紫紅笛鯛血細胞發生研究

鐘愛華，牟 毅，高 航，王文鴻

( 浙江海洋大學 水產學院，浙江 舟山 316022 )

魚類血細胞具有運輸、損傷修復、免疫應答等功能，各種血細胞都有一定的壽命，造血器官不斷產生新的血細胞以維持外周血細胞數量的相對穩定。白細胞是魚類免疫系統的重要組成部分，在抵抗病原入侵和疾病免疫方面肩負重要作用，白細胞參數的改變會影響魚類的免疫功能。硬骨魚類有多個造血器官，研究發現，頭腎、體腎和脾臟是達布里鱘(Acipenserdabryanus)[2]、長鰭裸頰鯛(Lethrinuserythropterus)[3]等魚類的主要造血器官；軍曹魚(Rachycentroncanadum)中，肝臟也是造血器官[4]。

紫紅笛鯛(Lutjanusargentimaculatus)，屬硬骨魚綱、輻鰭亞綱、鱸形目、笛鯛科、笛鯛屬，分布于印度洋、南太平洋以及中國南海、臺灣海峽等海域，屬于熱帶和亞熱帶近海近底層魚類。紫紅笛鯛個體較大，體長大者可達600 mm以上，生長較快，肉質鮮美，富含人體所必需的氨基酸和高度不飽和脂肪酸，已成為海水養殖的主要經濟魚類之一。

目前有關紫紅笛鯛的研究集中在養殖技術、人工繁殖技術、病害防治以及遺傳等方面[5-10]，而對紫紅笛鯛血細胞發生以及造血器官的研究很少。筆者通過研究紫紅笛鯛血細胞發生以及外周血細胞化學染色，以期為其生理學和免疫學研究積累基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗魚來自浙江省舟山市，選體色正常、體表無傷、反應敏捷的紫紅笛鯛5尾，運回實驗室，暫養1 d后進行試驗，魚體質量510～620 g。

1.2 方法

間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽麻醉魚體后解剖，取出頭腎、體腎、肝臟、脾臟，吸水紙吸凈每個器官表面血污后，用干凈的刀片將每個器官居中作橫切、縱切，每個切面在病理級載玻片(世康)上輕輕印5個以上跡面，印片空氣中干燥。用含檸檬酸三鈉抗凝劑(3.0%)的注射器按1∶4心臟取血，立即涂片，空氣中干燥。干燥后的印片和涂片用Wright-Giemsa染液(南京建成)染色10 min，流水緩慢沖洗30 s，晾干，封片，油鏡(Olympus顯微鏡)下觀察拍照。對每個器官每張印片隨機選取10個視野，分類統計各種不同發育階段血細胞。每種細胞隨機取樣20個，測量胞體和胞核長短徑，SPSS 17軟件統計分析。

各階段細胞形態標準參照《野生動物血液細胞學圖譜》[11]。

2 結 果

2.1 血細胞發生

2.1.1 紅細胞系

原紅細胞胞體大，圓形或橢圓形，有時有多個偽足。胞質強嗜堿性，染成墨水藍色或深藍色，胞漿量少，僅核周圍薄薄的一層；核圓形或橢圓形，占細胞絕大部分，核質比大，染色質呈細網狀分布，染成紫紅色，核仁明顯，核周圍存在明顯的淺色環帶區(圖1a)。

早幼紅細胞比原紅細胞小，橢圓形，核質比較大。隨著細胞發育分化，胞質嗜堿性減弱，顏色變淺，呈灰藍色，胞質中出現血紅蛋白；細胞核居中或偏位，核內染色質凝集變粗，染成紫紅色；核仁模糊。核周有明顯的淺色帶區(圖1b)。

中幼紅細胞胞體橢圓形。胞質嗜堿性減弱，呈淺灰色或淺灰藍色，胞質中血紅蛋白增多；細胞核居中或稍偏位，染色質凝集呈粗線狀或小塊狀，染成紫紅色，核仁消失(圖1c)。

晚幼紅細胞胞體卵圓形或橢圓形，胞質中血紅蛋白豐富而呈現灰紅色或暗紅色；細胞核圓形或橢圓形，偶見分葉核，居中或稍偏位，染色質凝集呈粗線狀，染成紫紅色。核周圍有明顯的淺色帶(圖1d)。

紅細胞胞體卵圓形或橢圓形，核周淺色帶消失；胞質充滿血紅蛋白，呈灰紅色或暗紅色；胞核橢圓形或桿狀，居中或稍偏位，染色質凝集呈致密粗線狀，染成深紫紅色或紫黑色；核質比為紅細胞系中最小(圖1e)。

衰老的紅細胞呈橢圓形或不規則形，有時細胞膜邊緣不光滑有許多突起，胞體體積縮小，核固縮呈微核狀，染色質呈紫黑色，快溶解時核靠近質膜(圖1f)。

2.1.2 粒細胞系

原粒細胞胞體圓形或卵圓形，胞漿比原紅細胞稍多，嗜堿性比原紅細胞稍弱呈藍色。胞核圓形或橢圓形，居中或偏位，染色質呈細顆粒狀，染成紫紅色，核仁清晰明顯，核質比大(圖1g)。

早幼粒細胞胞體圓形或卵圓形；胞質增多，嗜堿性減弱呈淺藍色，胞質中有少量嗜天青顆粒，染成藍色。胞核圓形、橢圓形或一側稍凹陷，偏位，染色質凝集，呈稍粗線狀，染成紫紅色，核仁模糊，核質比大。從中幼粒細胞開始，胞質中出現特殊顆粒，隨著細胞分化成熟，特殊顆粒數量增多(圖1h)。

中性中幼粒細胞胞體圓形或橢圓形。胞質比早幼粒細胞多，嗜堿性減弱呈淺灰藍色或淺灰色，胞質中有嗜天青顆粒和特殊的嗜中性顆粒，嗜中性顆粒分布稀疏染成淺紅色。核圓形、橢圓形或有凹陷，偏位，核內染色質呈粗線狀，核仁不清。核質比約為1/3～1/2(圖1i)。

中性晚幼粒細胞胞體圓形或橢圓形，比中性中幼粒細胞小。胞核圓形或橢圓形，較小，偏位，核內染色質凝集呈粗線狀或塊狀，核仁消失。 胞質豐富，嗜天青顆粒增多，淺紅色特殊顆粒增多(圖1j)。

中性粒細胞胞體圓形或橢圓形，少量不規則形，是數量最多的一種外周白細胞。胞質無色或極淺的灰色，胞質中含有許多細小的灰藍色和淺紅色顆粒。核多偏位，圓形或橢圓形、少量腎形或棒狀，染色質凝集呈粗線狀或塊狀，核質比小(圖1k)。

嗜酸性中幼粒細胞胞體橢圓形，胞體較大。細胞質灰紅色，內有嗜酸性顆粒, 顆粒大小不一，分布較稀疏，染成暗紅色或桔紅色。胞核較大，約為細胞的一半，橢圓形或不規則形，多偏位，核內染色質呈紫紅色粗線狀或塊狀，核有時被嗜酸性顆粒覆蓋致使核膜不清(圖1l)。

嗜酸性晚幼粒細胞胞體橢圓形或不規則形，體積較嗜酸性中幼粒細胞小。核橢圓形或不規則形,多偏位，核內染色質濃聚呈粗線狀或塊狀，染成紫紅色。胞質暗紅色，嗜酸性顆粒增多，顆粒有時覆蓋核膜致使細胞核邊界不清(圖1m)。

嗜酸性粒細胞胞體橢圓形或者不規則形，胞體較小，偶有偽足伸出。胞核形態多樣，橢圓形、腎形、棒狀、不規則形、分葉，偏位，染色質濃縮致密呈粗線狀或粗塊狀，深紫紅色。胞質充滿嗜酸性顆粒，連成一片，顆粒有時覆蓋核膜，致使細胞核邊界不清(圖1n，圖2)。

嗜堿性中幼粒細胞胞體橢圓形，比早幼粒細胞小。胞質灰藍色或淺藍色，胞質中有粗大的嗜堿性顆粒，顆粒大小不一，分布較稀疏。核居中或偏位，圓形或橢圓形，核仁模糊，染色質呈稍粗線狀，染成紫紅色，核質比大，有時核膜被嗜堿性顆粒覆蓋(圖1o)。

嗜堿性晚幼粒細胞胞體橢圓形或不規則形，胞體變小。胞質灰色，嗜堿性顆粒分布較密集。胞核圓形、橢圓形、腎形或棒狀，多偏位，染色質粗糙呈粗線狀或塊狀，染成深紫紅色，核質比小，有時核膜被嗜堿性顆粒覆蓋(圖1p)。

嗜堿性粒細胞胞體橢圓形或不規則形，外周血細胞中其數量最少。胞質中嗜堿性顆粒密集分布，有時核膜被顆粒覆。胞核橢圓或不規則形，偏位，染色質濃聚呈粗線狀或塊狀，染成深紫紅色(圖1q)。

圖1 紫紅笛鯛血細胞發生Fig.1 Blood cells in different developmental stages in red snapper L. argentimaculatus

2.1.3 單核細胞系

原單核細胞胞體橢圓形或不規則形，是最大的原血細胞，胞質比其他原血細胞多，胞質嗜堿性。核橢圓形、腎形或不規則形，偏位，染色質呈細網狀，比其他原血細胞分布稀疏，染成紫紅色，核仁可見(圖1r)。

幼單核細胞胞體細胞長橢圓形或不規則形，偶見偽足。胞質比原單核細胞多，嗜堿性減弱，呈淡藍色，內有細小的嗜天青顆粒，有時有空泡。胞核長橢圓形或不規則形狀，多偏位，染色質比原單核細胞粗糙，呈網狀分布，染成紫紅色，核質比較原單核細胞小。核仁不清晰(圖1s)。

單核細胞呈圓形、橢圓形或不規則形，有時有多個偽足，是外周最大的白細胞。胞質多，呈灰藍色，內有細小的藍色嗜天青顆粒，有時有多個空泡。核呈橢圓形、腎形、馬蹄形和不規則形，多偏位，染色質粗糙，呈粗網狀分布，染成紫紅色(圖1t)。

2.1.4 淋巴細胞系

原淋巴細胞胞體圓形或橢圓形，偶有偽足伸出，是最小的原血細胞。胞質嗜堿性染成藍色，胞質少，僅核周圍極薄的一層。胞核圓形或橢圓形，占細胞大部分，核質比大，染色質呈網狀。核仁清晰可見(圖1u)。

幼淋巴細胞胞體細胞圓形或橢圓形，常有偽足。胞質比原淋巴細胞多，嗜堿性減弱呈藍色或灰藍色，有時可見嗜天青顆粒。核圓形或橢圓形，多偏位，染色質呈網狀，染成深紫紅色。核仁模糊(圖1v)。

淋巴細胞分大淋巴細胞和小淋巴細胞。

大淋巴細胞胞體橢圓形或不規則形，有時有多個偽足。胞質灰藍色，量少。胞核圓形、橢圓形或不規則形狀，染色質凝集，呈粗網狀分布，染成深紫紅色(圖1w)。

小淋巴細胞胞體小，橢圓形或不規則形。胞質極少，嗜堿性，染成灰藍色。胞核呈圓形或橢圓形，多偏位，染色質凝集變粗糙，呈粗線或塊狀分布，染成深紫紅色或紫黑色，染色質顏色比大淋巴細胞稍深。偶有嗜天青顆粒(圖1x)。

圖2 外周血涂片Fig.2 The peripheral blood smears 箭頭：嗜酸性粒細胞. Arrowhead: eosinophilic granulocyte.

2.1.5 其他細胞

在頭腎印片中發現少量巨噬細胞和漿細胞。巨噬細胞胞體大，有時有多個偽足胞質中有嗜天青顆粒，有時有多個空泡；核較小，多偏位，染色質著色深(圖3a)。

漿細胞胞體橢圓形或卵圓形，胞體大，核偏于細胞一側，核呈橢圓形或不規則形，染色質粗密呈粗線狀或塊狀分布。細胞質嗜堿性，染為藍色，近細胞核處有一著色較淺的淡染區。胞質中偶有空泡(圖3b)。

血栓細胞胞體細長，長橢圓形、紡錘形或淚滴狀，是最細長的血細胞。細胞核橢圓形、棒狀，占細胞大部分,染成深紫色，居中或稍偏位。胞質呈灰紅色或暗紫紅色(圖3c)。

圖3 其他血細胞Fig.3 The other bloool cells a.巨噬細胞； b.漿細胞； c.血栓細胞. a.macrophage； b.plasmocyte； c.thrombocyte.

2.2 血細胞大小及百分比

紫紅笛鯛的不同發育階段血細胞規格見表1，各細胞系在發育過程中細胞逐漸變小，細胞核逐漸變小，染色質凝集變粗。其中單核細胞系較其他各系細胞都大，淋巴細胞系中小淋巴細胞是最小的細胞，血栓細胞是最細長的細胞。

不同發育階段血細胞百分比見表2。頭腎印片中發現各種原始和未成熟的血細胞，體腎中有原紅細胞、原粒細胞和原單核細胞，脾臟中發現原淋巴細胞，頭腎能分化生成各類型血細胞，體腎能生成紅細胞、單核細胞、淋巴細胞和嗜中性粒細胞，脾臟能生成淋巴細胞。肝臟僅發現成熟血細胞。

表1 紫紅笛鯛不同發育階段血細胞規格Tab.1 Cell and nucleus sizes of various hematopoietic cells in red snapper L. argentimaculatrs μm

(續表1)

細胞系Cell lineage細胞類型Cell type細胞規格 Cell size細胞核規格 Nucleus size長徑Length短徑Width長徑Length短徑Width粒細胞系Granuloid原粒細胞 Granuloblast14.06±0.1312.83±0.6410.68±0.799.59±0.58早幼粒細胞 Progranulocyte13.07±0.1111.87±0.7110.28±0.528.99±0.52中性中幼粒細胞 Neutrophilic myelocyte12.13±0.2211.47±0.459.69±0.638.27±0.89中性晚幼粒細胞 Neutrophilic metagranulocyte10.91±0.6210.14±0.258.67±0.756.53±0.67中性粒細胞 Neutrophilic granulocyte10.91±0.589.76±0.897.03±0.895.46±0.89嗜酸性中幼粒細胞 Eosinophilic myelocyte10.63±0.5610.26±0.468.01±0.346.23±0.37嗜酸性晚幼粒細胞 Eosinophilic metagranulocyte9.46±0.469.23±0.567.02±0.435.62±0.54嗜酸性粒細胞 Eosinophilic granulocyte8.50±0.438.20±0.545.94±0.344.98±0.54嗜堿性中幼粒細胞 Basophilic myelocyte11.59±0.4610.87±0.619.27±0.718.23±0.69嗜堿性晚幼粒細胞 Basophilic metagranulocyte10.63±0.679.97±0.658.22±0.736.45±0.53嗜堿性粒細胞Basophilic granulocyte9.26±0.238.70±0.757.10±0.525.50±0.35淋巴細胞系Lymphoid原淋巴細胞 Lymphoblast11.56±0.4710.99±0.6310.23±0.628.91±0.57幼淋巴細胞 Prolymphocyte10.36±0.419.79±0.628.97±0.888.31±0.61大淋巴細胞 Big lymphocyte8.29±0.467.76±0.667.34±0.646.93±0.62小淋巴細胞 Small lymphocyte6.84±0.386.49±0.556.37±0.445.89±0.51單核細胞系Monocytoid原單核細胞 Monoblast16.43±0.8113.37±1.1512.23±0.889.73±0.81幼單核細胞 Promonocyte14.94±0.4112.81±0.9910.77±1.089.10±0.77單核細胞 Monocyte13.81±0.7911.72±0.788.54±0.837.21±0.53其他Others血栓細胞Thrombocyte11.32±0.783.58±0.327.01±0.343.53±0.26巨嗜細胞 Macrophage17.56±1.5614.02±1.026.12±0.433.02±0.23漿細胞 Plasmocyte16.31±1.3212.32±0.976.36±0.435.36±0.32

表2 紫紅笛鯛4器官中各種血細胞百分比 %Tab.2 The percentages of different blood cells in four organs of red snapper L. argentimaculatus

3 討 論

3.1 紫紅笛鯛血細胞發生規律

血細胞壽命是有限的，在造血誘導微環境的影響和調節下，造血器官中的原始細胞經過一系列形態結構變化，分化生成新生血細胞，不斷補充到外周循環系統中，以維持血細胞動態平衡。不同魚類血細胞發育過程、形態變化并不一致。

紫紅笛鯛紅細胞發育經歷了原紅細胞、早幼紅細胞、中幼紅細胞、晚幼紅細胞和紅細胞4個階段，有些魚類僅觀察到原紅細胞、幼紅細胞和紅細胞3個階段[12-14]。紅細胞發育成熟過程中，胞體逐漸變小，細胞核逐漸變小，染色質由疏松到致密，與草魚(Ctenopharyngodonidellus)[13]、日本黃姑魚(Nibeajaponica)[14]等魚類紅細胞發育變化相一致；而另一些魚類如大彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris)[15]、長鰭裸頰鯛[3]和斑馬魚(Daniorerio)[16]等，幼稚紅細胞比原紅細胞和紅細胞小。

淋巴細胞和單核細胞發育也表現出多樣性。紫紅笛鯛淋巴細胞和單核細胞發育過程與其他魚類相一致，但不同魚類發育過程中胞體變化不一樣。紫紅笛鯛原淋巴細胞發育成熟過程中，胞體逐漸變小，與達布里鱘[2]、長鰭裸頰鯛[3]、日本黃姑魚[14]、斑馬魚[16]等相同；有些魚類淋巴細胞發育過程中幼淋巴細胞最大，如大彈涂魚[15]、南方鲇(Silurusmeridionalis)[17]等。紫紅笛鯛原單核細胞隨著分化成熟，胞體逐漸變小，與達布里鱘[2]單核細胞發育相同；日本黃姑魚[14]、興國紅鯉(Cyprinuscarpiovar.Xingguonensis)[18]等硬骨魚類幼單核細胞最大；大彈涂魚[15]等魚類幼單核細胞最小。

粒細胞的分化在不同魚類中存在差異。紫紅笛鯛原粒細胞發育至早幼粒細胞后，分化為嗜中性中幼粒細胞、嗜堿性中幼粒細胞和嗜酸性中幼粒細胞，與長鰭裸頰鯛[3]、達布里鱘魚[2]等魚類粒細胞發育過程相似；有些魚類早幼粒細胞僅分化為嗜中性中幼粒細胞和嗜酸性中幼粒細胞，如長吻[16]。

3種粒細胞在發育過程中形態變化也不一樣。紫紅笛鯛嗜中性粒細胞在成熟過程中，胞體逐漸變小，與達布里鱘[2]、南方鲇[17]等相同；軍曹魚[4]、長鰭裸頰鯛[3]、斑馬魚[16]等魚類嗜中性粒細胞在發育過程中，胞體先變大后變??；嗜酸性粒細胞在發育過程中胞體逐漸變小，與達布里鱘[2]相似，而長鰭裸頰鯛[3]胞體變化不明顯。嗜堿性粒細胞在分化成熟過程中，胞體逐漸變小，與達布里鱘[2]和長鰭裸頰鯛[3]相似。雖然3種粒細胞胞體變化有差異，但是胞質中顆粒均隨發育而增多。

魚類的血栓細胞不同于哺乳動物的血小板，其發育過程不確定，有人認為它們屬于白細胞譜系[19]，也有人不同意此觀點[20]，魚類血栓細胞來源還不清楚，紫紅笛鯛血栓細胞發育過程不清楚，僅在外周血涂片中觀察到成熟血栓細胞。

頭腎印片中發現少量巨噬細胞，一般認為哺乳動物中巨噬細胞來源于單核細胞，紫紅笛鯛巨噬細胞形態、胞質染色情況與單核細胞很相近，因此推測巨噬細胞也是由單核細胞發育而來。哺乳動物巨噬細胞一般存在結締組織中，頭腎中的觀察巨噬細胞有時單個存在，有時成群分布，這與魚類是變溫動物有關，變溫動物脾、腎造血組織基質中存在含有色素的巨噬細胞[21]。

頭腎印片中還觀察到了漿細胞，哺乳動物漿細胞由B淋巴細胞轉化而來，紫紅笛鯛能觀察到兩種淋巴細胞，即大淋巴細胞和小淋巴細胞，漿細胞究竟由哪種細胞轉化而來，還要做進一步研究。漿細胞一般分布在淋巴結和脾臟中，紫紅笛鯛頭腎中發現少量漿細胞，表明紫紅笛鯛頭腎不僅是造血器官還是免疫器官，這與達布里鱘頭腎轉錄組研究結果相似[22]。

3.2 血細胞發育的場所

不同魚類，具有造血功能的組織器官研究結果不一致。造血器官具有造血誘導微環境，包括造血器官中的基質細胞、基質細胞分泌的細胞外基質和各種造血調節因子組成，造血誘導微環境能誘導原始型血細胞自我更新、增殖、分化，最后形成成熟的血細胞移行到外周循環系統中補充衰老的血細胞。紅鰭笛鯛頭腎、體腎和脾臟中均發現幼稚型血細胞；肝臟中僅有成熟的血細胞，可能肝臟不具有造血誘導微環境，幼稚血細胞不能在肝臟中分化成熟，肝臟不是造血器官，與達布里鱘[2]、長鰭裸頰鯛[3]和日本黃姑魚[14]等魚類相一致；而陳剛等[4]認為軍曹魚肝臟也能生成粒細胞和淋巴細胞。

紫紅笛鯛頭腎、體腎和脾臟均發現幼稚型血細胞，3種器官都是造血相關器官。