯等癥狀，表明博來霉素誘導的肺纖維化小鼠造模成功。經丁苯酞治療后，肺水腫現象明顯減輕，炎癥細胞明顯減少，纖維化癥狀減輕，肺纖維化程度評分分值明顯降低，表明丁苯酞能減輕肺纖維化小鼠肺部病變，降低纖維化程度，對其有一定治療作用。

表5 丁苯酞對肺纖維化小鼠血清IL-1β和TNF-α水平的影響Table 5 Effect of butylphthalide on the levels of blood IL-1β and TNF-α in mice with pulmonary fibrosis

與模型組比較:**P<0.01；與給藥14 d對應指標比較：##P<0.01。

表6 丁苯酞對肺纖維化小鼠肺組織中MDA和SOD含量的影響Table 6 Effect of butylphthalide on the levels of MDA and SOD in mice with pulmonary fibrosis

與模型組比較:**P<0.01；與給藥14 d對應指標比較：##P<0.01。

炎癥反應在肺纖維化發生發展過程中具有重要意義，IL-1β、TNF-α因子介導造成肺毛細血管內皮細胞及肺泡上皮細胞的損傷[15]。本實驗發現肺纖維化小鼠模型中IL-1β和TNF-α大量表達，表明小鼠肺纖維化與炎性因子釋放表達有關，經過丁苯酞治療后IL-1β和TNF-α水平明顯下降，這與其他文獻研究結果相符[15-16]，提示丁苯酞可能通過降低血清中的IL-1β和TNF-α炎癥因子產生，減輕肺纖維化小鼠的炎性反應，阻礙或者延緩肺水腫和纖維化的形成，從而達到對肺纖維化小鼠模型的治療作用，但其具體通過何種調節機制和信號通路來達到干預保護作用，有待于后期進一步實驗研究。給藥28 d小鼠血清的IL-1β水平明顯低于14 d的水平，表明丁苯酞治療28 d比治療14 d更能達到控制炎癥因子的水平。

博來霉素通過與金屬離子螯合作用后使氧分子生成氧自由基，最終導致過氧化物的大量生成，過氧化物在肺纖維化形成中起到了重要的作用，機體在正常情況下，氧化和抗氧化作用處于動態平衡中。當機體遭受氧化應激時，脂質過氧化物MDA的含量將明顯增加，而抗氧化物如SOD水平明顯降低[13，17]。本研究表明，丁苯酞應用后小鼠肺組織中MDA的含量明顯降低，SOD水平明顯提高，說明丁苯酞可能有助于對氧自由基的清除，因此推測丁苯酞對肺纖維化的保護作用與其增加肺臟中的抗氧化能力有關，但其具體調節機制有待于后期進一步研究。丁苯酞治療給藥28 d小鼠肺組織中SOD含量明顯高于14 d的水平，說明給藥28 d小鼠肺臟中的抗氧化能力強于給藥14 d的抗氧化能力，表明丁苯酞治療28 d的抗氧化效果好。

綜上所述，丁苯酞可通過降低血清中炎癥因子的產生和增強肺組織的抗氧化能力，阻礙或者延緩肺水腫和纖維化的形成，從而達到對肺纖維化小鼠模型的治療作用，且治療給藥28 d的效果好。