杜仲黃酮對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的保護作用及機制

曾文蘭，吳朝文

(深圳市龍華區中心醫院，廣東 深圳 518110)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一類以中性粒細胞浸潤，內皮細胞和肺泡上皮細胞完整性被破壞以及肺泡毛細血管彌漫性損傷為特征，最終導致呼吸衰竭，甚至死亡的呼吸道感染類疾病，其中肺水腫和急性呼吸性窘迫是其主要的臨床表現[1]。ALI以其顯著的高發病率和死亡率的特點對公共健康產生重大影響，研究統計ALI致死率已高達30%～50%[2]。機械通氣、激素和抗炎藥物是目前臨床上常用的治療方法，但均存在明顯缺點，如應用機械通氣，由于受各種條件限制，難以廣泛推廣，而激素和抗炎等藥物副作用明顯，預后差等[3]，故尋找安全有效的防治ALI藥物顯得尤為緊迫。

杜仲(Eucommia ulmoides)是杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，具有強筋壯骨、調理沖任、固經安胎和補益肝腎的功效。近年來研究表明其主要有效成分杜仲黃酮具有抗氧化、抗炎和抗衰老等藥理作用[4]。目前杜仲黃酮對脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導ALI的研究尚未見報道，本實驗擬基于TGF-β/smad信號通路探討杜仲黃酮對LPS誘導小鼠ALI的影響及其作用機制，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

DMEM培養基、LPS(美國Sigma)；胎牛血清(Sciencell生物技術公司)；地塞米松(DEX)片(規格0.75 mg/片，廣東南國藥業有限公司)；杜仲(亳州市安博藥業有限公司)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)ELISA檢測試劑盒(博士德生物技術有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒(南京建成股份有限公司)；TGF-β和Smad2單抗(上海鈺博生物科技有限公司)。

1.2 主要儀器

RE-2000B旋轉蒸發儀(鄭州市亞榮儀器有限公司)；752N紫外可見分光光度計(南京曉曉儀器設備有限公司)；XDS-1倒置顯微鏡(南京山特儀器有限公司)；BC-6900全自動血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)； H1650R臺式高速冷凍離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；BS-1101多功能酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)；YB-6LF生物組織石蠟包埋機(亞光科技股份有限公司)；KD-3390智能感知石蠟切片機(上海珂淮儀器有限公司)；K8420全自動凝膠成像系統(南京世研儀器設備有限公司)。

1.3 細胞與動物

Raw264.7細胞由上海中科院細胞庫提供。BALB/c小鼠，60只，SPF級，雌雄各半，體質量18～22 g，購買于廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK(粵)2015-0014。

1.4 方法

1.4.1 杜仲黃酮的提取及含量檢測 參照文獻[5]的方法提取杜仲黃酮，主要工藝條件如下：精確稱取杜仲1 kg，使用質量分數為70%乙醇，料液比(g∶mL)為1∶10，80 ℃條件下分別提取3次，每次回流2.0 h，并使用旋轉蒸發儀蒸去乙醇，濃縮至原體積1/30。使用紫外分光光度法，檢測波長為500 nm，檢測得杜仲黃酮質量分數為0.27%。

1.4.2 Raw264.7細胞培養 用0.25%的胰蛋白酶2.5 mL,37 ℃恒溫水浴箱中振蕩消化15 min,加入DMEM培養基終止消化。反復吹打并調整細胞密度為1×105/mL，吸出細胞懸液放入培養瓶,置于37 ℃、 5%(φ)CO2培養箱中培養。傳代后的細胞接種于96孔培養板中，待細胞重新長滿匯合后，用于細胞存活率和培養液中TNF-α和IL-1β的含量測定。

1.4.3 分組與給藥 適應性喂養小鼠1周后，按動物體質量隨機分為6組，包括假手術組、模型組、DEX組，杜仲黃酮低劑量(DZ-L)組、中劑量(DZ-M)組、高劑量(DZ-H)組，每組10只。于造模前連續灌胃給藥7 d，DEX組灌胃給藥2 mg/(kg·d)，DZ-L、DZ-M和DZ-H組分別灌胃給藥50、100、200 mg/(kg·d)，假手術組和模型組以等量生理鹽水灌胃。

1.4.4 小鼠ALI模型的建立 各組小鼠連續灌胃給藥7 d后，末次給藥1 h后開始造模，2%異戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，仰臥固定于37 ℃恒溫手術臺。參照文獻[6]方法造模，造模主要步驟如下：小心剃去頸部正中毛發，酒精消毒，正中切開頸部皮膚約2 cm，暴露及分離氣管，利用胰島素注射器于氣管內慢慢滴注LPS 5 mg/kg(0.5 mL/kg)，假手術組氣管內滴注等量生理鹽水，碘伏消毒傷口并縫合皮膚，建立小鼠急性肺損傷模型。造模24 h后，摘眼球取血，4 ℃冰箱靜置3 h后，3 500 r/min離心15 min，分離血清，-20 ℃保存，待測。各組小鼠小心剪開頸部皮膚并分離氣管，行氣管插管。剖開胸部，結扎右支氣管，用磷酸緩沖液灌洗左肺，共3次，2 mL/次，收集BALF并離心(4 ℃，1 300 r/min，5 min)。

1.5 指標檢測

1.5.1 RAW264.7細胞存活率測定 將對數生長期的Raw264.7細胞，用含10%(φ)胎牛血清的DMEM培養基稀釋為1×105/mL，100 μL接種于96孔板，空白對照組和模型組(LPS 80 ng/mL)更換成新鮮含10%胎牛血清的DMEM培養基，杜仲黃酮給藥組加入不同濃度的杜仲黃酮含10%胎牛血清的DMEM培養基(終濃度分別為2、4、8、16、32、64 μmol/L)，調零組為無細胞組，其他步驟同空白對照組，每組設立6個平行孔，24 h后，CCK-8法檢測細胞存活率。按照下列公式計算存活率：存活率=(處理組吸光度值-調零組吸光度值)/(空白對照組吸光度值-調零組吸光度值)×100%。

1.5.2 RAW264.7細胞上清培養液TNF-α和IL-1β含量測定 將處于對數生長期的Raw264.7細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基稀釋為1×105個細胞后接種于12孔板中，貼壁培養24 h后分為空白對照組、模型組(LPS 80 ng/mL)、DZ-L組(4 μmol/L)、DZ-M組(8 μmol/L)和DZ-H組(16 μmol/L)。細胞繼續培養24 h，收集細胞上清液，離心5 min(3 500 r/min)。按照TNF-α和IL-1β檢測試劑盒說明書步驟分別檢測TNF-α和IL-1β的含量。

1.5.3 BALF蛋白含量測定 BCA蛋白定量試劑盒檢測BALF中蛋白含量，實驗操作均按照試劑盒說明書進行。

1.5.4 BALF中白細胞計數 用800 μL 0.01 mol/L(pH 7.4)的PBS緩沖液重懸BALF沉淀物，吹打均勻后，取400 μL于血液分析儀中檢測白細胞數目。

1.5.5 肺濕干質量比(W/D) 稱取左肺上葉為濕質量，將左肺上葉放入恒溫干燥箱(105 ℃)烤72 h，干燥至恒質量，并稱取記錄為干質量，按下列公式計算：肺濕干質量比=濕質量/干質量。

1.5.6 肺組織病理形態學觀察 取右肺下葉，10%(φ)中性甲醛浸泡固定24 h，流水沖洗12 h，常規石蠟包埋，切片，蘇木精伊紅染色，封片，顯微鏡下進行病理觀察。

1.5.7 生化指標檢測 血清中SOD活性和MDA的含量測定按照相應檢測試劑盒說明書進行。

1.5.8 肺組織TGF-β1和Smad2的表達水平 BCA試劑盒檢測肺組織勻漿總蛋白濃度，加入等量樣品于電泳槽進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。經過轉膜、封閉、孵育TGF-β1(1∶3 000)、Smad2(1∶2 000)一抗過夜; 洗膜、孵育二抗(1∶7 000)、洗膜、顯影，使用Image J軟件半定量分析各條帶灰度值。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 杜仲黃酮對RAW264.7細胞存活率的影響

從圖1結果可知，2、4、8、16、32、64 μmol/L杜仲黃酮分別處理RAW264.7細胞24 h后，杜仲黃酮給藥終濃度為32 μmol/L時，細胞存活率為84.23%；而給藥終濃度為64 μmol/L時，細胞存活率為74.53%。

105100959085807570650248163264c(杜仲黃酮)/(μmo?L-1)存活率/%

圖1杜仲黃酮對RAW264.7細胞存活率的影響

2.2 杜仲黃酮對RAW264.7細胞TNF-α和IL-1β的影響

從圖2結果可見：與空白對照組比較，模型組TNF-α和TNF-1β含量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，DEX組和杜仲黃酮給藥組TNF-α和TNF-1β含量均明顯降低(P<0.05)。與DEX組比較，DZ-L組TNF-α和TNF-1β含量明顯升高(P<0.05)。與DZ-L組比較，DZ-H組TNF-α和TNF-1β含量明顯降低(P<0.05)。

aabbdbcbbbbd9008007006005004003002001000TNF-α/(ng?mL-1)IL-β/(ng?mL-1)706050403020100aabbddbccbbddbABCDEF

A.空白對照組； B.模型組； C. DEX組； D. DZ-L組； E. DZ-M組； F. DZ-H組。

與空白對照組比較：aaP<0.01；與模型組比較：bP<0.05，bbP<0.01；與DEX組比較：cP<0.05，ccP<0.01；與DZ-L組比較：dP<0.05，ddP<0.01。

圖2杜仲黃酮對RAW264.7細胞TNF-α和IL-1β含量的影響

2.3 杜仲黃酮對BALF蛋白含量和白細胞的影響

從圖3結果可見：與假手術組比較，模型組小鼠蛋白含量和白細胞數量均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，DEX組和杜仲黃酮給藥組小鼠蛋白含量和白細胞數量均明顯降低(P<0.05)。與DEX組比較，DZ-L組小鼠蛋白含量和白細胞數量明顯升高(P<0.05)。與DZ-L組比較，DZ-H組小鼠蛋白含量和白細胞數量明顯降低(P<0.05)。

2.4 杜仲黃酮對肺組織濕干質量比的影響

從圖4結果可見：與假手術組比較，模型組小鼠肺組織濕干質量比明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，DEX組和杜仲黃酮給藥組小鼠肺組織濕干質量比均明顯降低(P<0.05)。與DEX組比較，DZ-L組小鼠肺組織濕干質量比明顯升高(P<0.05)。與DZ-L組比較，DZ-H組小鼠肺組織濕干質量比明顯降低(P<0.05)。

2.5 杜仲黃酮對肺組織病理形態學的影響

從圖5結果可見：假手術組小鼠肺組織結構清晰，肺泡腔無滲出液，肺泡間隔無水腫，無炎癥細胞浸潤。模型組小鼠肺組織有大小不一的散在出血斑塊，彌漫性肺水腫，肺泡壁和肺泡間隔明顯增寬，大量炎癥細胞浸潤。與模型組比較，DEX組小鼠肺泡結構比較完整，肺間隔未見明顯增厚，肺泡滲出液少，炎癥細胞浸潤也較少；DZ-H組小鼠肺泡滲出液和炎癥細胞浸潤較少，肺間隔增厚較輕，出血現象較輕；DZ-L組和DZ-M組小鼠肺組織的病理變化改善不及DZ-H組。

蛋白含量/(g?L-1)1.41.21.00.80.60.40.20.0aabbddbccbbdbbaabbddbcbbdbb876543210白細胞數量/?108個?L-1蛋白含量白細胞數量ABCDEF

A.假手術組； B.模型組； C. DEX組； D. DZ-L組； E. DZ-M組； F. DZ-H組(下同)。

與假手術組比較：aaP<0.01；與模型組比較：bP<0.05，bbP<0.01；與DEX組比較：cP<0.05，ccP<0.01；與DZ-L組比較：dP<0.05，ddP<0.01。

圖3杜仲黃酮對各組小鼠BALF蛋白含量和白細胞數量的影響

bbdaabbbcbbd121086420W/DABCDEF

與假手術組比較：aaP<0.01；與模型組比較：bP<0.05，bbP<0.01；與DEX組比較：cP<0.05；與DZ-L組比較：dP<0.05。

圖4杜仲黃酮對各組小鼠肺組織濕干質量比的影響

2.6 杜仲黃酮對小鼠血清SOD、MDA的影響

從圖6結果可見：與假手術組比較，各組小鼠血清SOD活性和MDA含量明顯升高(P<0.05)；DEX組小鼠血清SOD活性明顯比模型組升高(P<0.05)，而MDA含量明顯降低(P<0.05)。與DEX組比較，DZ-L組小鼠血清SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.01)。與DZ-L組比較，DZ-H小鼠血清SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)。

圖5各組小鼠肺組織病理形態學觀察(HE染色，20×)

Figure5Effect of flavonoids from Eucommia umoides on the pathological changes of lung tissues in each group (HE staining,20×)

abcbbbbdbbaabbddbccbbdbb160140120100806040200454035302520151050MDA含量/(μmo?L-1)SOD/(U?mL-1)ABCDEE

與假手術組比較：aP<0.05,aaP<0.01；與模型組比較：bP<0.05，bbP<0.01；與DEX組比較：cP<0.05，ccP<0.01；與DZ-L組比較：dP<0.05。

圖6杜仲黃酮對各組小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響

2.7 杜仲黃酮對各組小鼠肺組織TGF-β1和Smad2表達的影響

從圖7結果可見：與假手術組比較，各組小鼠肺組織TGF-β1和Smad2表達量明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，DEX組小鼠肺組織TGF-β1和Smad2表達量明顯降低(P<0.05)，而DZ-H組小鼠TGF-β1和Smad2表達量明顯比DEX組降低(P<0.05)。與DZ-L組比較，DZ-H組小鼠TGF-β1和Smad2表達量明顯降低(P<0.05)。

ABCDEFTGF-β1β-ActinSmad2aabbbbcdbaabbbbbcdbb1.21.00.80.60.40.20.01.00.80.60.40.20.0TGD-β1/β-actinSmad2/β-actinABCDEF

與假手術組比較：aP<0.05,aaP<0.01；與模型組比較：bP<0.05，bbP<0.01；與DEX組比較：cP<0.05；與DZ-L組比較：dP<0.05。

圖7杜仲黃酮對各組小鼠肺組織TGF-β1和Smad2表達的影響

3 討論

急性肺損傷是由各種因素所致的肺彌漫性炎癥損傷，以呼吸窘迫及進行性低氧血癥為特征，是臨床常見危重癥。多種病因均可誘發ALI，其中革蘭陰性菌感染所致的肺炎是ALI最常見的發病因素，內毒素是革蘭陰性菌感染時解體后所釋放的一種毒性物質，可激活機體的免疫體統，誘使TNF-α、IL-1β等炎癥細胞因子的釋放，引起機體急性炎癥，是目前研究ALI較理想的誘導劑[7]。雖然ALI致病機制目前尚未完全明確，但較多研究認為肺組織的炎癥反應失衡是導致各種ALI的根本原因[8]，而氧化損傷也是導致ALI的重要原因之一[9]。地塞米松是臨床上常見的一種糖皮質激素類藥物，長期過量用藥可引起較多的副作用，因此其臨床應用受到一定限制。有研究表明地塞米松可較好地減輕ALI所致的肺組織損傷[10]，故本研究以地塞米松作為陽性對照藥，對比杜仲黃酮對ALI的影響。

近年研究發現杜仲黃酮具有抗氧化、消炎、抗衰老等多種藥理作用[4]。TNF-α和IL-1β等細胞炎癥因子，參與多種組織炎癥損傷，兩者含量高低可反映肺組織炎癥的嚴重程度[11]。細胞實驗研究發現，與空白對照組比較，模型組TNF-α和IL-1β含量顯著升高(P<0.05)，而給予杜仲黃酮后可明顯降低細胞TNF-α和IL-1β含量(P<0.05)，表明杜仲黃酮可明顯減輕ALI所致的炎癥反應。

BALF蛋白含量和肺濕干質量比可反映肺組織血管通透性的異常以及肺水腫的嚴重程度[12]，而白細胞數量可間接反映肺組織中中性粒細胞的浸潤情況以及炎癥的嚴重程度[13]。本研究發現，與假手術組比較，模型組小鼠蛋白含量、肺濕干質量和白細胞數量均明顯升高(P<0.05)，表明模型組肺組織水腫和炎癥比較嚴重，提示造模成功。與模型組比較，杜仲黃酮給藥組小鼠蛋白含量、肺濕干質量比和白細胞數量均明顯降低(P<0.05)，提示杜仲黃酮給藥組可改善肺組織水腫程度和炎癥程度，并呈劑量依賴性。此外，肺組織病理學觀察發現模型組小鼠肺組織損傷嚴重，可見彌漫性肺水腫，肺泡壁和肺泡間隔明顯增寬，大量炎癥細胞浸潤。而給予杜仲黃酮后上述病理變化明顯減輕。

SOD和MDA是臨床常規使用的檢測機體抗氧化活性的兩個重要指標[14]。本研究發現，與假手術組比較，模型組小鼠血清SOD活性明顯升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.01)，給予杜仲黃酮后可明顯升高血清SOD活性(P<0.05)，降低MDA含量(P<0.05)，且呈劑量依賴性，表明杜仲黃酮可明顯減輕氧化應激損傷，從而保護肺組織。

TGF-β1是一種多功能的細胞因子，其在細胞的生長和分化、胚胎發育、免疫調節、損傷后修復等方面均起著十分重要的作用，TGF-β1是ALI后纖維化密切相關的細胞因子之一，其致纖維化作用最強[15]。Smads作為TGF-β1的重要信號轉導分子，研究表明[16]TGF-β1多種生物功能的發揮需要Smads蛋白的信號轉導及精準調控。本研究發現，與模型組比較，杜仲黃酮給藥組小鼠肺組織TGF-β1和smads表達量明顯降低，表明杜仲黃酮通過調節TGF-β/Smad信號通路，從而對ALI起保護作用。

綜上所述，杜仲黃酮對LPS所致的急性肺損傷具有較好的保護作用，其作用機制可能是通過調節TGF-β/Smad信號通路有關。