5種藥物對異育銀鯽“中科3號”受精卵孵化的影響

陳 斌，樊海平，薛凌展，管 碧，暢孟陽，鐘全福，葉小軍，張偉妮

( 1.福建省淡水水產研究所，福建 福州 350002； 2.福建農林大學 動物科學學院，福建 福州 350000 )

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)“中科3號”因其生長速度快、個體大、抗病力強受到廣大養殖者喜愛[1-2]，成為我國鯽魚(C.auratus)養殖的主要品種之一。水霉病是對淡水養殖魚類危害較大的常見真菌性疾病之一，特別是在魚類人工繁育過程中，鯉魚(Cyprinuscarpio)、鯽魚和黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)等黏性卵感染水霉的比例較高，孵化過程中的死卵及卵膜受損的受精卵最易受到水霉感染，這些卵感染后其內部滋生大量菌絲，蔓延，覆蓋，傳染侵入周圍正常卵，導致胚胎死亡[3-7]。由于鯽魚的繁殖季節為春季，繁殖水溫為18～23 ℃，該水溫范圍正是霉菌極易暴發的環境條件，因此在異育銀鯽“中科3號”苗種繁育過程中，如何有效減少霉菌感染比例及限制霉菌繁殖速度是提高孵化率的關鍵[8]。

生產上主要通過化學藥物來抑制魚卵和仔魚的霉菌生長，常見的藥物有高錳酸鉀、過氧化氫、福爾馬林、鉻化合物(重鉻酸鈉、重鉻酸鉀、三氧化鉻)、硫醚沙星(復合丙烯基二、三硫醚乳液)、氯化鈉、溴硝丙二醇、碘伏(霉菌凈)、五倍子(水霉凈)等。由于這些藥物缺乏高效性，同時存在較高的使用安全風險[9-13]，所以目前科研人員仍在不斷探索開發新的抑殺霉菌藥物，如篩選中草藥抗水霉制劑[14-18]，研究異噻唑啉酮、磺基水楊酸、尼泊金乙酯、二硫氰基甲烷、丙酸鈣、雙乙酸鈉、山梨酸鉀等防霉劑對水霉的抑制效果[19-20]，開展新型殺菌劑立達霉[21]、復方甲霜靈粉(美婷)[22-23]等對魚卵水霉病防治效果的研究與應用。雖然霉菌抑制劑的研發受到廣泛的關注，但適合用于防治魚卵水霉病的有效、安全藥物仍較為匱乏。結合本單位中試基地近幾年抗水霉藥物的應用效果及文獻資料中植物抑霉藥物和食品抑霉劑的普遍好評率，本試驗選擇美婷Ⅱ、霉靈、高錳酸鉀、殺毒礬和納他霉素5種藥物。其中美婷Ⅱ中的活性成分可以直接作用于菌體細胞膜表面的巰基醇，在細胞壁產生特大突起，使細胞壁破裂，菌體死亡，孢子失活；霉靈的主要成分可以滲透霉菌細胞壁，損傷細胞膜并改變其通透性，引起細胞亞微結構變性和細胞壞死，同時可以抑制霉菌芽孢轉變為侵襲性的菌絲；高錳酸鉀通過氧化菌體酶蛋白中的巰基使酶失活，導致菌體發生機能障礙而死亡，殺毒礬可以抑制霉菌RNA聚合酶的合成從而抑制RNA的生物合成，最終達到抑制霉菌的目的；納他霉素可以與真菌的麥角甾醇及其他甾醇基團結合，阻礙麥角甾醇的生物合成，從而使細胞膜畸變，導致滲漏，引起霉菌細胞的死亡。筆者研究了5種藥物對異育銀鯽“中科3號”魚卵水霉病的抑制效果和受精卵孵化的影響，以期尋找控制魚卵水霉的有效安全藥物，為異育銀鯽“中科3號”的苗種繁育提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗用受精卵

以3齡雌性異育銀鯽“中科3號”作為母本，3齡雄性福瑞鯉作為父本進行人工催產，催產水溫控制在18～20 ℃，約16 h后開始人工擠卵、取精。采取干法人工授精，并將受精卵均勻鋪在網片上用于試驗。

1.2 試驗藥物來源

美婷Ⅱ由上海海洋大學研制，主要成分溴硝醇(皮樂寶)、硫酸亞鐵，在有效性和安全性方面比美婷更具優勢；霉靈由上海海洋大學研制，山西爭躍化工藥業有限公司生產，主要成分磺基水楊酸等；高錳酸鉀(99%)，由衡陽市凱信化工試劑有限公司生產；殺毒礬(噁霜·錳鋅)由先正達(蘇州)作物保護有限公司生產，主要成分噁霜靈(8%)、代森錳鋅(56%)；納他霉素(99%)，由浙江多味化工食品有限公司生產。

1.3 試驗方法

試驗容器為5 L塑料桶，每桶裝孵化用水3 L，放于孵化車間。將試驗藥物分別配置1000 mg/L母液，按照設計質量濃度分別添加到各試驗桶中，混勻后剪取5 cm×10 cm的已鋪卵的網片放于桶中進行靜水孵化。每個質量濃度組和對照組均設置3個平行，日換水量為50%，并及時補充50%的試驗藥物，維持藥物質量濃度。每24 h肉眼結合鏡檢觀察受精卵1次，并將網片置于帶水的玻璃平皿中，用手電從下方照射，計數發霉卵數量和未發霉卵數量。試驗期間水溫21～23 ℃，當魚苗進入尾牙期時停止換水補藥，孵化時間約76 h，待完全出膜后計數仔魚數量。

參照各藥物常用質量濃度，按等對數間距設置質量濃度梯度，試驗藥物質量濃度見表1。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 17.0軟件對樣本數據進行單因素方差分析，數據結果表示為平均值±標準差，P<0.05為差異顯著。

長霉率/%=n1/(n1+n2)×100%

孵化率/%=n3/(n1+n2)×100%

式中，n1為長霉卵數量，n2為未長霉卵數量，n3為孵出水花數量。

表1 試驗藥物質量濃度設置 mg/LTab.1 The concentrations of test drugs on mass basis

2 結 果

2.1 美婷Ⅱ對受精卵長霉率和孵化率的影響

試驗結果顯示，美婷Ⅱ可顯著降低異育銀鯽“中科3號”受精卵的長霉率，隨著藥浴質量濃度的升高，長霉率顯著下降(P<0.05)；同一藥浴質量濃度隨浸泡時間的延長，受精卵的長霉率顯著上升(P<0.05)(表2)。孵化效果試驗顯示，6.50 mg/L質量濃度組孵化率略高于4.90 mg/L組(P>0.05)，顯著高于3.69 mg/L組、8.620 mg/L組和11.44 mg/L組及對照組(P<0.05)。

2.2 霉靈對受精卵長霉率和孵化率的影響

霉靈5個質量濃度組中，24 h內均可抑制霉菌生長，隨著時間延長，各質量濃度組受精卵長霉率顯著增加(P<0.05)；在48 h和72 h時，受精卵長霉率隨著霉靈質量濃度的增加逐漸下降趨勢明顯，15 mg/L組的長霉率最低，僅為(1.05±0.1)%和(4.7±0.9)%，現在低于其他組(表3)。48 h時，7.62 mg/L組受精卵長霉率略低于3.87 mg/L組，但差異不顯著(P>0.05)，其余各試驗組間差異顯著(P<0.05)；1.00 mg/L組進入72 h時霉菌感染率明顯上升，長霉率達到(40.3±0.6)%與對照組差異不顯著(P>0.05)，1.97、3.87、7.62 mg/L 3個試驗組受精卵長霉率分別增加了3.8%、7.7%、7.5%，3組間差異不顯著(P>0.05)。

綜合分析，當霉靈質量濃度為1.97 mg/L時，受精卵孵化率最高，長霉率控制在(23.9±2.8)%，當霉靈質量濃度升至15.00 mg/L時，霉菌生長受到限制，長霉率僅為(4.7±0.9)%，但該質量濃度顯著影響受精卵孵化，其孵化率僅為(31.1±1.4)%，顯著低于其他組。

2.3 高錳酸鉀對受精卵長霉率和孵化率的影響

5個質量濃度的高錳酸鉀在24 h內能均能抑制水霉生長，隨浸泡時間的延長，高錳酸鉀抑菌效果逐漸下降，同一質量濃度組72 h受精卵長霉率顯著高于48 h(P<0.05)；而24 h以后，隨著試驗質量濃度的增加，受精卵長霉率逐漸下降，48 h時6.25 mg/L組的長霉率最低，僅為(6.0±0.9)%，顯著低于其他組(P<0.05)；72 h時各組的長霉率均有所增加，但仍低于對照組(P<0.05)，其中6.25 mg/L組的長霉率相對于48 h上升顯著(P<0.05)，達(29.0±1.4)%。孵化效果試驗顯示，各試驗組的孵化率均高于對照組，其中2.50 mg/L組的孵化率最高，達到(54.0±4.0)%，顯著高于其他組(P<0.05)(表4)。

表2 美婷Ⅱ對受精卵長霉率和孵化率試驗結果Tab.2 The incidence of mildew and hatching rate of fertilized eggs exposed to Mei Ting Ⅱ

注：同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；同行數據肩標不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同大寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；下同.

Note: means with different letters in the same column are significant difference (P<0.05), means with the same letters are not significant difference (P>0.05); means with different capital letters in the same line are significant difference (P<0.05), with the same capital letter are not significant difference (P>0.05)； et sequentia.

表3 霉靈對受精卵長霉率和孵化率試驗結果Tab.3 The incidence of mildew rate and hatching rate of fertilized eggs exposed to Mei Ling

表4 高錳酸鉀對受精卵長霉率和孵化率試驗結果Tab.4 The incidence of mildew rate and hatching rate of fertilized eggs exposed to potassium permanganate

2.4 納他霉素對受精卵長霉率和孵化率影響

當納他霉素的質量濃度為1.5～5.00 mg/L時，24 h內霉菌抑制效果顯著，霉菌感率為0。1.00 mg/L組也能有效抑制水霉生長，長霉率顯著低于對照組(P<0.05)；48 h和72 h，高于1.50 mg/L的各質量濃度組能有效抑制水霉生長，長霉率顯著低于1.00 mg/L組和對照組(P<0.05)，但72 h受精卵長霉率與48 h差異不顯著(P>0.05)，而1.00 mg/L組和對照組72 h受精卵長霉率顯著高于48 h(P<0.05)，且1.00 mg/L組48 h和72 h的受精卵長霉率與對照組無顯著差異(P>0.05)(表5)。

孵化率以1.50 mg/L組最高，顯著高于其他試驗質量濃度組和對照組(P<0.05)，其次為2.24 mg/L組，顯著高于1.00、3.34、5.00 mg/L組和對照組(P<0.05)，而1.00、3.34、5.00 mg/L組和對照組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.5 殺毒礬對受精卵長霉率和孵化率影響

孵化24 h時，0.33 mg/L組和0.50 mg/L組的水霉抑制效果顯著，受精卵均未感染霉菌。48 h時，各組的霉菌感染率均出現了顯著增加，0.33 mg/L組和0.50 mg/L組受精卵長霉率雖顯著低于其他質量濃度組和對照組(P<0.05)，但是其長霉率也分別達到了(15.5±1.7)%和(14.6±0.8)%，差異不顯著(P>0.05)；72 h后，各組受精卵的霉菌感染率進一步提高，其中0.10 mg/L組的長霉率高達(50.0±0.7)%，顯著高于其他各組(P<0.05)，0.50 mg/L的長霉率最低，僅為(23.4±1.0)%，顯著低于其他組(P<0.05)。孵化效果試驗顯示，各試驗質量濃度組的受精卵孵化率均顯著低于對照組(P<0.05)，其中以0.15 mg/L組孵化率較高，孵化率為(36.1±2.2)%，略低于對照組(P<0.05)，0.50 mg/L組孵化率最低，僅為(9.8±1.0)%，顯著低于對照組(P<0.05)(表6)。

表5 納他霉素對受精卵長霉率和孵化率試驗結果Tab.5 The incidence of mildew and hatching rate of fertilized eggs exposed toy Natamycin

表6 殺毒礬對受精卵長霉率和孵化率試驗結果Tab.6 The incidence of mildew and hatching rate of fertilized eggs exposed to oxadixyl mancozeb

3 討 論

3.1 不同藥物對受精卵水霉控制作用

水霉病是魚卵孵化過程中的一種常見病，常給苗種生產造成較大損失。多年來國內外不斷進行抗水霉有效藥物的篩選和開發，主要以消毒劑、防霉防腐劑和中草藥制劑為主。雖然這些藥物對水霉均有一定的抑制作用[19-27]，但有些藥物的有效抑制質量濃度遠超過安全質量濃度，不適合應用于生產；有些藥物如美婷、過氧化氫等療效較好，但因使用成本較高而無法推廣應用[13-28]。本試驗選擇了常用消毒劑高錳酸鉀，農用殺菌劑殺毒礬，食品防腐劑納他霉素，漁藥美婷Ⅱ和霉靈等5種藥物用于異育銀鯽“中科3號”受精卵孵化期間水霉的抑制試驗及其對孵化率的影響研究。其中殺毒礬是農藥類新型混合殺菌劑，對一些植物真菌性病害有較高的防治效果[29]。納他霉素是一種多烯類抗真菌的生物防腐劑，能夠抑制絲狀真菌的生長，廣泛用于食品防腐和醫學上的應用[30-31]。高猛酸鉀作為最強的氧化劑之一，常被應用于醫療、化工、動物養殖、苗木培育等各個領域，可以防治水生動物的水霉病和腐皮病[32-33]，還對葡萄的霉斑病有一定的治療效果[34]。

試驗結果顯示，5種藥物對異育銀鯽“中科3號”受精卵的水霉均一定的抑制作用，其抑霉率為美婷Ⅱ>霉靈>高錳酸鉀、納他霉素和殺毒礬。美婷Ⅱ和霉靈均為上海海洋大學研制，美婷Ⅱ主要成份溴硝醇(皮樂寶)，為新型化妝品防腐劑。有學者探討了溴硝醇對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、比目魚(Hippolossushippolpssus)、大西洋鱈(Gadusmoehua)、黑線鱈(Melanogrammusaeglefinus)等魚卵水霉的抑制效果，均證實采用短時間浸浴的方法能夠有效抑制水霉滋生，提高受精卵的孵化率[35-38]，其抑制霉菌的效果在本試驗中進一步證實，其優點是抑制霉菌效果好，孵化率高，其缺點是使用質量濃度高，成本高。霉靈主要成分為磺基水楊酸，具有防霉殺菌作用，磺基水楊酸對水霉具有較好的體外抗菌效果[19]，其抑制霉菌的效果也同樣在本試驗中得以體現，但是相對于美婷Ⅱ，霉靈的抑菌效果更差一些，其優點是使用質量濃度低且藥物價格低，能夠節約生產成本。

3.2 藥物質量濃度及作用時間對受精卵長霉率影響

藥物的使用質量濃度和作用時間對魚卵水霉的防治效果存在明顯的差異。隨著藥物浸泡質量濃度的增加，受精卵長霉率逐漸降低；隨著浸浴時間的延長，受精卵長霉率逐漸升高。霉靈、高錳酸鉀、納他霉素和殺毒礬低質量濃度組對魚卵寄生水霉沒有抑制效果，而殺毒礬低質量濃度組72 h的受精卵長霉率反而顯著高于對照組，可能與殺毒礬對異育銀鯽“中科3號”受精卵毒性較大，造成魚卵死亡數量較多，而受傷或死亡的魚卵更易滋生霉菌[3]，導致受精卵長霉率進一步升高；而納他霉素2.24 mg/L以上質量濃度組72 h的受精卵長霉率則略低于48 h，說明該藥物在水中結構穩定、藥效長。亦有研究結果表明，納他霉素是一種高效、專一的抗真菌抑制劑，具有較好的穩定性，可專一性地與霉菌細胞膜中的麥角固醇結合，提高對霉菌的持續抑制作用[39-40]，與該試驗結果完全相符。因此納他霉素在水霉抑制方面具有一定開發應用前景。

3.3 藥物對受精卵孵化率的影響

水霉寄生是嚴重影響淡水魚受精卵孵化的一個主要因素，尤其是在水溫較低的早春季節，為提高淡水魚受精卵孵化率，生產上通常采用一些藥物來防治受精卵的水霉病，并以受精卵孵化率或出苗率來評估藥物的實際防治效果。除了殺毒礬外，一定質量濃度的美婷Ⅱ、霉靈、高錳酸鉀、納他霉素均能顯著提高異育銀鯽“中科3號”受精卵孵化率，說明美婷Ⅱ、霉靈、高錳酸鉀、納他霉素對異育銀鯽“中科3號”受精卵的毒副作用較小，而殺毒礬各試驗質量濃度組受精卵的孵化率均低于對照組，說明殺毒礬對異育銀鯽“中科3號”受精卵的毒副作用較大，不適合應用于受精卵孵化。

同一藥物不同質量濃度對受精卵孵化率差異極大，5種試驗藥物的受精卵孵化率均為中質量濃度組>低質量濃度組>高質量濃度組，說明試驗藥物高于適宜質量濃度均對受精卵產生毒性作用，影響孵化率；同樣，低質量濃度藥物未能有效控制魚卵水霉繁殖，導致受精卵孵化率下降。因此，各種防霉藥物在應用到孵化生產之前，一定要根據試驗結果得出最適使用量，才能同時發揮藥物安全和高效的特性。

試驗結果顯示，美婷Ⅱ對異育銀鯽“中科3號”受精卵適宜使用質量濃度為4.90～6.50 mg/L，適合長時間浸浴，對水霉的抑制效果良好且孵化率較高，這與夏文偉等[23-24]的研究結果基本一致，而孫鵬等[35]建議使用高質量濃度溴硝醇浸泡15 min短時間使用；霉靈對異育銀鯽“中科3號”受精卵的適宜使用質量濃度為1.97～3.87 mg/L，與該漁藥的建議使用劑量說明基本一致；高錳酸鉀對異育銀鯽“中科3號”24 h內浸泡效果顯著，受精卵的適宜使用質量濃度為2.50 mg/L，遠低于張繁榮等[32]用15.0 mg/L的高錳酸鉀溶液每隔3 d浸洗1次，每次浸洗時間10 min的使用方法；納他霉素對異育銀鯽“中科3號”受精卵的適宜使用質量濃度為1.50 mg/L，孵化率與美婷Ⅱ和霉靈無顯著差異(P>0.05)，具有高效、無毒和低殘留特性[39]，具有良好的開發應用前景；而殺毒鞏對水霉的抑制效果不甚理想，較強的毒副作用嚴重影響了“中科三號”受精卵的孵化率，不適合應用于魚卵的孵化生產。